Белки как инфекционные агенты

Обновлено: 24.04.2024

Сравнение с ходячими мертвецами напрашивается. Как и они, прионы в буквальном смысле слова разрушают мозг, превращая человека сперва в овощ, а затем — в труп. Как зомби из людей, так и они появляются из самых обычных белков. Их крайне сложно уничтожить, зато сами они смертельны в ста процентах случаев. Впрочем, трудно было бы ожидать иного от инфекционных агентов, которых вообще нельзя назвать живыми. Несколько столетий они ускользали от ученых — и даже потом в их существование поверили далеко не сразу. А теперь в них иногда видят даже источник жизни.

Овцы и людоеды

Инкубационный период скрейпи может растянуться на годы. Но как только у животного начинают проявляться первые симптомы, можно быть уверенным, что через несколько недель наступит смерть

В одном и том же 1920 году, но независимо друг от друга, Ганс Крейтцфельдт и Альфонс Якоб описали неизлечимое и неумолимое поражение нервной системы человека. Возникая по неизвестной причине, обычно в пожилом возрасте, болезнь часто начиналась проблемами со сном и ослаблением когнитивных функций, развивалась потерей координации движений и деменцией, а несколько лет спустя венчалась параличом и функциональными нарушениями, окончательно несовместимыми с жизнью. Ткани мозга снова напоминали губку — и снова никаких следов возбудителя.

Коровы и радиация

Сходство болезней (необычно долгий инкубационный период и неизбежность летального исхода, заразность и, конечно, характерные перерождения нервной ткани мозга) позволило предположить у них и общую причину и объединить в группу трансмиссивных губчатых энцефалопатий.

Явление зомби

Зомби по наследству

Обломки PrP Sc могут попадать в организм и извне, через биологические жидкости и ткани больных животных, во время некоторых медицинских процедур и просто с пищей. Большинство переродившихся белковых частиц, видимо, разрушается в желудочно-кишечном тракте, но некоторым удается добраться к месту действия, преодолев даже гемато-энцефалический барьер, стоящий на границе между кровью и тканями мозга. Способность PrP Sc проходить сквозь эту весьма надежную преграду остается одной из главных его загадок.

Добрые монстры

На срезе участка мозга пациента с прионной болезнью амилоидные скопления белка видны как белые бляшки

Новость

Путь прионов

Автор

Редакторы

Спонсор конкурса — дальновидная компания Thermo Fisher Scientific.

Биологическая сущность прионов

Рисунок 1. Метафора нейродегенеративного поражения мозга — это губка, в которую превращается нервная ткань в результате массовой гибели нейронов.

И тогда происходит удивительное событие: нормальные молекулы белка, контактируя с патологическими, сами превращаются в них, изменяя свою пространственную структуру (механизм трансформации остаётся загадкой и по сей день) [1]. Таким образом прион, как самый настоящий инфекционный агент, заражает нормальные молекулы, запуская цепную реакцию, разрушительную для клетки.

Некоторые сведения о прионах

Условия возникновения заболеваний

Условия возникновения прионовых болезней уникальны. Они могут формироваться по трём сценариям: как инфекционные, спорадические и наследственные поражения. В последнем варианте главную роль играет генетическая предрасположенность [2].

В последнее десятилетие интерес к этой теме возобновился в связи с возможностью развития диагностики и эффективной терапии [5]. Появилось множество различных объяснений для возрастных нейродегенеративных болезней, — например, окислительная модификация ДНК, липидов и/или белков; соматические мутации; измененный врождённый иммунитет; экзогенные токсины; несоответствия ДНК—РНК; нарушение работы шаперонов; отсутствие одного из аллелей гена [5]. Альтернативным комплексным разъяснением служит то, что различные группы белков могут формировать прионы. Несмотря на то, что небольшое количество прионов может быть удалено посредством путей белковой деградации, их чрезмерное накопление с течением времени позволяет прионам самостоятельно распространяться в организме (рис. 2), что приводит к нарушению деятельности центральной нервной системы [5].

Группы риска прионных заболеваний

Вот кого прионные заболевания могут настичь с наибольшей вероятностью:

работники пищевой промышленности;
ветеринары;
патологоанатомы;
хирурги;
пациенты трансплантолога;
каннибалы;
лица, в семье которых были замечены синдромы Герстманна—Штрейслера—Шейнклера или фатальной инсомнии.

Лабораторная диагностика и лечение

Диагностика базируется на внутримозговом заражении мышат или хомяков, у которых медленно (до 150 дней) развивается соответствующее заболевание, если пациент был болен [2]. Часто проводится гистологическое исследование головного мозга погибших животных [2].

К сожалению, до настоящего времени еще не разработаны эффективные методы лечения прионовых болезней, хотя попытки предотвратить конформационный переход нормального белка в аномальный производятся. Поэтому самым надёжным способом предупреждения развития инфекционных форм является профилактика [2].

Перспективы

По-видимому, интерес к прионам не угаснет до тех пор, пока предположения на их счёт полностью не подтвердятся и не будут найдены эффективные способы лечения прионных заболеваний. В статье [6] говорится о необходимости современного исследования, которое требует тщательного рассмотрения чужеродных прионов в экстраневрональных тканях.

В качестве модельных объектов авторы использовали мышей: две линии, которые трансгенно экспрессировали овечий прионный белок, и одну линию, которая экспрессировала человеческий прионный белок (рис. 3). Задачей было сравнить эффективность межвидовой передачи инфекции посредством тканей мозга и селезёнки. Внутримозговое заражение чужеродным прионным белком выражалось в отсутствии или небольшом количестве инфекционного агента в мозгах этих мышей. Однако инфекционные чужеродные прионы обнаруживались в селезёнке на более ранних этапах заражения в сравнении с моментом, когда были использованы нейротропные прионы, тем самым определяя, что лимфатическая ткань может быть более пермиссивной к распространению чужеродных прионов по сравнению с мозгом.

Рисунок 3. Способность приона хомяков Sc237 заражать и передаваться при введении в мозг или селезенку трансгенным мышам, имеющим прионный белок PrP овцы (tg338; белые мыши) или человека (tg7; серые мыши). Число заболевших/инъецированных мышей показано в скобках; ниже приведено среднее время жизни (в днях).

Чем вызвана эта предпочтительная репликация прионов в лимфатических тканях, пока неизвестно. Однако полученные данные показывают, что человек может быть более чувствительным к чужеродным прионам, чем предполагалось ранее на основании присутствия прионов в мозгу, и по этой причине бессимптомный переносчик прионной болезни может быть не распознан. Это ещё раз подтверждает, что такая могущественная биомолекула как прион таит в себе немало загадок, раскрытие которых, возможно, поможет в понимании ряда неразрешимых проблем человечества.

История

Гистологический препарат головного мозга, на котором видны микрополости

Как уже было сказано выше, основы знаний о прионах заложил Стенли Прузинер. Немного из его биографии. Родился в США в 1942 году. Его предки - эмигранты из российской империи, еврейского происхождения, вынужденные покинуть страну из-за еврейских погромов. Сам Стенли Прузинер в 1968 г. закончил Университет Пенсильвании и работал ординатором-неврологом в Медицинской школе Калифорнийского университета (Сан-Франциско). В 1970 впервые встретился с болезнью Крейтцфельдта — Якоба. У пациента, находившегося на лечении у Прузинера, никак не выявлялся возбудитель. Плотно занявшись этим исследованием, невролог обратился к трудам другого врача – Сиггурдсона, выявившего определенные закономерности у непонятных на тот момент болезней.

Такими закономерностями стали:

необычно продолжительный (месяцы и годы) инкубационный период;
медленно прогрессирующий характер течения;
необычность поражения органов и тканей;
неизбежность смертельного исхода.

Что же такое прионы и каков их механизм действия на организм (современные представления)?

На самом деле в организме человека и многих других живых существ есть белки PrPC. По-русски – нормальная форма прионных белков (открыты были после исследований Сиггурдсона, поэтому такая странность в название). Известна его длина, последовательность аминокислот, вторичная структура. Важно знать, что конечная структура состоит из трёх α-спиралей и двухцепочечного антипараллельного β-листа. Обладают интересным свойством, а именно осаждаются высокоскоростным центрифугированием, что является стандартным тестом на наличие прионов. Есть данные, что PrP играет важную роль в прикреплении клеток, передаче внутриклеточных сигналов, а потому может быть вовлечён в коммуникацию клеток мозга. Тем не менее, функции PrP исследованы недостаточно.

(a) норма (b) патология

Считается, что прионное заболевание может быть приобретено 3 путями: в случае прямого заражения, наследственно или спорадически (спонтанно) или их комбинациями. Спорадическая (то есть спонтанная) прионная болезнь возникает в популяции у случайной особи. Таков, например, классический вариант болезни Крейтцфельдта — Якоба. Существуют две основные гипотезы относительно спонтанного появления прионных болезней. Согласно первой из них спонтанное изменение происходит в самом доселе нормальном белке в мозге, то есть имеет место посттрансляционная модификация. Альтернативная гипотеза гласит, что одна или несколько клеток организма в какой-то момент претерпевают соматическую мутацию (то есть, не передающуюся наследственно) и начинают производить дефектный белок PrPSc. Как бы то ни было, конкретный механизм спонтанного возникновения прионных болезней неизвестен. Вторая – заражение. По данным современных исследований, основной путь приобретения прионных заболеваний — поедание заражённой пищи. Считается, что прионы могут оставаться в окружающей среде в останках мёртвых животных, а также присутствуют в моче, слюне и других жидкостях и тканях тела (кровь, ликвор). Из-за этого заражение прионами может произойти и в ходе пользования нестерильными хирургическими инструментами. Это усложняет стерилизацию хирургических инструментов или устройств на скотобойне. Прионы в большинстве своём устойчивы к протеазам, высокой температуре, радиации и хранению в формалине, хотя эти меры и снижают их способность к заражению. Эффективная дезинфекция против прионов должна включать гидролиз или повреждение/разрушение их третичной структуры. Это можно достичь обработкой хлорной известью, гидроксидом натрия и сильнокислыми моющими веществами. Пребывание в течение 18 минут при температуре 134 °C в герметичном паровом автоклаве не может деактивировать прионы. В качестве основного современного метода для деактивации и денатурации прионов в настоящее время изучается озоновая стерилизация. Ренатурация полностью денатурированного приона до инфективного состояния зафиксирована не была, однако для частично денатурированных прионов в некоторых искусственных условиях это возможно. Еще стоит помнить, что эти белки могут долго сохраняться в почве за счёт связывания с глиной и другими почвенными минералами. Не впадайте в паранойю, но теоретически они могут быть повсюду. В 2011 году было сообщено об открытии прионов, передающихся по воздуху в частицах аэрозоля (то есть воздушно-капельным путём). Также в 2011 году было опубликовано предварительное доказательство того, что прионы могут передаваться с получаемым из мочи человеческим менопаузальным гонадотропином, применяемым для лечения бесплодия. Теоретически с помощью всего одного больного животного с прионной болезнью, можно уничтожать целые нации и страны, просто добавляя его костную муку в кормовые добавки и продавая их в нужное государство. Сходная ситуация произошла в конце 80-х годов в Британии (эпидемия коровьего бешенства). Тогда, скорее всего по незнанию (а не по злому умыслу) произошел вышеуказанный процесс, унесший жизни около 200 человек (на 2009 год) и 179 тыс. голов крупного рогатого скота.

Клиника

Поговорим о болезнях и клинических проявлениях. Теоретически может возникать у всех живых существ, обладающих PrPc Вот некоторые примеры. У овец и коз, как это уже говорилось выше, главное проявление - это скрейпи. Для коров характерно коровье бешенство (губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота) У норок- Трансмиссивная энцефалопатия норок. И так далее. Зафиксированы проявления заболеваний у кошек, диких парнокопытных, страусов. Но нас интересуют болезни человека.

Болезнь Крейтцфельдта — Якоба. Код по МКБ-10 A81.0; F02.1. Код А соответствует инфекционным болезням (А81 – инфекционные болезни нервной системы). Код F – психические расстройства, F02 – деменции.

Темно зеленый распространение К-Я

Светло зеленый - коровьего бешенства

Основные клинические критерии для постановки диагноза:

Выделяют несколько клинических форм:

Спонтанная — классическая (sCJD) Согласно современным представлениям (прионной теории), прионы при этой форме заболевания возникают в мозге спонтанно, без какой-либо видимой внешней причины. Болезнь обычно поражает людей в возрасте старше 50 лет и проявляется с вероятностью 1-2 случая на миллион жителей. Вначале проявляется в форме кратких потерь памяти, изменениями настроения, потерей интереса к происходящему вокруг. Далее симптомы деменции прогрессируют со всеми вытекающими последствиями.

Наследственная (fCJD) Болезнь возникает в семьях, где наследуется повреждение гена для прионового белка. Дефектный прионовый белок является намного более подверженным спонтанному превращению в прион. Признаки и ход болезни подобны классической форме.

Ятрогенная (1CJD) Болезнь обусловлена непреднамеренным внесением прионов в тело пациента при медицинском вмешательстве. Источником прионов ранее были некоторые лекарства, инструменты или мозговые оболочки, которые забирались у мертвых людей и использовались для закрытия раны при операциях на мозге. Признаки и ход болезни подобны классической форме. Новый вариант (nvCJD) Болезнь появилась впервые в 1995 году в Великобритании и с того момента от нее умерло не более 100 человек. Вероятнее всего, что они заразились мясными продуктами, содержащими бычьи прионы.

психические расстройства и сенсорные нарушения,
характерны глобальные когнитивные нарушения и атаксия.
описано несколько случаев заболевания, дебютировавшего с корковой слепоты (вариант Heidenhain).
эписиндром представлен также миоклоническими припадками.
мозжечковая симптоматика выявляется в 100 %.

Пациент страдает от всё более тяжёлой бессонницы, панических атак и фобий. Эта стадия длится в среднем 4 месяца.
Панические атаки становятся серьёзной проблемой, и к ним присоединяются галлюцинации. Эта стадия длится в среднем 5 месяцев.
Полная неспособность спать, сопровождаемая быстрой потерей веса. Эта стадия длится в среднем 3 месяца.
Пациент перестаёт говорить и не реагирует на окружающее. Это последняя стадия болезни, длящаяся в среднем 6 месяцев, после чего пациент умирает.

Куру, почти не встречается в настоящее время, в связи с искоренением каннибализма. Интересно, что в 2009 году американские учёные сделали неожиданное открытие: некоторые члены племени форе, благодаря появившемуся у них в сравнительно недавнем времени новому полиморфизму гена PRNP, имеют врождённый иммунитет к куру.

В настоящее время нет ни одного средства останавливающего или тормозящего развитие прионных болезней.

Обзор

Автор

Редактор

Обратите внимание!

Спонсоры конкурса: Лаборатория биотехнологических исследований 3D Bioprinting Solutions и Студия научной графики, анимации и моделирования Visual Science.

Прионы vs. амилоиды

Начиная разговор о прионах и амилоидах, я думаю, следует внести ясность в терминологию. Итак, согласно современным традициям употребления этого термина, прионы — это самовоспроизводящиеся белковые изоформы, обладающие свойством инфекционности: способностью передаваться от клетки к клетке. На самом деле, под это определение попадают белковые изоформы разной природы, однако объединяет их одно: все они проявляются как некие черты фенотипа — иногда губительные для клеток, иногда, наоборот, полезные — которые могут распространяться между клетками без участия закодированной с помощью ДНК/РНК наследственной информации.

Амилоиды — особый способ укладки белка, при котором отдельные, амилоидогенные, участки образуют фибриллярные полимеры с кросс-β-структурой (то есть, состоящие из β-слоев, направленных перпендикулярно оси фибриллы) (рис. 1) [1]. Отличить амилоидные полимеры от других форм белковой агрегации (например, аморфных белковых агрегатов, образующихся при тепловом шоке) можно по нескольким признакам, помимо уже упомянутого:

Рисунок 1. Фибриллы Aβ-амилоида под электронным микроскопом (a) и схематическое изображение параллельной и антипараллельной кросс-β-структур амилоидной фибриллы (б). Рисунок из статьи [1].

Способность тех или иных участков белка укладываться в амилоид зависит от их аминокислотного состава и последовательности. Известны случаи, когда мутации в амилоидном домене белка существенно уменьшали его склонность переходить в фибриллярную форму [2].

Рисунок 2. Амилоидные отложения по периферии клеток, наблюдаемые по двойному лучепреломлению при окрашивании красителем конго красным. Рисунок с сайта Leaders in Pharmaceutical Business Intelligence.

Большинство известных на данный момент прионов имеют амилоидную природу: амилоидные фибриллы являются тем самым инфекционным агентом, который переносится от клетки к клетке и определяет их прионный фенотип. Однако известны и другие случаи самокопирующихся белковых состояний, с амилоидностью никак не связанные. Например, дрожжевой прион β представляет собой цепной процесс активации протеиназ: активированная форма протеиназы Prb1 активирует другие молекулы Prb1, откусывая у них N-концевой пептид (блокирующий их протеиназную активность). Те, в свою очередь, принимаются за следующую порцию еще не активных протеиназ. и так далее. Выходит, не только бешеные животные могут передавать свое состояние другим с помощью укусов.

Самые известные, и наиболее пугающие общественность прионы — инфекционные агенты, вызывающие и передающие болезни Крейцфельдта-Якоба, куру, скрейпи овец и некоторые другие — представляют собой ни что иное, как проявления различных штаммовых вариантов амилоида, состоящего из одного и того же белка (про открытие прионов белка PrP, а также про разработку прионной концепции можно прочитать в недавней статье на биомолекуле [3]). Мембранный белок PrP, который есть у всех млекопитающих, а также у птиц и у рыб, в норме выполняет в клетках полезные функции*. При патологии PrP сворачивается в амилоидную форму, которая вызывает гибель нейронов и заражает другие клетки (а иногда и другие организмы). Что интересно, PrP может укладываться в амилоид по-разному, образуя фибриллы с различными конформациями — и эти конформации, по-разному влияя на взаимодействие амилоида с его клеточным окружением, лежат в основе разных прионных штаммов. В конечном счете, разница в конформациях амилоидов приводит к разному течению вызываемых ими прионных заболеваний.

* — Которые в некоторых статьях не очень грамотно приписывают приону — в то время, как выполняет их как раз-таки неприонная форма белка — Прим. авт.

Амилоиды нейродегенеративных заболеваний человека

Прионы и амилоиды дрожжей

Помимо приона [PSI+], белок Sup35 может образовать также и ненаследуемый амилоид, который был впервые описан 10 лет назад в нашей лаборатории [12]. Мы знаем, что этот амилоид массово образуется в клетках при сверхпродукции белка Sup35, что он не может стабильно поддерживаться в клеточной линии — однако не знаем, в чем заключается его отличие от прионных амилоидов из этого же самого белка. Почему одни амилоиды хорошо наследуются, а другие — нет, возникая в каждой дрожжевой клетке автономно? Многие сопутствующие обстоятельства подталкивали нас к мысли, что ненаследуемый амилоид должен иметь какую-то особую конформацию и, по всей видимости, особенно большой размер амилоидного ядра. Что делает этот амилоид еще более слабым полимеризатором растворимого Sup35, чем даже самый наислабейший штамм приона [PSI+]. К проверке этой рабочей гипотезы я и приступил в своем исследовании, которое проводил под руководством доктора биологических наук Виталия Владимировича Кушнирова.

Изучение ненаследуемого амилоида Sup35

Рисунок 6. Схема эксперимента по определению размера амилоидного ядра фибриллы

Изучая прионы дрожжей, ученые вынужденно применяют этот подход в основном к фибриллам, выращенным в пробирке. Мы же, однако, сумели преодолеть ряд технических ограничений метода и применить его к амилоидным полимерам, выделенным непосредственно из дрожжей (ex vivo). Сравнив размер амилоидных ядер в препаратах с ненаследуемым амилоидом, а также с разными штаммовыми вариантами приона, мы были вынуждены отбросить первоначальную гипотезу (рис. 7).

Рисунок 7. Сравнение размеров амилоидного ядра ненаследуемого амилоида белка Sup35 и вариантов приона [PSI+]. Линии над (и под) последовательностью амилоидогенного домена Sup35 обозначают размеры участков белка, уложенных в амилоидное ядро.

Рисунок 8. Форма макроскопической агрегации амилоида — один из способов наблюдать изменение его свойств под действием факторов окружающей среды. В дрожжах, выращенных в жидкой среде с нормальным (а) и минимальным (б) количеством аденина, паттерны агрегации заметно отличаются. Циановым цветом светятся амилоидные агрегаты из белка Sup35-GFP, желто-зеленый цвет — автофлуоресценция клеток.

Заключение и перспективы

Читайте также: