Что такое иммунодиагностика инфекционных заболеваний

Обновлено: 24.04.2024

Иммунодиагностика (лат. immunis свободный, избавленный от чего-либо + диагностика) — использование иммунологических методов для диагностики заболеваний или нарушений защитных функций организма. Методы Иммунодиагностики основаны на специфическом взаимодействии антигена с антителами, иногда в присутствии других (индикаторных) компонентов реакции. Иммунодиагностика наиболее широко применяется в области инфекционной патологии, аллергологии, гематологии, в онкологии и при переливании крови, а также при изучении трансплантационного иммунитета и аутоиммунных заболеваний.

Иммунодиагностика заболеваний часто связана с выявлением и идентификацией антигенов, играющих этиологическую или патогенетическую роль. Выявление антигенов имеет важное значение в Иммунодиагностике инфекционных (бактериальных, вирусных, грибковых, паразитарных) заболеваний. Выделенные из организма больного бактерии часто идентифицируют в реакциях агглютинации (см), и иммунофлюоресценции (см.) со специфическими антисыворотками. Для идентификации вирусов используют реакцию нейтрализации, регистрируемую или по торможению гемагглютинации (см.), вызываемой вирусами, или по нейтрализации их инфекционности. Антигены, находящиеся в растворенном состоянии (напр., австралийский антиген в сыворотке больных гепатитом, антигены дизентерийных или холерных бактерий в испражнениях больных), выявляют в реакциях преципитации (см.), реакции связывания комплемента (см.), торможения пассивной гемагглютинации. В онкологической клинике для Иммунодиагностики рака печени и кишечника используют определение в сыворотке альфа-фетопротеина и других эмбриональных антигенов с помощью метода иммунодиффузии (см.). В современной эндокринологии широко используют радиоиммунол. определение инсулина и других гормонов.

Другое направление И. заключается в исследовании иммунного ответа на инфекционные, аллергические и трансплантационные антигены или собственные антигены при аутоиммунных заболеваниях. Ответ может выражаться в продукции гуморальных антител или в формировании клеточного иммунитета.

Определение сывороточных антител — антибактериальных, антитоксических, противовирусных и других — регистрируют методами классической серологии (см. Серологические исследования): в реакции агглютинации (напр., реакция Видаля при брюшном тифе), пассивной агглютинации с эритроцитами или частицами, нагруженными бактериальными или грибковыми антигенами, РСК, преципитации, нейтрализации вирусов. Неполные антитела, имеющие значение в диагностике хронических инфекций, определяют в пробе Кумбса с антиглобулиновой сывороткой (см. Кумбса реакция). Токсиннейтрализующие антитела выявляют также in vivo путем внутрикожного введения небольших доз токсина (проба Шика при дифтерии, проба Дика при скарлатине). В аллергологии используют кожные пробы с аллергенами (см. Кожные пробы). Возникновение кожной реакции немедленного типа указывает на наличие у больного IgE-антител (реагинов), специфичных к данному аллергену. Иногда кожные пробы с аллергенами ставят в пассивном варианте — проба Прауснитца — Кюстнера (см. Прауснитца-Кюстнера реакция). Методы И., напр, с применением лимфоцитотоксических антител, используют в трансплантационной иммунологии при тканевом типировании донора и реципиента по антигенам гистосовместимости.

Помимо выявления специфических антител, для И. некоторых заболеваний используют определение количества сывороточных иммуноглобулинов как косвенный показатель развития иммунного ответа. Так, увеличение уровня IgA и IgM в сыворотке новорожденного указывает на внутриутробную инфекцию — сифилис, Токсоплазмоз и проч., повышение IgE — на аллергическую природу заболевания. Выявление в сыворотке гомогенного по структуре и антигенным свойствам иммуноглобулина (моноклонового) играет большую роль в И. гаммаглобулинопатий, напр. Вальденстрема болезнь (см.), миеломная болезнь (см.).

В Иммунодиагностике аутоиммунных заболеваний важное место занимает определение сывороточных аутоантител: ревматоидного фактора при ревматоидном артрите и других коллагенозах, антител к ядрам клеток при системной красной волчанке, антиэритроцитарных антител при аутоиммунных анемиях.

Иммунные сдвиги, касающиеся клеточного иммунитета, исследуют или in vivo с помощью кожных проб, выявляющих гиперчувствительность замедленного типа (напр., реакции Пирке и Манту при туберкулезе), или in vitro с помощью тестов на способность лимфоцитов к бластотрансформации при контакте с антигеном; определяют также способность лимфоцитов к продукции фактора, тормозящего миграцию макрофагов (МИФ), что является эквивалентом гиперчувствительности замедленного типа.

Иммунодиагностика нарушения иммунологических функций организма основана на исследовании неспецифических иммунных реакций и функций специфического гуморального и клеточного иммунитета.

Для оценки неспецифических иммунных реакций исследуют способность полиморфно-ядерных фагоцитов (нейтрофилов) к миграции под воздействием хемотаксических факторов, к поглощению корпускулярных антигенов, к их внутриклеточному перевариванию. Важное значение имеет также определение комплемента сыворотки, в том числе отдельных его компонентов.

Снижение неспецифических иммунных реакций может зависеть от генетических дефектов, замедления темпов иммунного созревания, неблагоприятного воздействия заболеваний (диабет), интоксикаций (алкоголизм).

Для оценки функций гуморального специфического иммунитета определяют уровень сывороточных иммуноглобулинов разных классов, уровень нормальных антител — изогемагглютининов, антител к распространенным бактериальными вирусным антигенам или способность к антителообразованию при иммунизации различными вакцинами, используемыми как тест-антигены.

Указанные методы позволяют диагностировать первичные иммунодефицитные состояния (врожденная агаммаглобулинемия, различные дисгаммаглобулинемии) и вторичные иммунодефицитные заболевания, возникающие вследствие нарушения синтеза иммуноглобулинов (напр., при лимфопролиферативных заболеваниях) или усиления их катаболизма (при тиреотоксикозе, нефротическом синдроме). Определение антителообразования на тест-антигены позволяет выявить состояние иммунол, ареактивности при нормальном уровне иммуноглобулинов.

Для оценки функций клеточного иммунитета исследуют реакции гиперчувствительности замедленного типа на внутрикожное или подкожное введение различных антигенов (туберкулина, грибковых антигенов) и способность лимфоцитов к трансформации и пролиферации под влиянием неспецифических митогенных стимуляторов (напр., фитогемагглютинина). Реакцию оценивают по интенсивности бластотрансформации, по величине митотического индекса или по включению радиоактивных предшественников РНК и ДНК.

Исследование клеточного иммунитета необходимо для диагностики иммунодефицитных состояний, связанных с недостаточностью системы Т-лимфоцитов.

Разнообразие задач, решаемых с помощью Иммунодиагностики, высокая чувствительность и специфичность ее методов определяют широкое использование Иммунодиагностики в разных областях клин, медицины.

Библиография: Иоффе В. И. Клиническая и эпидемиологическая иммунология, Л., 1968, библиогр.; Петров Р. В. Иммунология и иммуногенетика, М., 1976, библиогр.; Современные проблемы иммунологии и иммунопатологии, под ред. А. А. Смородинцева и др., Л., 1970; Bellanti J. A. Immunology, Philadelphia, 1971; Rоitt I. M. Essential immunology, Oxford, 1971.

Иммунодиагностика инфекционных заболеваний. Иммунологический метод. Феномен прозоны. Иммунодиагностические тесты.

Становление иммунологических методов распознавания инфекционных заболеваний пришлось на конец ХIХ-начало XX в. Поскольку взаимодействия иммунной системы и Аг изучали с применением AT сыворотки крови, эти методы получили назвали серологические [от лат. serum, сыворотка, + logos, наука] реакции. Основная идея этих методов — установить феномен ответа организма на чужеродный Аг.

Выявление AT к инфекционному агенту даёт возможность не только выявить выраженную текущую инфекцию, но и установить факт первичного инфицирования. Серологические реакции активно применяют при проведении полного объёма диагностических исследований. Увеличение титров AT — зачастую единственный дифференциально-диагностический признак, указывающий на инфекционное заболевание. Выявление AT особенно актуально при неудачных попытках выделить возбудитель инфекции. Однако классические реакции выявления микробных Аг и AT к ним в значительной степени потеряли своё значение в экспресс-диагностике бактериальных инфекций.

Тем не менее серологические реакции остаются важным инструментом диагностики заболеваний и идентификации возбудителей.

Современный арсенал методов лабораторного распознавания возбудителей составляют десятки иммунодиагностических тестов. Их объединяет общее свойство — все тесты сравнительно редко дают ложноположительные или ложноотрицательные результаты. Ниже рассматриваются основные иммунодиагностические методы, применяемые на практике. Все серологические реакции разделяют на простые и сложные.

Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.

Преимущества иммунологического метода исследования.

Серологические реакции различаются по способности выявлять отдельные классы антител. Реакция агглютинации, например, хорошо выявляет lgM-антитела, но менее чувствительна для определения lgG-антител. Реакции связывания комплемента и гемолиза, которые требуют участия комплемента, не выявляют антитела, не присоединяющие комплемент, например lgA-антитела и lgE-антитела. В реакции нейтрализации вирусов участвуют лишь антитела, направленные против антигенных детерминант поверхности вириона, связанных с патогенностью. Чувствительность иммунулогических методов превосходит все другие методы исследования антигенов и антител, в частности радиоиммунный и иммуноферментный анализы позволяют улавливать присутствие белка в количествах, измеряемых в нанограммах и даже в пикограммах.

С помощью предложенного способа определяют группу и проверяют безопасность крови (гепатит В и ВИЧ-инфекция). При трансплантации тканей и органов, иммунологический метод позволяет определять совместимость тканей и тестировать методы подавления несовместимости. В судебной медицине используют реакцию Кастеллани для определения видовой специфичности белка и реакцию агглютинации для определения группы крови.

Иммунологические методы широко применяют в лабораторной диагностике инфекционных болезней. Этиологию заболевания устанавливают также на основании прироста антител к возбудителю в сыворотке крови реконвалесцента по сравнению с пробой, взятой в первые дни болезни. На основе исследования изучают иммунитет населения по отношению к массовым инфекциям, например к гриппу, а также оценивают эффективность профилактических прививок.

Развитию иммунологических методов способствовало создание моноклональных антител, продуцируемых гибридомой, полученной в результате слияния иммунокомпетентной клетки В-лимфоцита и клетки миеломы мышей. Моноклональные антитела несут только одну химически однородную популяцию антител, комплементарную специфической детерминанте антигена, что позволяет осуществлять тонкую дифференциацию белков. Развитие иммунологического метода исследования идет как по линии совершенствования реагентов (чистоты антигенов и антител), так и по линии создания автоматизированных систем постановки реакций и их инструментального учета.

Виды реакций метода иммунологического исследования

В зависимости от их механизма и учета результатов, иммунологический метод исследования можно подразделить на 5 видов реакции.

1.Реакции, основанные на феномене агглютинации.

Агглютинация представляет собой склеивание клеток или отдельных частичек — носителей антигена с помощью иммунной сыворотки к этому антигену.

Реакция агглютинации бактерий с использованием соответствующей антибактериальной сыворотки относится к наиболее простым серологическим реакциям. Взвесь бактерий добавляют к различным разведениям испытуемой сыворотки крови и через определенное время контакта при t 37° регистрируют, при каком наивысшем разведении сыворотки крови происходит агглютинация. Реакцию агглютинации бактерий используют для диагностики многих инфекционных болезней: бруцеллеза, туляремии, брюшного тифа и паратифов, бациллярной дизентерии, сыпного тифа.

Реакции агглютинации для определения группы крови и резус-фактора основаны на взаимодействии аллоантител (изоантител) и антигенов эритроцитов. Антитела против резус-фактора являются неполными, они не способны к прямой реакции с резус-положительными эритроцитами, поэтому для их обнаружения используют реакцию Кумбса, основанную на выявлении неполных антител с помощью антиглобулиновых сывороток. К эритроцитам известной специфичности добавляют исследуемую сыворотку крови, а вслед за этим антиглобулиновую сыворотку против lgG (непрямая реакция Кумбса). Fab-фрагменты неполных антител исследуемой сыворотки крови присоединяются к эритроцитам, а к свободным Fc-фрагментам этих антител присоединяются антитела против lgG, и происходит агглютинация эритроцитов.

Реакция пассивной или непрямой гемагглютинации (РПГА, РНГА). В ней используют эритроциты или нейтральные синтетические материалы (например, частицы латекса), на поверхности которых сорбированы антигены (бактериальные, вирусные, тканевые) или антитела. Их агглютинация происходит при добавлении соответствующих сывороток или антигенов. Эритроциты, сенсибилизированные антигенами, называют антигенным эритроцитарным диагностикумом и используют для выявления и титрования антител. Эритроциты, сенсибилизированные антителами, называют иммуноглобулиновыми эритроцитарными диагностикумами и применяют для выявления антигенов.

Реакцию пассивной гемагглютинации используют для диагностики заболеваний, вызванных бактериями (брюшной тиф и паратифы, дизентерия, бруцеллез, чума, холера и др.), простейшими (малярия) и вирусами (грипп, аденовирусные инфекции, вирусный гепатит В, корь, клещевой энцефалит, крымская геморрагическая лихорадка и др.), а также для определения некоторых гормонов, выявления повышенной чувствительности больного к лекарственным препаратам и гормонам, например пенициллину и инсулину.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на феномене предотвращения (торможения) иммунной сыворотки гемагглютинации эритроцитов вирусами, используется для выявления и титрования противовирусных антител. Она служит основным методом серодиагностики гриппа, кори, краснухи, эпидемического паротита, клещевого энцефалита и других вирусных инфекций, возбудители которых обладают гемагглютинирующими свойствами, например, для серодиагностики клещевого энцефалита, в лунки панели разливают двукратные разведения сыворотки больного на щелочном боратном буферном растворе. Затем добавляют определенное количество, обычно 8 АЕ (агглютинирующих единиц), антигена клещевого энцефалита и после 18 ч экспозиции при t 4° вносят взвесь гусиных эритроцитов, приготовленную на кислом фосфатно-буферном растворе. Если в сыворотке крови больного есть антитела к вирусу клещевого энцефалита, то антиген нейтрализуется и агглютинация эритроцитов не происходит.

2.Реакции, основанные на феномене преципитации.

Преципитация происходит в результате взаимодействия антител с растворимыми антигенами. Простейшим примером реакции преципитации является образование в пробирке непрозрачной полосы преципитации на границе наслоения антигена на антитело. Широко применяют различные разновидности реакции преципитации в полужидких гелях агара или агарозы (метод двойной иммунодиффузии по Оухтерлоню, метод радиальной иммунодиффузии, иммуноэлетрофорез), которые носят одновременно качественный и количественный характер. В результате свободной диффузии, в геле антигенов и антител в зоне оптимального их соотношения образуются специфические комплексы — полосы преципитации, которые выявляют визуально или при окрашивании. Особенностью метода является то, что каждая пара антиген-антитело формирует индивидуальную полосу преципитации, и реакция не зависит от наличия в исследуемой системе других антигенов и антител.

Для постановки двойной иммунодиффузии наливают слой растопленного геля на стеклянную пластинку и после затвердевания вырезают лунки диаметром 1,5–3 мм. В расположенные по кругу лунки помещают исследуемые антигены, а в центральную лунку — иммунную сыворотку известной специфичности. Диффундируя навстречу друг другу, гомологичные сыворотки и антигены образуют преципитат.

При радиальной иммунодиффузии (по методу Манчини), иммунную сыворотку вносят в агар. Антиген, помещенный в лунки, диффундирует через агар, и в результате преципитации с иммунной сывороткой, вокруг лунок образуются непрозрачные кольца, внешний диаметр которых пропорционален концентрации антигена. Метод используют для определения классов иммуноглобулинов, а модификации метода можно применять для определения противомикробных антител, относящихся к различным классам иммуноглобулинов.

Иммуноэлектрофорез основан на усилении миграции в геле антигенов и антител путем помещения пластины геля с реагентами в электрическое поле. При этом достигается разделение антигенов и антител на компоненты в соответствии с их подвижностью и зарядом.

Разновидностью иммуноэлектрофореза является радиоиммунофорез. В этом случае после электрофоретического разделения антигенов в канавку, вырезанную параллельно движению антигенов в геле, наливают сначала меченную радиоактивным йодом иммунную сыворотку против определяемых антигенов, а затем иммунную сыворотку против lgG-антител, которая преципитирует образовавшиеся комплексы антитела с антигеном. Все несвязавшиеся реагенты вымывают, а комплекс антиген-антитело обнаруживает методом авторадиографии.

3.Реакции с участием комплемента.

В качестве комплемента используют свежую сыворотку крови морской свинки, основанную на способности субкомпонента комплемента Clq и затем других компонентов комплемента присоединяться к иммунным комплексам.

Реакция связывания комплемента (РСК) позволяет титровать антигены или антитела по степени фиксации комплемента комплексом антиген-антитело. Эта реакция состоит из двух фаз: взаимодействия антигена с испытуемой сывороткой крови (исследуемая система) и взаимодействия гемолитической сыворотки с эритроцитами барана (индикаторная система). При положительной реакции в исследуемой системе происходит связывание комплемента, и тогда при добавлении сенсибилизированных антителами эритроцитов, гемолиза не наблюдается. Реакцию применяют для серодиагностики сифилиса (реакция Вассермана), вирусных и бактериальных инфекций.

Реакция радиального гемолиза эритроцитов может протекать в геле. Взвесь эритроцитов барана помещают в агарозный гель с комплементом; в застывшем на стекле слое делают лунки и вносят в них гемолитическую сыворотку. Вокруг лунок в результате радиальной диффузии антител образуется зона гемолиза, радиус которой прямо пропорционален титру сыворотки. Если сорбировать на эритроцитах какой-либо антиген, например гликопротеиновый гемагглютинин вируса гриппа, краснухи или клещевого энцефалита, то можно воспроизвести феномен гемолиза иммунными сыворотками к этим вирусам. Реакцию радиального гемолиза в геле применяют в диагностике вирусных инфекций. Она характеризуется простотой постановки, нечувствительностью к сывороточным ингибиторам, позволяет титровать сыворотки крови по диаметру зоны гемолиза, не прибегая к серийным разведениям.

Иммунное прилипание. Эритроциты, тромбоциты и другие клетки крови имеют на поверхности рецепторы к третьему компоненту комплемента (СЗ). Если к антигену (бактериям, вирусам и др.) добавить соответствующую иммунную сыворотку и комплемент, то образуется комплекс антиген-антитело, покрытый СЗ-компонентом комплемента. Эту реакцию применяют при изучении ряда вирусных инфекций (клещевого энцефалита, денге), которые сопровождаются иммунопатологическими процессами и циркуляцией в крови вирусных антигенов в комплексе с антителами.

4.Реакция нейтрализации.

Основана на способности антител нейтрализовать некоторые специфические функции макромолекулярных или растворимых антигенов, например активность ферментов, токсины бактерий, болезнетворность вирусов. В бактериологии эту реакцию используют для обнаружения антистрептолизинов, антистрептокиназы и антистафилолизинов. Реакцию нейтрализации токсинов можно оценивать по биологическому эффекту, так, например, титруют антистолбнячные и антиботулинические сыворотки. Смесь токсина с антисывороткой, введенная животным, не вызывает их гибели. Различные варианты реакции нейтрализации применяют в вирусологии. При смешивании вирусов с соответствующей антисывороткой и введении этой смеси животным или в клеточные культуры, патогенность вирусов нейтрализуется и при этом животные не заболевают, а клетки культур не подвергаются деструкции.

5.Реакции с использованием химических и физических меток (ИФА).

Иммунофлюоресценция заключается в использовании меченых флюорохромом антител, точнее, иммуноглобулиновой фракции антител lgG. Меченое флюорохромом антитело образует с антигеном комплекс антиген-антитело, который становится доступным наблюдению под микроскопом в УФ-лучах, возбуждающих свечение флюорохрома. Реакцию прямой иммунофлюоресценции используют для изучения клеточных антигенов, выявления вируса в зараженных клетках и обнаружения бактерий и риккетсий в мазках. Так, для диагностики бешенства, отпечатки кусочков мозга животных, подозреваемых на вирусоносительство, обрабатывают люминесцирующей антирабической сывороткой. При положительном результате, в цитоплазме нервных клеток выявляются глыбки ярко-зеленого цвета. На обнаружении антигенов вирусов в клетках отпечатков со слизистой оболочки носа основана экспресс-диагностика гриппа, парагриппа и аденовирусной инфекции.

Более широко применяют метод непрямой иммунофлюоресценции, основанный на выявлении комплекса антиген-антитело с помощью люминесцирующей иммунной сыворотки против lgG-антител и используемой для обнаружения не только антигенов, но и титрования антител. Метод нашел применение в серодиагностике герпеса, цитомегалии, лихорадки Ласса. Препараты с наслоенной исследуемой сывороткой крови помещают в термостат при t 37° для образования иммунных комплексов, а затем, после отмывания несвязавшихся реагентов, выявляют эти комплексы меченой люминесцирующей сывороткой против глобулинов человека. Применяя меченые иммунные сыворотки против lgM- или lgG-антител, можно дифференцировать тип антител и обнаруживать ранний иммунный ответ по наличию lgM-антител.

Иммунофлюоресценцию широко используют не только в бактериологии, вирусологии, паразитологии, но и в иммунопатологии для обнаружения антител к тканевым антигенам человека.

Иммуноферментные или энзим-иммунологические методы основаны на использовании антител, конъюгированных с ферментами, главным образом пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой. Чтобы обнаружить соединение меченых антител с антигеном, добавляют субстрат, разлагаемый присоединенным к lgG ферментом, с окрашиванием в желто-коричневый (пероксидаза) или желто-зеленый (фосфатаза) цвет. Используют также ферменты, разлагающие не только хромогенный, но и люмогенный субстрат. В этом случае при положительной реакции появляется свечение. Подобно иммунофлюоресценции, иммуноферментный метод применяют для обнаружения антигенов в клетках или титрования антител на антигенсодержащих клетках.

Наиболее популярной разновидностью иммуноферментного метода является иммуносорбция. На твердом носителе, которым могут быть целлюлоза, полиакриламид, декстран и различные пластмассы, сорбируют антиген. Чаще носителем служит поверхность лунок микропанелей. В лунки с сорбированным антигеном вносят исследуемую сыворотку крови, затем меченую ферментом антисыворотку и субстрат. Положительные результаты учитывают по изменению цвета жидкой среды. Для обнаружения антигенов, на носитель сорбируют антитела, затем вносят в лунки исследуемый материал и проявляют реакцию меченой ферментом антимикробной сывороткой. Повышению чувствительности иммунофлюоресцентного и иммуноферментного методов способствует введение в систему реакции авидина и биотина.

Радиоиммунологический метод основан на применении радиоизотопной метки антигенов или антител. Является наиболее чувствительным методом определения антигенов и антител, используется для определения гормонов, лекарственных веществ и антибиотиков, для диагностики бактериальных, вирусных, риккетсиозных, протозойных заболеваний, исследования белков крови, тканевых антигенов. Первоначально он был разработан как специфический метод измерения уровня циркулирующих в крови гормонов. Тест-системой являлись меченый радионуклидом гормон (антиген) и антисыворотка к нему. Если к такой антисыворотке добавить материал, содержащий искомый гормон, то он свяжет часть антител, при последующем внесении меченого титрованного гормона с антителами свяжется уменьшенное по сравнению с контролем его количество. Результат оценивают по сопоставлению кривых связанной и несвязанной радиоактивной метки. Эта разновидность метода носит название конкурентной реакции. Существуют и другие модификации радиоиммунологического метода.

Иммуногистологические методы предназначены для определения антигенов на поверхности или внутри клетки, например для обнаружения маркеров лимфоцитов и иммунокомплексов при гломерулонефритах и других заболеваниях почек. В этой реакции для выявления антигенов пользуются или иммунофлюоресценцией, или иммуноферментными конъюгатами с пероксидазой. Количество специфических антигенов определяют по интенсивности окрашивания. Иногда используют автоматическую регистрацию с помощью спектрофотометра.

Иммунодиагностика инфекционных заболеваний. Иммунологический метод. Феномен прозоны. Иммунодиагностические тесты.

Читайте также: