Бруцеллез наставление по диагностике бруцеллеза животных
Обновлено: 17.04.2024
Хронический бруцеллез – зоонозное инфекционно-аллергическое заболевание, вызываемое бактериями рода Brucella, протекающее свыше шести месяцев, характеризуется выраженным полиморфизмом клинических проявлений с преимущественным поражением опорно-двигательной, нервной, мочеполовой и др. систем, склонностью к рецидивирующему течению.
I. ВВОДНАЯ ЧАСТЬ
Название протокола: Хронический бруцеллез
Код протокола:
Код МКБ X:
А23 – Бруцеллез
А23.0 – Бруцеллез, вызванный Brucella melitensis
А23.1 – Бруцеллез, вызванный Brucella abortus
A23.2 - Бруцеллез, вызванный Brucella suis
A23.3 - Бруцеллез, вызванный Brucella canis
A23.8 - Другие формы бруцеллеза
A23.9 - Бруцеллез неуточненный
Дата разработки протокола: 22.04.2013 г.
Сокращения, используемые в протоколе:
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота
ИФА– иммуноферментный анализ
КТ – компьютерная томография
МРТ – магнитно-резонансная томография
ПЦР – полимеразно цепная реакция
РСК – реакция связывания комплемента
РЭГ - реоэнцефалография
СОЭ – скорость оседания эритроцитов
УЗДГ – ультразвуковая допплерография
УЗИ – ультразвуковое исследование
ЦНС – центральная нервная система
ЭКГ - электрокардиография
IgA – иммуноглобулины класса А
IgG – иммуноглобулины класса G
IgM – иммуноглобулины класса М
Категория пациентов: взрослые больные поликлиник и инфекционных стационаров/отделений, многопрофильных и специализированных стационаров, беременные, роженицы и родильницы родильных домов/ перинатальных центров.
Пользователи протокола:
- ВОП ПМСП, врач-терапевт ПМСП, врач-инфекционист ПМСП, врач-невролог ПМСП;
- врач-инфекционист инфекционного стационара/отделения, врач-терапевт, врач-невролог многопрофильных и специализированных стационаров, врач акушер-гинеколог родильных домов/перинатальных центров.
Классификация
Клиническая классификация (Н.Д.Беклемишев (1957), дополнена К.Б.Курмановой, А.К.Дуйсеновой (2002)
Хронический бруцеллез - длительность заболевания свыше 6 месяцев.
Различают 2 формы:
- первично-хронический бруцеллез
- вторично-хронический бруцеллез
Стадии хронического бруцеллеза - определяют по степени нарушения трудоспособности:
- стадия компенсации – наличие симптомов бруцеллеза, не нарушающих трудоспособности больного;
- стадия субкомпенсации – наличие симптомов снижающих трудоспособности больного;
- стадия декомпенсации – наличие симптомов, делающих больного нетрудоспособным.
Органопатология
Опорно-двигательная система: артрит, пери- и параартрит, сакроилеит, остеоартрит, артроз, спондилоартрит, спондилит, спондилодисцит, спондилез, бурсит, тендовагинит фиброзит, периостит, остеохондроз и т.д.
Нервная система:
Центральная нервная система (менингит, энцефалит, миелит, васкулит сосудов головного мозга, вертебро-базилярная недостаточность, гипертензионный, диэнцефальный, гипоталамический синдромы и т.д.).
Периферическая нервная система (неврит, радикулит, плексит, солярит, корешковый синдром и т.д.).
Вегетативная нервная система (вегето-сосудистая дистония, нарушения микроцикуляции, атония кишечника и т.д.).
Психобруцеллез (астеноневротический синдром, депрессивный синдром, галлюциноз и т.д.).
Органы чувств (невриты зрительного и слухового нерва, увеонейрохориоретинит и т.д.).
Сердечнососудистая система (миокардит, перикардит, эндокардит, нарушения ритма и проводимости, миокардиодистрофия, флебит, тромбофлебит и т.д.).
Половая система (орхит, орхоэпидидимит, сальпингооофорит, нарушения менструального цикла, бесплодие и т.д.).
Мочевыделительная система (гломерулонефрит, мочевой синдром и т.д.).
Дыхательная система (бронхит, пневмония – редко).
Пищеварительная система (гепатит, холецистит, гастрит – редко).
Диагностика
ΙΙ. Методы, подходы и процедуры диагностики и лечения
Перечень диагностических мероприятий
Основные:
1. Общий анализ крови
2. Общий анализ мочи
3. Кровь на микрореакцию (сифилис)
4. Микроскопия кала для обнаружения яиц гельминтов
5. Исследование крови в реакции Хеддлсона-Райта
Дополнительные:
1. Исследование крови в РСК с бруцеллезными антигенами
2. ИФА крови для обнаружения Ig классов М, А, G к бруцеллам
3. ПЦР крови для обнаружения ДНК бруцелл
4. Бактериологическое исследование крови для выделения бруцелл
5. Биохимический анализ крови (общий билирубин, прямой билирубин, общий белок, белковые фракции, аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза, ревматоидный фактор, С-реактивный белок).
6. Рентгенологическое исследование опорно-двигательного аппарата.
7. МРТ при поражении позвоночника.
8. КТ головного мозга при нейробруцеллезе.
9. РЭГ или УЗДГ сосудов головного мозга.
10. ЭКГ.
11. УЗИ органов брюшной полости и малого таза.
12. Консультации специалистов: невропатолог; кардиолог; уролог; офтальмолог; фтизиоостеолог; нейрохирург; психиатр; гинеколог; эндокринолог; физиотерапевт.
Обследования, которые необходимо провести до плановой госпитализации:
1. Общий анализ крови
2. Общий анализ мочи
3. Исследование крови в реакции Хеддлсона-Райта
Диагностические критерии
Жалобы и анамнез [2]:
- потливость, ознобы;
- болевой синдром (нейро-артро-миалгии);
- слабость;
- снижение работоспособности;
- эмоциональная лабильность.
Эпидемиологический анамнез:
- Участие в окоте и отеле
- Уход за животными (мелкий и крупный рогатый скот)
- Забой животных и разделка туш, потрошение кишок
- Контакт с сырым мясом, фаршем, внутренними органами животных (печень, почки, легкие, кишки и т.д.)
- Употребление сырого молока или молочных продуктов кустарного производства (брынза, сметана, сливки, творог)
- Употребление недостаточно термически обработанного мяса (шашлык, донер, шаурма и т.д.)
- Обработка шкур животных, пошив изделий из шкур (каракуль)
- Стрижка овец
- Работа с шерстью животных, первичная обработка и т.д.
- Уборка помещений для животных
- Производство мясокостной муки
- Работа на мясокомбинате, мясных рынках
- Работа на молочных комбинатах
- Работа поваром, шашлычником
- Эпидемиологическая связь с известной вспышкой бруцеллеза или подтвержденным случаем бруцеллеза у людей.
Физикальное обследование:
- волнообразная, чаще субфебрильная повышенная температура;
- болевой синдром (нейро-артро-миалгии);
- артриты и/или сакроилеиты и/или спондилоартриты;
- миозиты и/или невриты;
- полилимфоаденопатия;
- увеличение печени.
1) Первично-хронический бруцеллез
- Постепенное начало болезни.
- Наличие субфебрильной температуры, потливости при обострении процесса.
- Преобладают астеновегетативный синдром и локальные поражения.
- Длительность болезни свыше 6 месяцев.
- В анамнезе отсутствует указания на перенесенный острый или подострый бруцеллез.
- Возможность минимального инфицирования бруцеллами в течение длительного времени.
- Чаще первично-хроническим бруцеллезом болеют лица, длительно работающие в хозяйстве, не благополучном по бруцеллезу – ветврачи, доярки, чабаны; или лица, живущие в районе, неблагополучном по бруцеллезу.
2) Вторично-хронический бруцеллез
- Характеризуется субфебрильной температурой, потливостью при обострении процесса.
- Преобладают астеновегетативный синдром и локальные поражения.
- Длительность болезни свыше 6 месяцев.
- Является следствием перенесенного острого или подострого бруцеллеза.
Клиника хронического бруцеллеза
- Умеренная интоксикация – длительный субфебрилитет, слабость, повышенная раздражительность, плохой сон и аппетит, снижение работоспособности.
- Генерализованная лимфаденопатия.
- Изменение локомоторного аппарата – артралгии, бурситы, фиброзиты, целлюлиты. Поражается несколько суставов, в основном крупные.
- В патологический процесс вовлекаются различные отделы позвоночника, особенно пояснично-крестовое сочленение.
- Поражение нервной системы проявляется развитием невритов, плекситов, радикулитов, ишиорадикулитов.
- Возможно развитие бруцеллезного менингита, менингоэнцефалита, арахноидита.
- Нарушается половая функция – у мужчин наблюдаются орхиты, импотенция; у женщин – дисминорея, вторичное бесплодие.
Лабораторное обследование:
1. Общий анализ крови – нормо-лейкопения, гипохромная анемия, нейтропения, лимфоцитоз, моноцитоз, тромбоцитопения, СОЭ – в пределах нормы/незначительно увеличена (нормальные показатели крови: эритроциты: муж. 4-5·10 12 /л, жен. 3-4·10 12 /л; цветовой показатель вычисляется по формуле: гемоглобин (г/л) / число эритроцитов · 3 = 0,9-1,1; гематокрит: муж. 40-54%, жен. 36-42%, гемоглобин: муж. 130-150 г/л, жен. 120-140 г/л; лейкоциты 4-9·10 9 /л; нейтрофилы: палочкоядерные 1-6%; плазматические клетки – отсутствуют; сегментоядерные – 47-72%; моноциты 3-11%; тромбоциты180-320·10 9 /л; СОЭ 6-9 мм/ч).
2. Титр агглютинирующих антител к Brucella в реакции Райта одной или более пробах сыворотки крови, взятой у больного после начала заболевания 1:50 и более.
3. Титр антител в РСК 1:5 и более.
4. Выявление противобруцеллезных антител класса IgG и/или IgM и/или IgA методом ИФА.
5. Бактериологическое исследование крови (посев) для выделения бруцелл, при подозрении на ре- и суперинфицирование.
6. Положительный результат ПЦР [3].
Инструментальное исследование:
- Рентгенологическое исследование опорно-двигательного аппарата;
- МРТ при поражении позвоночника: спондилит, спондилодисцит, превертебральный натечник;
- КТ головного мозга при нейробруцеллезе;
- РЭГ или УЗДГ сосудов головного мозга при васкулите сосудов головного мозга;
- ЭКГ;
- УЗИ органов брюшной полости и малого таза.
Показания для консультации специалистов:
- Невропатолог – для исключения нейробруцеллеза: поражения ЦНС (менингит, энцефалит, миелит)
- Кардиолог (изменения на ЭКГ, эндокардит)
- Уролог (орхит)
- Офтальмолог (поражение органов зрения)
- Фтизиоостеолог (спондилит)
- Нейрохирург (спондилодисцит с пролабацией диска, эпидуральный натечник)
- Психиатр (психобруцеллез)
- Гинеколог (воспалительные процессы, бесплодие)
- Эндокринолог (бесплодие)
- Физиотерапевт (коррекция дополнительного лечения)
Дифференциальный диагноз
Дифференциальный диагноз
Алгоритм дифференциальной диагностики хронического бруцеллеза
Примеры формулировки диагноза:
A23.9 Первично-хронический бруцеллез, стадия субкомпенсации. Полиартралгии.
А23.0 Вторично-хронический бруцеллез, вызванный Brucella melitensis, стадия декомпенсации. Левосторонний гонит. Левосторонний орхит. Вторичное бесплодие.
Лечение
Цели лечения:
1. Купирование признаков обострения локальных процессов;
2. Снижение признаков астеновегетативного синдрома.
Тактика лечения: (Клинические рекомендации ВОЗ, 2006) [6]
Немедикаментозное лечение:
- режим в соответствие с выраженностью локальных проявлений;
- диета №15.
Медикаментозное лечение
Этиотропная терапия
Антибиотики назначают при наличии повышения температуры.
Требования к антибиотикотерапии бруцеллеза:
- Длительность курса не менее 6 недель.
- Комбинация 2-х препаратов, обладающих синергизмом.
- Преемственность стационарного и поликлинического этапов лечения с указанием названия препарата, дозы и длительности лечения.
Возможные антибактериальные препараты:
- Антибиотики тетрациклинового ряда: доксициклин (вибрамицин) в дозе 0,2 г однократно 1 день, в последующие дни по 0,1 г.
- Аминогликозиды: гентамицин по 80 мг через 8 часов в/м.
- Ансамицины: рифампицин по 300 млн ЕД 3 раза в сутки.
- Фторхинолоны: ципрофлоксацин по 500 мг 2 раза в сутки или офлоксацин по 200 мг 2 раза в день 30 дней.
- Комбинированные сульфаниламиды: сульфаметоксазол + триметоприм (бисептол, бактрим) 960 мг перорально 2 раза в сутки.
Лечение неосложненного бруцеллеза
- Ципрофлоксацин по 500 мг 2 раза в сутки + доксициклин 200мг/день (30 дней)
- Доксициклин 200мг/день (30 дней) + гентамицин 0,08 г 3 раза в сутки 1гр/день (7-10 дней)
- Офлоксацин по 200 мг 2 раза в день + доксициклин 200мг/день (30 дней )
Лечение осложненного бруцеллеза:
- Спондиллит – длительная терапия доксициклином – 8 недель и более.
- Нейробруцеллез – поскольку тетрациклины и аминогликозиды не проникают через гематоэнцефалический барьер, рекомендуется рифампицин или сульфаметоксазол+триметопримв комплексе с доксициклином.
Осложненный бруцеллез (эндокардиты, менингиты, септические остеоартриты, абсцессы)
- Доксициклин + 2 других препарата с хорошей активностью (рифампицин, фторхинолон, цефалоспорины III поколения в средних терапевтических дозах). Лечить до купирования симптомов локальных проявлений (до 12 недель).
Лечение бруцеллеза во время беременности:
- Рифампицин по 300 млн ЕД 3 раза в сутки в течение 45 дней.
Патогенетическая терапия:
- Нестероидные противовоспалительные препараты в течение 2-4 недель: диклофенак, кетопрофен.
- Стероидные противовоспалительные средства (в инъекционной форме на 3-7 дней) при поражения ЦНС, орхитах (преднизолон, дексаметазон, гидрокортизон).
- Седативные средства: экстракт валерианы 125 мг, мелиссы 25 мг, мяты перечной 25 мг по 1 таблетке 3 раза в день; настойка пустырника по 30-50 капель 3-4 раза в день.
- Дезинтоксикационная терапия: При легких и средних степенях тяжести процесса больным назначается обильное питье из расчета 20-40 мл/кг жидкости в сутки в виде чая, фруктовых и овощных соков, морсов, минеральной воды. В тяжелых случаях требуется применение парентеральной дезинтоксикации. С этой целью используют кристаллоиды (физиологический раствор, ацесоль, лактосоль, ди- и трисоль и т.п.) и коллоиды (реополиглюкин, раствор гидроксиэтилкрахмала). Кристаллоидные и коллоидные растворы в соотношении 3:1 – 2:1.
- Десенсибилизирующая терапия: лоратадин внутрь по 1 таблетке (10 мг) 1 раз в день, кетотифен по 1 мг 2 раза в сутки (утром и вечером).
- Профилактика дисбиоза кишечника: стерильный концентрат продуктов обмена кишечной микрофлоры (Хилак-форте) капли для приема внутрь по 40-60 капель 3 раза в день (возможно назначение совместно с антибиотиками).
Перечень основных медикаментов:
1. Доксициклин таблетки, 100 мг, 200 мг; капсулы 100 мг;
2. Ципрофлоксацин раствор для инфузий 0,2%, 200 мг/100 мл, концентрат для приготовления раствора для инфузий 100 мг/10 мл; таблетки, покрытые оболочкой 250 мг, 500 мг, 750 мг, 1000 мг;
3. Гентамицин по 80 мг, табл, сироп 240 мг/мл;
4. Рифампицин капсулы 150 мг, 300 мг; лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,15 г;
5. Офлоксацин таблетки, покрытые (пленочной) оболочкой 200 мг, 400 мг, 800 мг; раствор для инфузий 200 мг/100 мл;
6. Сульфаметоксазол + триметопримтаблетки, 120 мг, 480 мг; таблетки, покрытые оболочкой 800 мг/160 мг; раствор для внутривенного введения 480 мг/5 мл; суспензия 120 мг/5 мл, 240 мг/5 мл; суспензия для перорального применения 240 мг/5 мл; сироп 200 мг/40 мг/5 мл.
Перечень дополнительных медикаментов:
1. Диклофенак, табл., драже 25 мг, 50 мг, 75 мг, 100 мг, 150 мг;мазь, гель; раствор для инъекций 75 мг/3 мл, 75 мг/2 мл;
2. Кетопрофен раствор для инъекций 100 мг/мл, 100 мг/2 мл; раствор для внутримышечных инъекций 50 мг/мл; капсула 50 мг, 150 мг; таблетки, таблетки покрытые оболочкой 100 мг, 150 мг;
3. Преднизолон раствор для инъекций в ампулах 25 мг/мл, 30 мг/мл;
4. Дексаметазон раствор для инъекций в ампулах 0,4%;
5. Глюкоза раствор для инфузий 5%, 10%
6. Натрия хлорид растворы для инфузий;
7. Натрия хлорида - 6,0; калия хлорида - 0,39, магния хлорида -0,19; натрия гидрокарбоната - 0,65; натрия фосфата однозамещенного - 0,2; глюкозы - 2,0 раствор для инфузий;
8. Гидроксиэтилкрахмал (пентакрахмал) раствор для инфузий 6%, 10%.
9. Стерильный концентрат продуктов обмена кишечной микрофлоры капли для приема внутрь 30 мл, 100 мл.
10. Лоратадин таблетки, 10 мг.
11. Кетотифен таблетки, 1 мг.
12. Экстракт валерианы 125 мг, мелиссы 25 мг, мяты перечной 25 мг; таблетки.
13. Настойка пустырника (1:5) на 70% спирте; во флаконах по 40 мл или флаконах-капельницах по 50 мл.
Другие виды лечения (назначаются консультантом физиотерапевтом):
- ультрафиолетовые лучи (УФО, соллюкс);
- электрофорез обезболивающих и противовоспалительных средств;
- ультразвук и фонофорез обезболивающих и противовоспалительных средств;
- массаж,
- индукторотерапия;
- магнитотерапия;
- УВЧ-терапия;
- лазеротерапия.
Хирургическое вмешательство: нет.
Дальнейшее ведение:
Санаторно-курортное лечение показано не ранее, чем через 3 месяца после обострения – желательны курорты местного климата: Мерке (Жамбылская область), Муялды (Восточно-Казахстанская область), Жана-Курган (Кызылординская область), Алма-Арасан, Капал-Арасан (Алматинская область).
Индикаторы эффективности лечения и безопасности методов диагностики и лечения:
1. Купирование признаков обострения локальных процессов.
2. Снижение признаков астеновегетативного синдрома.
НАСТАВЛЕНИЕ ПО ДИАГНОСТИКЕ БРУЦЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ
Руководитель Департамента ветеринарии Е.А.Непоклонов 29 сентября 2003 г. N 13-5-02/0850
1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
1.1. Бруцеллез - инфекционная, хронически протекающая болезнь животных.
Возбудитель - бактерии из рода бруцелла, в который входят шесть самостоятельных видов: мелитензис (овец и коз), абортус (крупного рогатого скота), суис (свиней), канис (собак), овис (баранов и овец) и неотома (кустарниковых крыс).
Микроорганизмы первых четырех видов вызывают бруцеллез животных, а пятого вида - инфекционный эпидидимит баранов (ИЭ).
От животных, больных бруцеллезом, могут заражаться люди, для которых наиболее опасен возбудитель бруцеллеза овец и коз.
1.2. Диагноз на бруцеллез у животных ставят на основании результатов бактериологического, серологического, молекулярно-генетического и аллергического исследований с учетом эпизоотологических данных и клинических признаков болезни, руководствуясь при этом санитарными и ветеринарными правилами по профилактике и борьбе с заразными болезнями, общими для человека и животных.
1.2.1. При установлении диагноза на бруцеллез необходимо учитывать следующее:
- различные виды возбудителя являются патогенными, в основном, для животных соответствующего вида. Бруцеллы видов мелитензис, абортус и суис могут мигрировать на животных других видов;
- клинические признаки бруцеллеза у животных не характерны. Наиболее часто клиническое проявление болезни у маточного поголовья - аборт, у свиноматок наблюдается мумификация плодов.
При абортах отмечается утолщение плодовых оболочек, образование на них фибринозных или гнойных хлопьев. Бруцеллез сопровождается нередко поражением суставов (артриты), синовиальной системы (тендовагиниты, бурситы), половой системы (у самок - эндометрит, вагинит, у самцов - орхит, эпидидимит);
- патологоанатомическая картина при бруцеллезе не имеет характерных особенностей, позволяющих использовать их для диагностики этой болезни. Только у свиней на слизистой оболочке матки иногда находят желтовато-гнойные или казеозные узелки величиной с просяное зерно, так называемый "милиарный бруцеллез матки";
- у баранов, больных бруцеллезом, в семенниках и придатках обнаруживают некротические или гнойные очаги различной величины; отмечают заполнение полости мошонки серозно-гнойным транссудатом, разрастание фиброзной ткани, сращение придатка с семенником и общей влагалищной оболочкой, иногда атрофию семенников.
1.3. Диагностика бруцеллеза включает лабораторные (бактериологическое, серологическое и молекулярно-генетическое) исследования материала и аллергическое исследование свиней в хозяйствах.
Плановые серологические исследования являются основным методом выявления больных и подозрительных по заболеванию животных.
Бактериологическую диагностику проводят в случае аборта или при появлении у животных других признаков (бурситы, гигромы, орхиты, эпидидимиты и прочие), вызывающих подозрение на данное заболевание. Одновременно проводят серологическое исследование сывороток крови этих животных.
Молекулярно-генетическое исследование (ПЦР) проводят в случае аборта и при появлении у животных других клинических признаков, вызывающих подозрение на бруцеллез, а также при получении положительных и сомнительных результатов серологического исследования на бруцеллез животных, не иммунизированных противобруцеллезными вакцинами, из хозяйств, благополучных по данному заболеванию.
1.4. При взятии проб крови, молока и патологического материала, а также проведении лабораторных исследований необходимо соблюдать меры, предупреждающие заражение людей и обсеменение объектов внешней среды, руководствуясь при этом действующими правилами и инструкциями.
2. ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА ОТ ЖИВОТНЫХ И ПЕРЕСЫЛКА ЕГО ДЛЯ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Материал для лабораторных исследований отбирают от каждого животного в отдельности.
2.2. Для бактериологического исследования на бруцеллез направляют абортированный плод с плодовыми оболочками (от свиноматок берут не менее трех плодов) или селезенку, печень, желудок плода с содержимым, перевязанный со стороны пищевода и двенадцатиперстной кишки, и околоплодную жидкость.
Для прижизненной диагностики бруцеллеза от животных берут кровь, молоко, содержимое гигром (бурситов) и абсцессов. При диагностическом убое - дополнительно селезенку, печень, подчелюстные, заглоточные, предлопаточные, надколенные, подколенные, надвыменные, парааортальные, тазовые лимфатические узлы и половые органы. Жидкий материал берут в стерильную посуду (пробирки, банки).
При взятии содержимого гигром, бурс в области поражения выстригают шерсть, кожный покров дезинфицируют 70%-ным спиртом и смазывают настойкой йода. Затем стерильным шприцем с иглой большого диаметра делают пункцию, отсасывают содержимое гигромы (бурсы) и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой.
Перед взятием проб молока у коров вымя обмывают теплой водой, соски обрабатывают 70%-ным спиртом. Для исследования из каждой доли вымени берут последние порции молока в количестве 10-15 мл в отдельные стерильные пробирки с резиновыми пробками.
У овец и коз пробы молока берут путем пункции цистерны вымени. Для этого животное фиксируют в боковом положении, вымя у основания соска протирают 70%-ным спиртом и смазывают настойкой йода. Стерильным шприцем с иглой делают пункцию у основания соска и после попадания иглы в цистерну (о чем судят по свободному движению конца иглы) набирают в шприц молоко и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой.
Молоко должно быть доставлено в лабораторию и исследовано в день взятия пробы. Если это невозможно, молоко консервируют сухой борной кислотой (0,1 г на 10 мл) или генцианвиолетом (0,4 мл 1%-го спиртоводного раствора краски на 10 мл молока). Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 10 дней.
2.2.1. Отобранные для бактериологического исследования пробы упаковывают в целлофан или пергаментную бумагу, помещают в непроницаемую тару (ящик, банка, полиэтиленовый пакет) и в этот же день направляют в лабораторию. От абортировавшего животного одновременно с патологическим материалом направляют кровь (сыворотку крови) для серологического исследования на бруцеллез. Если в течение 24-30 ч взятый материал доставить в лабораторию не представляется возможным, его консервируют стерильным 30%-ным водным раствором химически чистого глицерина. Материал заливают консервирующей жидкостью в количестве, превышающем его объем в 4-5 раз. Крупные плоды направляют в неконсервированном виде.
2.3. Для серологического исследования в лабораторию направляют кровь (сыворотку крови) и молоко.
2.3.1. Кровь у животных берут из яремной вены (у свиней - из яремной, ушной или хвостовой; у собак - головной предплечья или латеральной подколенной голени; у лисиц и песцов - из бедренной вены; у норок путем отсечения подушечки среднего пальца задней лапы или кончика хвоста в стерильные пробирки по 5-7 мл (от пушных зверей по 1-2 мл). Пробирки нумеруют и составляют опись проб.
Консервирование сывороток проводят:
- добавлением 0,05 мл (1 капля) 5%-го раствора фенола на каждый миллилитр сыворотки при тщательном перемешивании;
- сухой борной кислотой (2-4% к объему сыворотки) до получения насыщенного раствора и образования на дне пробирки небольшого осадка;
- путем однократного замораживания.
Неконсервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 6 сут со дня взятия крови при условии хранения их при 4-8 °С.
Сыворотки, консервированные фенолом или борной кислотой, пригодны для исследования в течение 30 сут; замороженные сыворотки - в течение 3 сут после однократного оттаивания.
Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки исследованию на бруцеллез не подлежат.
2.3.2. Для исследования на бруцеллез в кольцевой реакции пробу цельного свежего молока от коровы (буйволицы) берут сборную из каждой доли вымени одного удоя в одну стерильную пробирку в количестве 10-15 мл. При этом, если молоко берут перед дойкой, то первые порции молока сдаивают. Пробы молока на рынках берут из каждой отдельной посуды (бидон, фляга и проч.) после тщательного его перемешивания. Пробирки нумеруют и составляют опись проб.
Молоко исследуют свежее (охлажденное до 4-10 °С или неохлажденное) или консервированное добавлением в каждую пробу одной капли 10%-го раствора формалина на 5 мл молока. Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 2-3 сут. Перед исследованием молоко необходимо тщательно перемешать для равномерного распределения сливок.
При массовом исследовании молока работу по отбору проб и постановке кольцевой реакции можно проводить непосредственно на ферме в специально отведенном помещении.
Не разрешается исследовать в кольцевой реакции молоко от коров (буйволиц), больных маститом или болезнями, сопровождающимися повышением температуры тела, а также молоко животных в первые две недели после родов. Молоко, имеющее повышенную кислотность (30° по Тернеру и выше), исследованию не подлежит, т.к. антиген обесцвечивается.
2.4. На направляемый в лабораторию материал заполняют сопроводительный документ установленной формы.
3. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА
3.1 Бактериологическую диагностику бруцеллеза проводят в случае аборта или при появлении у животных других признаков (бурситы, гигромы, орхиты, эпидидимиты и прочие), вызывающих подозрение на данное заболевание.
3.2 Бруцеллы обнаруживают бактериоскопией мазков из патологического материала, выделением культуры бруцелл на питательных средах и, при необходимости, путем постановки биологической пробы на морских свинках.
3.3 Бактериоскопическое исследование
Из доставленного на исследование патологического материала делают по два мазка из каждого объекта. При исследовании абортированных плодов мазки готовят из содержимого желудка, жидкости брюшной и грудной полостей, печени, селезенки, а также котиледонов плодовых оболочек. Из паренхиматозных органов, котиледонов и другого плотного материала делают мазки-отпечатки, жидкий материал наносят на предметные стекла пипеткой.
Мазки, фиксированные над пламенем горелки, окрашивают по Граму и одному из следующих специальных методов: по Стампу (модифицированный метод Циль-Нильсена), Козловскому или Шуляку-Шину (см. Прил. N 1, п.1). При микроскопии мазков учитывают, что бруцеллы - мелкие, грамотрицательные, расположенные отдельно, попарно или кучно коккобактерии, окрашивающиеся по Стампу, Козловскому или Шуляку-Шину в красный цвет.
3.4. Бактериологическое исследование
3.4.1 Для культивирования бруцелл используют мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ), печеночный глюкозо-глицериновый бульон (ПГГБ), мясо-пептонный печеночно-глюкозо-глицериновый агар (МППГГА), печеночный глюкозо-глицериновый агар (ПГГА), картофельный агар, эритрит-агар, сывороточно-декстрозный агар, печеночно-сывороточный агар и печеночно-аминопептидный агар, (см. Прил. N 1, п.2) и другие питательные среды, предназначенные для этой цели.
3.4.2 Перед посевом материала кожу абортированного плода с поверхности по белой линии протирают тампонами, смоченными 5%-ным раствором фенола. Стерильными ножницами вскрывают брюшную стенку и грудную клетку плода, содержимое грудной и брюшной полостей набирают пастеровскими пипетками и высевают в 1 пробирку с бульоном и 2 пробирки с агаром, а содержимое желудка - в 2 пробирки с бульоном и не менее 5 пробирок с агаром.
Из печени и селезенки вырезают кусочки размером не менее 2,0х1,5х2,5 см, увлажняют их спиртом, обжигают с поверхности и растирают в стерильной ступке с песком. Затем в ступку добавляют равное количество стерильного физиологического раствора и вновь растирают. Полученную взвесь пастеровской пипеткой по 0,1-0,2 мл высевают на поверхность предварительно подсушенных плотных сред (в пробирках или чашках). Допускается высев материала пастеровской пипеткой из органов (место прокола органа предварительно прижигают раскаленным шпателем). Из каждого органа делают посев на 1 пробирку с бульоном и 2 пробирки с агаром.
Если в лабораторию доставлен только желудок плода, высев проводят не менее чем на 10 пробирок агара.
При поступлении нескольких плодов от одного животного посевы делают из органов и тканей каждого плода отдельно.
Из плодовых оболочек и плаценты вырезают кусочки тканей с утолщенными ворсинками и стенками, наличием на поверхности фибрина или гнойного экссудата (выбирают менее загрязненные участки без некротических изменений).
Для уничтожения посторонней микрофлоры кусочки плаценты помещают в чашку Петри и заливают 3%-ным раствором гидроокиси калия на 30 мин. Затем их обмывают стерильным физиологическим раствором, готовят из этого материала суспензию в ступке со стерильным песком и делают посев пастеровской пипеткой на чашки со средой, содержащей бактериостатические препараты: генцианвиолет 1:200000 (0,1 мл 0,5%-го спиртоводного раствора на 100 мл среды) или кристаллвиолет 1:100000, генцианвиолет и малахитовую зелень в концентрации каждой краски 1:200000, уксуснокислый натрий из расчета 12,5 мг на 100 мл среды и др.
Содержимое бурс, гигром высевают на 3-4 чашки с плотной питательной средой, содержащей бактериостатические препараты.
Пробы молока центрифугируют 30 мин при 3000 об./мин. Верхний слой (сливки) и осадок набирают в пастеровскую пипетку и по 0,1-0,2 мл вносят на 3-4 чашки с агаром, содержащим бактериостатические препараты. Молоко, консервированное генцианвиолетом или другими консервантами, высевают на среды без бактериостатических веществ.
3.4.3. Для выращивания культур посевы помещают в термостат при 37-38 °С.
При исследовании материала от крупного рогатого скота половину засеянных пробирок и чашек культивируют в обычных условиях, другую - в атмосфере с повышенным содержанием углекислого газа (10-15%) в -инкубаторе или эксикаторе (микроанаэростате). Аналогичные условия можно создать в пробирках, закрытых резиновыми пробками или залитых парафином.
Перед парафинированием пробирки закрывают ватными пробками, пронося последние над пламенем горелки. Затем верхнюю часть пробки обрезают, а оставшуюся часть углубляют на 0,5-1,0 см внутрь пробирки и заливают расплавленным парафином.
Необходимое содержание углекислого газа в эксикаторе можно получить путем:
- заполнения части объема углекислым газом из баллона или аппарата Киппа;
- внесения бикарбоната натрия и серной или соляной кислоты (0,48 г бикарбоната натрия и 5 мл 25%-го раствора кислоты или 0,4 г бикарбоната натрия и 0,35 мл концентрированной соляной кислоты на 1 л объема);
- сжигания ваты, смоченной спиртом. При этом пробирки и чашки с посевами должны занимать не более половины объема эксикатора. Для определения концентрации углекислого газа в эксикаторе можно использовать химический метод (см. Прил. N 1, п.3).
3.4.4. Посевы выдерживают в термостате при 37-38 °С в течение 30 сут. Первичный осмотр посевов проводят через 24-48 ч. Пробирки с агаром и бульоном, заросшие посторонней микрофлорой, обезвреживают путем автоклавирования при 1,5 атм. в течение 1 ч.
В дальнейшем для обнаружения роста бруцелл посевы просматривают каждые 3-4 сут визуально, при необходимости через лупу или малом увеличении микроскопа. При отсутствии роста часть поверхности агара орошают посевным материалом.
При значительном росте посторонней микрофлоры (80% и более засеянных пробирок) бактериологическое исследование прекращают.
При просмотре посевов обращают внимание на характер роста микробов. На поверхности агара бруцеллы образуют мелкие, блестящие, выпуклые, с ровными краями и гладкой поверхностью просвечивающиеся колонии, имеющие в отраженном свете голубоватый оттенок, в падающем свете - сероватый. С возрастом колонии мутнеют и приобретают более темную окраску, что связано с появлением пигмента.
В бульоне бруцеллы образуют равномерное помутнение и пристеночное кольцо, возвышающееся над уровнем бульона, а в дальнейшем небольшой осадок на дне пробирки. В отраженном свете пристеночное кольцо имеет голубоватый оттенок.
При обнаружении роста на жидких средах и отсутствии характерного роста на агаре из каждой пробирки готовят мазки, которые окрашивают одним из специальных методов, и делают пересев на чашки с плотной средой для выделения чистой культуры. Пересевы на чашках культивируют так же, как и высевы из патологического материала.
Выделенные культуры идентифицируют по тинкториальным (окраска мазков по Граму и одним из специальных методов - по Стампу, Козловскому или Шуляку-Шину), морфологическим, культуральным свойствам и в реакции агглютинации на стекле с использованием набора компонентов для серологической дифференциации бруцелл.
Для постановки пластинчатой реакции агглютинации на стекле необходимы следующие компоненты: испытуемая культура, набор для серологической дифференциации бруцелл (выпускается биопредприятием), 0,5%-ный фенолизированный физиологический раствор рН 7,0-7,2.
Читайте также: