Crispr cas9 в лечении вич в китае
Обновлено: 24.04.2024
Китайские ученые впервые в мире провели эксперимент по редактированию генома взрослого человека с помощью технологии CRISPR/Cas9. 28 октября пациенту с раком легких ввели модифицированные Т-лимфоциты. Об эксперименте сообщается в редакционном материале Nature.
Клинические испытания по лечению рака легких с помощью CRISPR-модифицированных Т-лимфоцитов, который проводят сотрудники Сычуаньского университета, были одобрены в июле 2016 года. Первые эксперименты должны были состояться в августе, однако начало испытаний было отложено, поскольку культивирование клеток заняло больше времени, чем планировалось.
В рамках испытаний пациентам с метастазировавшим немелкоклеточным раком легких, устойчивым к остальным видам лечения, вводят собственные Т-лимфоциты, в которых с помощью технологии CRISPR/Cas9 был удален ген мембранного белка PD-1. Этот белок подавляет клеточный иммунитет и позволяет опухоли инактивировать лимфоциты. В настоящее время для блокирования этого белка применяются препараты на основе антител, однако ответ на них сильно отличается у разных пациентов. Ученые надеются, что эффект от применения CRISPR будет более выраженным и предсказуемым.
По словам руководителя испытаний, инфузия Т-лимфоцитов первому пациенту прошла успешно, и скоро ему введут вторую дозу модифицированных клеток. В случае, если у этого первого пациента не появятся выраженные побочные эффекты, число испытуемых с метастазировавшим немелкоклеточным раком легких увеличат до 10. Им введут разные дозы модифицированных Т-лимфоцитов в ходе 2, 3 или 4 инфузий. В течение 6 месяцев после этого за пациентами будут наблюдать, чтобы проверить, не вызывают ли инфузии побочных эффектов. Наблюдения за результатами терапии продолжатся и впоследствии.
Испытания по редактированию генома человека с помощью технологии CRISPR/Cas9 планируются также в США. Так, в июне 2016 года Федеральная комиссия по биологической безопасности и этике США одобрила клинические испытания, в рамках которых эта технология будет использована для внесения дополнительных изменений в Т-лимфоциты с химерными антигенными рецепторами (CAR). В клетках планируется удалить белок PD-1, а также натуральный рецептор лимфоцитов TCR, наличие которого уменьшает эффективность CAR. Если решение комиссии поддержат Управление по продуктам и лекарствам США (FDA) и этические комитеты медцентров, клинические испытания могут начаться в начале 2017 года. Чуть позже, в марте 2017 года, группа исследователей из Пекинского университета также надеется начать три клинических испытания, в которых технология CRISPR/Cas9 будет использована для лечения рака мочевого пузыря, простаты и почечно-клеточного рака. Эти испытания, однако пока не были одобрены и не получили финансирование.
Новость
Система CRSIPR/Cas9 удалит вирусную информацию в геноме человека, зараженного ВИЧ
Автор
Редакторы
Генеральным спонсором конкурса, согласно нашему краудфандингу, стал предприниматель Константин Синюшин, за что ему огромный человеческий респект!
CRISPR/Cas9
Рисунок 1. Система CRISPR/Cas9 как один из вариантов бактериального иммунитета. а — Внедрение чужеродной ДНК в клетку бактерии. б — Приобретение спейсера. в — Транскрипция CRISPR-локуса. г — Образование guideРНК. д — Образование активного комплекса Cas9 + guideРНК. е — Связывание чужеродной ДНК. ж — Внесение двухцепочечного разрыва в ДНК. Сокращения см. в тексте.
Но затем в 2012 году бактериальную защитную систему взяли на вооружение ученые, ведь если соединить Cas9 с определенной РНК, то можно разрезать необходимый ген. Разрезанный ген запускает в клетке систему репарации, которая в буквальном смысле пытается соединить концы с концами. При этом происходят различные мутации репарируемого гена — в основном удаления, но бывают и разные вставки. Однако если мы предоставим матрицу для репарации, ген может вернуться к правильной форме. Так можно вносить любые изменения в геном. Это означает, что мы в теории можем лечить генетические заболевания, рак и не только. Сегодня мы поговорим о том, как CRISPR/Cas9 поможет решить проблему избавления от вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).
ВИЧ — возбудитель синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИДа) — относится к роду лентивирусов семейства ретровирусов, чей геном представлен двумя копиями одноцепочечной РНК, на двух концах которой находятся длинные концевые повторы (или по-английски long terminal repeat, LTR) [7]. В самой вирусной частице содержатся еще три фермента: протеаза, обратная транскриптаза и интеграза (рис. 2). Протеаза расщепляет продукты считывания вирусных генов с образованием зрелых белков.
Рисунок 2. Строение вириона ВИЧ. Частица покрыта липидным бислоем, происходящим из клеточной мембраны организма-хозяина, и усеяна молекулами вирусных гликопротеинов.
Жизненный цикл ВИЧ довольно прост (рис. 3). Вначале вирус инфицирует клетку, причем в качестве рецептора служит молекула CD4, а корецепторами становятся рецепторы хемокинов, поэтому поражаются клетки иммунной системы: T-лимфоциты (T-хелперы), моноциты, макрофаги, а также клетки мозга (макрофаги, микроглия, астроциты), клетки лимфоидной ткани желудочно-кишечного тракта и другие. Затем одноцепочечный РНК-геном с помощью обратной транскриптазы превращается в двухцепочечную ДНК, так называемую провирусную ДНК. Наконец интеграза встраивает двухцепочечную провирусную ДНК в геном хозяина. Эта встроенная информация считывается, причем промоторами (то есть местами, привлекающими РНК-полимеразу для транскрипции) служат длинные концевые повторы — LTR. Собираются новые вирусные частицы, поражающие новые клетки. В целом весь этот процесс приводит к частым мутациям вируса, особенно вариабельны поверхностные гликопротеины, в том числе поэтому частицы ВИЧ так неуловимы для нашего иммунитета [8], [9].
Рисунок 3. Жизненный цикл ВИЧ. 1 — зрелая вирусная частица; 2 — связывание с клеткой благодаря рецепторам; 3 — слияние мембран вируса и клетки; 4 — высвобождение вирусной РНК; 5 — превращение РНК в ДНК (обратная транскрипция); 6 — интеграция в геном клетки; 7 — считывание вирусной информации; 8 — сборка и выход вирусной частицы; 9 — новая вирусная частица.
Терапия ВИЧ
Рисунок 4. Удаление провируса из генома человека приведет к невозможности размножения и распространения вируса.
Современная высокоактивная антиретровирусная терапия основывается на ингибировании обратной транскриптазы, протеазы, интегразы, слияния вируса с клеткой, что значительно осложняет жизнь вируса. Но все же ВИЧ-инфекция в настоящий момент остается неизлечимым заболеванием, так как такая терапия никак не влияет на ДНК вируса у нас в геноме: у пациентов, принимающих антиретровирусную терапию, около 10 6 клеток содержат провирус. Сверх того, у пациентов могут быть серьезные побочные эффекты или устойчивость к антиретровирусной терапии [10].
Рисунок 5. Система CRISPR/Cas9, интегрированная в клетки, может препятствовать их заражению вирусом и интеграции вируса в геном.
Предложенная система протестирована японскими учеными в 2013 году на культуре клеток человеческих T-лимфоцитов [8]. В качестве мишени они предложили использовать LTR, а в них — разные участки, необходимые для связывания факторов инициации и элонгации транскрипции. Трехкратное внесение в клетки конструкции CRISPR/Cas9 снижало считывание вирусного генома почти в 3 раза (с 97,8% до 35,5%). Дальнейший анализ показал, что почти все клетки содержали в области провируса различные мутации.
Так как LTR — это концевые повторы, то разрезание с двух концов теоретически может привести к полному вырезанию встроенного в геном вирусного куска. И действительно — почти у трети клеток (31,8%) после трехкратного внесения системы CRISPR/Cas9 этот участок полностью удалялся.
А что насчет мутаций вируса? Ведь если целевой участок изменит свою структуру, система CRISPR/Cas9 не сможет его найти и обезвредить. Понимая это, ученые выбрали именно тот участок LTR, что содержит высококонсервативные последовательности ДНК, практически одинаковые у всех подвидов ВИЧ.
Не все так просто
Рисунок 6. Повышение специфичности разрезания гена с использованием никаз, вносящих одноцепочечные разрывы.
Предложенная система изменения генов не так чудесна, как может показаться на первый взгляд, как бы я ни старалась вас в этом убедить. Есть много подводных камней, которые требуют дальнейшего исследования.
Таким образом, стремительно развивающаяся генная терапия с использованием CRISPR/Cas9 — ключ к избавлению от ВИЧ-инфекции и ассоциированных с ней заболеваний и осложнений. Однако не стоит ожидать, что такое лекарство сегодня-завтра появится на прилавках в аптеке, ведь еще о многом стоит подумать, чтобы разработать действительно эффективное и безопасное лечение.
Китайские врачи опробовали CRISPR-отредактированные клетки на пациенте с ВИЧ-инфекцией и Т-клеточной лейкемией. После облучения больному ввели его собственные кроветворные клетки, в которых разрушили ген CCR5. Отредактированные клетки прижились в организме и образовали разные типы клеток крови. Серьезных побочных эффектов не возникло. Правда, защитить пациента от вируса они не смогли — из-за низкой эффективности редактирования. Статья опубликована в журнале New England Journal of Medicine.
В 2017 году Лей Сюй (Lei Xu) из Центра исследований стволовых клеток пекинского университета и его коллеги запустили небольшое клиническое исследование, чтобы попробовать создать устойчивость к ВИЧ в клетках крови с помощью CRISPR/Cas9. В своей статье ученые отчитываются о первом пациенте, который прошел их новую терапию. Кроме технологии редактирования, которую использовали китайские ученые, есть и еще одна деталь, которая отличает их эксперимент от исследования Sangamo Therapeutics. Китайцы забирали у пациента не Т-клетки, а стволовые клетки крови. Расчет был на то, что кроветворные клетки приживутся в красном костном мозге и будут постоянно поставлять в организм пациента устойчивые к ВИЧ Т-лимфоциты.
Ученые работали с 27-летним пациентом, у которого кроме ВИЧ-инфекции диагностировали еще и Т-клеточную лейкемию. Его планировали лечить лучевой терапией, которая убивает существенную часть клеток крови, и пересадка кроветворных клеток ему понадобилась бы в любом случае. Ученые решили совместить лечение с экспериментальной процедурой: после облучения ввели больному уже отредактированные собственные клетки. В этот момент антиретровирусную терапию пришлось прервать, чтобы можно было оценить результат эксперимента.
CRISPR-модифицированные клетки прижились в организме и не вызвали острого отторжения. С начала эксперимента прошло уже 19 месяцев, и клетки с разрушенным геном CCR5 все еще можно найти в крови пациента — причем не только Т-лимфоциты, но и другие клетки крови. Это значит, что отредактированные кроветворные клетки работают полноценно и производят разные типы клеток, у которых мутация сохраняется.
Тем не менее, полностью отредактировать кроветворение пациента не удалось. Среди всех клеток, которые ученые у него забрали для редактирования, внести изменения в геном получилось лишь у 17,8 процентов. После возвращения в организм новые клетки начали конкурировать со старыми за заселение красного костного мозга. И в течение всего времени наблюдения они составляли лишь 5-8 процентов от общей кроветворной популяции.
Тем не менее, авторы работы отмечают, что у их исследования есть и позитивный результат. Этот эксперимент — самое долгое на сегодняшний день наблюдение за CRISPR-отредактированными клетками в организме человека, и оно показывает, что такие клетки могут быть безопасны. Исследователи не обнаружили в клетках никаких незапланированных изменений (то есть следов нецелевого редактирования генома). Клетки также не превратились в опухолевые — о чем предупреждали некоторые ученые в 2018 году. Таким образом, китайская работа стала демонстрацией принципа: CRISPR-модифицированные клетки можно использовать в терапевтических целях без риска для пациента.
Поправка
FDA одобрило проведение I/II фазы клинических испытаний терапии ВИЧ-инфекции с помощью внутривенного введения CRISPR/Cas. Об этом сообщила на своем сайте компания Excision BioTherapeutics, которая будет проводить исследования. В клинических испытаниях, стартующих в конце 2021 года, медики оценят эффективность разных дозировок препарата на трех группах ВИЧ-инфицированных добровольцев.
Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) встраивается в геном T-лимфоцитов, потому что это требуется ему для размножения. После интеграции в хромосому ВИЧ использует РНК полимеразу клетки, чтобы в конечном итоге синтезировать вирионы и распространиться по организму. Именно из-за того, что ВИЧ встраивается в ДНК клеток, пока действенных способов избавления от него не придумали. Описаны лишь единичные случаи полного избавления пациента от ВИЧ за счет пересадки донорских клеток красного костного мозга.
Эффективным методом лечения ВИЧ-инфекции могла бы стать технология CRISPR/Cas, с помощью которой можно редактировать ДНК, так что встроенный вирус иммунодефицита можно было бы просто вырезать из генома. Испытания такого генетического редактирования уже проводили на мышах. Животным сначала вводили антиретровирусные препараты, которые помогли ослабить ВИЧ, а затем опробовали систему CRISPR/Cas. Стопроцентного успеха в лечении ученым добиться не удалось: полностью избавились от следов ДНК ВИЧ только две мыши из семи.
Исследования технологии CRISPR/Cas параллельно проводила другая команда ученых во главе с Камелем Халили (Kamel Khalili) из Медицинской Школы Льюиса Каца при Университете Темпл. Они тестировали технологию на макаках, зараженных вирусом иммунодефицита обезьян. Для доставки конструкции в клетки животных ученые использовали аденоассоциированный вирус 9 (AAV9), несущий информацию об эндонуклеазе Cas9, которая с помощью гидовых РНК узнает регионы Gag и LTR в вирусном геноме, а затем вырезает эти фрагменты из ДНК клеток.
Геном SIP, на котором отмечены сайты узнавания системой CRISPR/Cas
Mancuso et al / Nature Communications, 2020
Теперь Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) одобрило проведение клинических исследований геномного редактирования с помощью CRISPR/Cas. Технология сходна с той, что использовали в экспериментах на обезьянах, но нацелена на вирус иммунодефицита человека. Испытания лекарства, которое назвали EBT-101, начнутся в конце 2021 года. К исследованиям привлекут три группы ВИЧ-инфицированных, чтобы протестировать разные дозировки препарата. Также медики планируют разработать комбинации терапии CRISPR/Cas и других методов лечения.
Пока рано говорить о прорыве в терапии ВИЧ-инфекции, так как ученым предстоит еще доказать не только эффективность лечения системой CRISPR/Cas, но и ее безопасность. Побочные эффекты от применения EBT-101 медики будут оценивать в I/II фазе клинических испытаний.
В этом году впервые испытали генетическое редактирование с помощью CRISPR/Cas внутривенно. Шестеро пациентов, страдающих транстиретиновым амилоидоизом, хорошо перенесли лечение, а через месяц концентрации транстиретина у них в крови снизились на 50-90 процентов.
Читайте также: