Диагностика инфекционных заболеваний крс

Обновлено: 22.04.2024

Микроскопия (люминесцентная, световая, электронная)

Выделение вируса биопроба

Примечание. Для каждой болезни существует перечень показателей, по которым диагноз считают установленным.

Благодаря правильному и своевременному диагнозу удается обеспечить эффективность оздоровительных мероприятий, т. е. быстро купировать возникший эпизоотический очаг и предупредить дальнейшее распространение болезни.

Эпизоотологический метод. Представляет собой систему изучения проявлений эпизоотического процесса. Для характеристики последнего необходимо собрать точную информацию о восприимчивых видах, источнике и резервуаре возбудителя болезни, механизме его передачи, воротах инфекции, интенсивности проявления эпизоотического процесса, сезонности, предрасполагающих факторах, заболеваемости, смертности, летальности. Кроме того, особое внимание обращают на факторы, определяющие пути дальнейшего распространения заболевания — выполнение противоэпизоотических мероприятий и условия внешней среды.

Чтобы охарактеризовать эпизоотическое состояние хозяйства, сопоставляют и оценивают обобщенные эпизоотологические показатели, получаемые путем статистической обработки данных первичного учета заболеваний и профилактических мероприятий.

Клинический метод. При клиническом исследовании животных, подозреваемых в заболевании инфекционной болезнью, необходимо всегда строго соблюдать правила работы, предусмотренные соответствующей инструкцией.

Клиническое исследование рекомендуют начинать с измерения температуры тела животного. Далее осматривают животное в нефиксированном состоянии: обращают внимание на положение тела реакцию на различные раздражители, прием корма и воды, характер фекалий, особенности дефекации и мочеиспускания. Затем приступают к исследованию отдельных систем и органов по схеме, общепринятой в клинической диагностике болезней.

Клинические признаки инфекционной болезни зависят от многих факторов: вида и локализации возбудителя, течения, формы проявления и стадии болезни, резистентности организма и других причин. Во всех случаях клинические признаки одной и той же инфекционной болезни у животных даже одного вида сильно варьируют.

Патоморфологический метод. Включает в себя патологоанатомический и гистологический методы исследований. Патологоанатомический метод считают важным, но не всегда окончательным методом диагностики. Например, если при вскрытии трупа животного (птицы) отмечают характерные изменения — туберкулы, то сразу же диагностируют туберкулез, при обнаружении в селезенке свиньи краевых геморрагических инфарктов — чуму, кровоизлияний на границе мышечного и железистого желудка у кур — болезнь Ньюкасла и т. д.

Порядок патологоанатомического исследования: оценивают состояние трупа, кожи и слизистых оболочек, затем исследуют лимфатическую систему, серозные покровы, мышцы и суставы, органы дыхания, сердце и кровеносные сосуды, печень, селезенку, почки, глотку, пищевод, желудок, тонкий кишечник, толстый кишечник, мочевой пузырь, органы воспроизводства, головной и спинной мозг.

Однако во многих случаях наряду с патологоанатомическим применяют и метод лабораторных исследований (гистологических, бактериологических и др.). С помощью гистологического метода устанавливают точный диагноз при таких болезнях, как - бешенство (тельца Бабеша—Негри), ринопневмония (внутриядерные включения типа Коудри), оспа (тельца-включения).

Бактериологический метод. Это ценный метод диагностики инфекционных болезней. Для бактериологического исследования от больных или павших животных необходимо правильно взять патологический материал и грамотно оформить сопроводительный документ. Поступивший биоматериал обрабатывают в зависимости от предполагаемой болезни, делают мазки-отпечатки, красят их соответствующими методами, выделяют чистую культуру посевом на питательные (элективные) среды, заражают чувствительных лабораторных животных биоматериалом или выделенной чистой культурой (табл.1).

1. Бактериологический метод диагностики некоторых инфекционных болезней

На основании обнаружения патогенных микроорганизмов в поступившем материале устанавливают этиологический диагноз.

Вирусологический метод. Для вирусологического исследования в лабораторию направляют патологический материал от больных животных, взятый в период проявления у них клинических признаков (температурная реакция, угнетение, воспалительные процессы в верхних дыхательных путях, сопровождающиеся серозными или слизистыми истечениями из носовой полости, диарея, образование везикул, афт, иногда аборты), или вынужденно убитых (павших) животных, взятый не позднее чем через 2 ч после их гибели. Вирусологический метод диагностики включает в себя: обнаружение возбудителя в патологическом материале различными методами (электронная, люминесцентная или световая микроскопия, заражение культуры клеток, лабораторных животных и т. д.), выделение и идентификацию вируса в различных серологических реакциях, биопробу.

Гематологический метод. В лабораторию для гематологического исследования отправляют кровь, которую берут с соблюдением правил асептики из яремной вены в пробирки с антикоагулянтом— 10 %-м раствором трилона Б, гепарина, цитрата натрия из расчета 0,02 мл раствора на 1 мл крови.

Гематологический метод используют как вспомогательный, а при некоторых инфекционных болезнях (лейкоз крупного рогатого скота, инфекционная анемия лошадей) — в качестве основного метода диагностики. При лейкозе крупного рогатого скота диагноз основан на обнаружении в периферической крови повышения содержания лейкоцитов основного лимфоидного ряда в 1-10-3 мл крови, а при инфекционной анемии лошадей — на основании снижения содержания эритроцитов в 1 • 103 мл крови, гемоглобина и замедленной скорости оседания эритроцитов (СОЭ).

Иммунологический метод. Включает в себя серологическую диагностику — в лаборатории исследуют сыворотки крови для обнаружения антител и аллергическую пробу, с помощью которой в хозяйствах выявляют животных, больных туберкулезом, паратуберкулезом, бруцеллезом, сапом, реже — сибирской язвой, листериозом, туляремией.

Микроскопия (люминесцентная, световая, электронная)

Выделение вируса биопроба

Примечание. Для каждой болезни существует перечень показателей, по которым диагноз считают установленным.

1. Бактериологический метод диагностики некоторых инфекционных болезней

Патоморфологический метод. Включает в себя патологоанатомический и гистологический методы исследований. Патологоанатомический метод считают важным, но не всегда окончательным методом диагностики. Например, если при вскрытии трупа животного (птицы) отмечают характерные изменения — туберкулы, то сразу же диагностируют туберкулез, при обнаружении в селезенке свиньи краевых геморрагических инфарктов — чуму, кровоизлияний на границе мышечного и железистого желудка у кур — болезнь Ньюкасла и т. д.

Однако во многих случаях наряду с патологоанатомическим применяют и метод лабораторных исследований (гистологических, бактериологических и др.). С помощью гистологического метода устанавливают точный диагноз при таких болезнях, как - бешенство(тельца Бабеша—Негри), ринопневмония (внутриядерные включения типа Коудри),оспа(тельца-включения).

Бактериологический метод. Это ценный метод диагностики инфекционных болезней. Для бактериологического исследования от больных или павших животных необходимо правильно взять патологический материал и грамотно оформить сопроводительный документ. Поступивший биоматериал обрабатывают в зависимости от предполагаемой болезни, делают мазки-отпечатки, красят их соответствующими методами, выделяют чистую культуру посевом на питательные (элективные) среды, заражают чувствительных лабораторных животных биоматериалом или выделенной чистой культурой (табл. 9.1).

Таблица 9.1 - Бактериологический метод диагностики некоторых инфекционных болезней

Выделение культуры на питательных средах

Световая: окраска по Грамму, на капсулы по Гимзе или синькой Леффлера.

Световая: окраска по Грамму или Муромцеву

МПБ, МПА, среда Китта-Тароцци, Цейслера

Световая: окраска по Цилю-Нельсону.

Среда Петраньяни, Левенштейна-Йенсена, Сатона, Школьниковой, ФАСТ - 3

Кролик, морские свинки, куры

ПЖА, СЖН, МППА, среда Китта-Тароцци, агар Мартена

Беременные морские свинки

Световая: окраска по Грамму, Романовскому-Гимзе, Муромцеву

среда Китта-Тароцци, МПБ, МПА

Световая: окраска по Грамму, синькой Леффлера, по Романовскому - Гимзе

МПБ, МПА с 2…4% глицерина

Золотистые хомячки или морские свинки

Световая окраска по Стампу, Козловскому, Шуляку – Шину.

МППБ, ПГГБ, МППГА, ПГГА

Вирусологический метод. Для вирусологического исследования в лабораторию направляют патологический материал от больных животных, взятый в период проявления у них клинических признаков (температурная реакция, угнетение, воспалительные процессы в верхних дыхательных путях, сопровождающиеся серозными или слизистыми истечениями из носовой полости, диарея, образование везикул, афт, иногда аборты), или вынужденно убитых (павших) животных, взятый не позднее чем через 2 ч после их гибели. Вирусологический метод диагностики включает в себя: обнаружение возбудителя в патологическом материале различными методами (электронная, люминесцентная или световая микроскопия, заражение культуры клеток, лабораторных животных и т. д.), выделение и идентификацию вируса в различных серологических реакциях, биопробу.

Гематологический метод. В лабораторию для гематологического исследования отправляют кровь, которую берут с соблюдением правил асептики из яремной вены в пробирки с антикоагулянтом— 10 %-м раствором трилона Б, гепарина, цитрата натрия из расчета 0,02 мл раствора на 1 мл крови.

Иммунологический метод. Включает в себя серологическую диагностику — в лаборатории исследуют сыворотки крови для обнаружения антител и аллергическую пробу, с помощью которой в хозяйствах выявляют животных, больных туберкулезом, паратуберкулезом, бруцеллезом, сапом, реже — сибирской язвой, листериозом, туляремией. При лабораторной диагностике инфекционных болезней, вызываемых бактериями, применяются основные методы исследований:

1. Бактериоскопический - приготовление мазков, окраска по Граму, специальными методами и микроскопирование под иммерсионной системой микроскопа.

2. Бактериологический - посев на обычные, специальные питательные среды для выделения, изучения культуральных и биохимических свойств чистой культуры возбудителя болезни.

3. Биологический - определение патогенности выделенных микроорганизмов (постановка биопробы), заражение лабораторных животных.

4. Серологический - идентифицирование бактерий по сыворотке крови, взятой от больных животных и переболевших животных в различных серологических реакциях: реакция агглютинации (РА), реакция преципитации (РА), реакция гемагглютинации (РГА), реакция диффузной преципитации (РДП), реакция иммунофлюарисценции (РНФ), реакция пассивной гемагглютинации (РПГА), реакция нейтрализации и др.

Для диагностики вирусных болезней животныхиспользуют различные методы лабораторных исследований. Все методы лабораторной диагностики вирусных болезней животных делят на три группы:

2. Вирусологические методы.

3. Методы ретроспективной диагностики.

1. Экспресс-методы основаны главным образом на быстром обнаружении в патматериале гемагглютининов в реакции гемагглютинации, вируса или его антигенов с помощью:

2. Серологических тестов: реакций иммунофлуоресценции (РИФ), связывания комплемента (РСК), иммуноферментного анализа (ИФА), диффузионной преципитации в геле (РДП).

3. Световой микроскопии.

4. Электронной микроскопии.

5. Вирусологические методы основаны на изоляции активных форм вирусов из патматериала и их идентификации в серологических реакциях. Вирусологические методы длительны и трудоемки, но дают точный ответ о возбудителе болезни.

Для выделения вируса приготовленной из патматериала суспензией заражают чувствительные объекты, в качестве которых используют восприимчивых и лабораторных животных, куриные эмбрионы, культуры клеток. Выбор чувствительной системы и методы ее заражения зависят от ее чувствительности к выделяемому вирусу и его тропизма.

Идентификация вируса. Она основывается главным образом на реакциях антиген-антитело. В них используются известные специфические диагностические сыворотки, каждая из которых нейтрализует только определенный вирус.

Выбор серологической реакции для окончательной идентификации вируса определяется в основном свойствами самого вируса. При наличии у вируса гемагглютинирующих свойств его идентифицируют в реакции торможения гемагглютинации (РТГА), если вирус проявил гемадсорбирующие свойства в культуре клеток – в РТГАд (реакция торможения гемадсорбции). При отсутствии названных свойств у выделенного вируса его надежно идентифицируют в РН (реакция нейтрализации), РСК (реакция связывания комплемента), РДП (реакция диффузионной преципитации в геле).

Результаты вирусологических исследований считают положительными при наличии клинических проявлений у животных того же вида, от которого был взят исследуемый материал. При экспериментах в куриных эмбрионах или культуре клеток проводится доказательство этиологической роли выделенного вируса. Установление нарастания титра антител к выделенному вирусу в парных сыворотках от животных, послуживших источником получения патологического материала, является доказательством этиологической роли выделенного вируса.

Все серологические реакции основаны на взаимодействии антигенов со специфическими им (гомологичными) антителами.

Реакция нейтрализации (РН) – наиболее универсальная высокоспецифичная реакция, поэтому она служит эталоном при оценке других реакций в вирусологии. Принцип ее состоит в том, что при смешивании вируса с сывороткой, содержащей специфические антитела, вирус теряет инфекционные свойства, то есть возможность репродукции в чувствительных клетках. Смесь вируса и сыворотки испытывают на чувствительной к данному вирусу системе (лабораторных животных, куриных эмбрионах, культурах клеток). Биологическую систему и метод ее заражения подбирают с учетом наилучшего культивирования используемого в реакции вируса.

Реакция торможения (задержки) гемагглютинации (РТГА, РЗГА) основана на нейтрализации антителами при встрече с гомологичным вирусом (антигеном) не только его инфекционной, но и гемагглютинирующей активности в результате блокирования рецепторов вирионов, ответственных за гемагглютинацию и образования с ними комплекса антиген + антитело.

Принцип РТГА состоит в том, что в пробирке смешивают равные объемы сыворотки крови и суспензии вируса и после экспозиции определяют, сохранился ли в смеси вирус путем добавления суспензии эритроцитов. Агглютинация эритроцитов указывает на наличие, а отсутствие гемагглютинации – на отсутствие вируса в смеси. Исчезновение вируса из смеси вирус + сыворотка – признак взаимодействия антител сыворотки и вируса.

Реакция гемадсорбции и ее задержка (РГАД и РЗГАД) Гемадсорбция – соединение эритроцитов с поверхностью пораженных вирусом клеток. В основе этого явления лежит родство рецепторов вируса, находящихся на поверхности пораженной клетки, с рецепторами эритроцита, что приводит к их взаимному сцеплению аналогично реакции гемагглютинации.

Реакция диффузионной преципитации в геле (РДП) (синонимы: реакция гель-преципитации, реакция двойной диффузии в геле) основана на способности к диффузии в гелях антител и растворимых антигенов и отсутствии такой способности у комплекса антиген + антитело. Комплекс антиген + антитело образуется при контакте диффундирующих навстречу друг другу гомологичных антигена и антитела. Он осаждается на месте образования в толще геля в виде беловатой полосы преципитации, хорошо заметной на фоне прозрачного геля.

Реакция связывания комплемента (РСК) – одна из традиционных серологических реакций, применяемых для диагностики многих вирусных болезней: ящура, КЛО, АЧЛ, вирусной диареи КРС, аденовирусной инфекции, гриппа. В основе реакции лежит связывание комплемента специфическим комплексом антиген + антитело и выявление этого феномена с помощью индикаторной (гемолитической) системы – смеси бараньих эритроцитов и антисыворотки к ним – гемолизина. Если исследуемый антиген гомологичен антителам, то образуется комплекс антиген + антитело и комплемент ими связан. В силу этого лизиса эритроцитов не происходит – положительная РСК (эритроциты находятся во взвеси – жидкость мутная, красного цвета). Если антиген не гомологичен антителам, комплекс не образуется, свободный комплемент лизирует эритроциты – отрицательная РСК (лизис эритроцитов – жидкость прозрачная, красного цвета). Между этими двумя крайними результатами может быть задержка гемолиза разной степени выраженности.

Метод флуоресцирующих антител (МФА), или реакция иммунофлуоресценции (РИФ). Принцип данного метода заключается в том, что антитела, соединенные с флуорохромом (коньюгат), сохраняют способность вступать в специфическую связь с гомологичным антигеном. Образующийся комплекс антиген + антитело обнаруживают под люминисцентным микроскопом по характерному свечению благодаря присутствию в нем флуорохрома.

Метод иммуноферментного анализа (ИФА). Для идентификации вирусспецифического антигена иммуноферментный тест применяют в двух вариантах: гистохимическом и твердофазном.

Гистохимический вариант ИФА, или иммунопероксидазная реакция

Иммунопероксидазная реакция аналогична методу иммунофлуоресценции, но отличается тем, что для постановки реакции используют антитела, меченные не флуорохромом, а ферментом – пероксидазой, и учет результатов реакции проводят не под люминисцентным микроскопом, а под обычным микроскопом.

Иммунопероксидазную реакцию ставят в прямом и непрямом вариантах.

Методы твердофазного иммуноферментного анализа.

Они основаны на применении антител (антигенов), фиксированных на нерастворимых носителях. В качестве носителей используют стеклянные или нейлоновые шарики, полистироловые или керамические пробирки или микропанели.

Респираторные болезни молодняка крупного рогатого скота наносят огромный экономический ущерб промышленному скотоводству. Наиболее часто этиологическую роль в возникновении данной патологии играют вирусы, содержащие в своем составе РНК: респираторно-синцитиальная инфекция, Она способна вызывать поражение респираторного тракта и лимфоидной системы восприимчивых животных.

При планировании профилактических мероприятий большая роль принадлежит оперативной и точной лабораторной диагностике, направленной на расшифровку этиологической структуры конкретной вспышки респираторных болезней и выяснения этиологической роли каждого инфекционного агента.

Для диагностики вирусных инфекций наиболее пригодны простые методы, позволяющие быстро исследовать большое число проб биоматериала. Помимо установления этиологии заболевания, лабораторная диагностика имеет существенное значение в организации противоэпизоотических мероприятий. Ранняя диагностика первых случаев проявления вирусных болезней позволяет своевременно организовать и провести профилактические мероприятия. Реализация программ вакцинации вирусных инфекций, а также программ их эрадикации, которые реализуются в некоторых странах Европы, невозможны без тщательно спланированных программ диагностических исследований, роль которых при респираторных болезнях животных постоянно возрастает.

В связи с тем, что многие возбудители вирусной природы могут постоянно присутствовать в популяции восприимчивых животных, в лабораторной диагностике вирусных инфекций используются три основных принципа:

1. Выявление антигенов вируса или его нуклеиновых кислот непосредственно в исследуемом материале от животных;
2. Выделение и идентификация вирусов из проб биоматериала от больных животных;
3. Ретроспективная серологическая диагностика болезней, основанная на установлении диагностического (4-х и более кратного) прироста титров специфических антител к вирусам при исследовании парных проб сыворотки крови (сероконверсиия), свидетельствующая об активной вирусной инфекции.

При любом выбранном подходе к лабораторной диагностике вирусных инфекций основным требованием являются сроки отбора и качество биоматиериала, отобранного от животных. Для прямого анализа проб биоматериала или выделения вируса исследуемый материал должен быть получен в самом начале заболевания, когда возбудитель еще выделяется от инфицированного животного в относительно больших количествах и не связан с антителами. Объем проб должен быть достаточен для проведения прямого исследования. Важно также определить источник отбора проб биоматериала в соответствии с предполагаемым заболеванием, т. е. тех органов или тканей организма, в которых, исходя из патогенеза болезни, вероятность присутствия вируса наиболее высока. Большую роль в успешной диагностике играют условия транспортировки биоматериала, вид транспортной среды и его хранение. Пробы биоматериала должны отбираться не позднее 4-х часов после гибели или вынужденного убоя животных и транспортироваться в диагностическую лабораторию в замороженном состоянии в термосе со льдом.

Для установления сероконверсии первая проба сыворотки крови должна отбираться на ранних стадиях проявления болезней (не позднее 3-5 дней после появления первых клинических признаков), а вторая в период выздоровления или реконвалесценции через 3-4 недели после отбора первой пробы. Первая проба хранится в замороженном виде до взятия второй, транспортируются они в лабораторию вместе, где исследуются одномоментно. Пробы сыворотки крови должны отбираться в стерильные пробирки, не должны быть гемолизированы, контаминированы бактериальной флорой и не содержать консервантов. Транспортировка их должна осуществляться в замороженном виде в термосе со льдом.

Прямые методы диагностики вирусных болезней -- это методы, позволяющие обнаружить вирус, его антиген или нуклеиновую кислоту непосредственно в пробах биологического материала, являющиеся наиболее быстрыми (2--24 ч). К ним относятся: электронная микроскопия, метод флуоресцирующих антител (МФА), иммуноферментный анализ (ИФА), радиоиммунный анализ (РИА) и полимеразная цепная реакция (ПЦР). Однако эти методы имеют свои ограничения, поскольку существует возможность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Поэтому они требуют подтверждения непрямыми методами. Как правило, использование этих методов регламентируется массовыми (скрининговыми) исследованиями, а результаты их носят предварительный характер. вирусный инфекция иммуноферментный антиген

Непрямые методы диагностики вирусных болезней. К ним относятся: выделение и идентификация вирусов в чувствительных биологических системах (культуры клеток, куриные эмбрионы, лабораторные животные), а также реакция нейтрализации вируса, проводимая с использованием этих же систем.

Выделение вируса по-прежнему остается стандартным или референтным методом вирусологической диагностики и дает информацию для решения многих вопросов. С использованием этого метода удается расшифровать этиологию болезни, установить циркуляцию вирусов среди обследуемой популяции крупного рогатого скота, получить информацию об эпизоотической ситуации в стаде животных на конкретной территории. Однако он является дорогостоящим и трудоемким.

Для исследования от больных животных отбирают носовые выделения, смывы и соскобы с носовой полости, сыворотку крови, от погибших -- кусочки слизистой носа, трахеи, бронхов, легких, а также регионарные лимфоузлы. Патологический материал направляют в термосе со льдом. Из соскобов слизистой оболочки носа, трахеи, бронхов делают мазки, а из кусочков легкого -- мазкиотпечатки для иммунофлюоресцентного исследования. Из кусочков органов готовят суспензию для заражения культур клеток и приготовления комплемент связывающего и преципитирующего антигенов.

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ, ИФА (Enzyme immunoassay) -- метод выявления антигенов и антител, основанный на определении комплекса антиген-антитело за счет введения в один из компонентов реакции ферментативной метки с последующей ее детекцией с помощью соответствующего субстрата, изменяющего свою окраску. Основой проведения любого варианта ИФА служит определение продуктов ферментативных реакций при исследовании тестируемых образцов в сравнении с негативными и позитивными контролями.

Для определения антигенов и антител применяются твердофазный (гетерогенный) вариант иммуноферментного анализа. Использование твердой фазы позволяет упростить процесс разделения компонентов реакции за счет иммобилизации одного из компонентов на твердой фазе и удаления субстанций, не участвующих в реакции.

Иммуноферментный анализ по сравнению с другими методами детекции антигенов и антител обладает следующими преимуществами:

-- высокой чувствительностью, позволяющей выявлять концентрации до 0,05 нг/мл. Такая чувствительность метода определяется способностью одной молекулы фермента катализировать превращение большого числа молекул субстрата;
· возможностью использовать минимальные объемы исследуемого материала;
-- стабильностью при хранении всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА (до года и более);
-- простотой проведения реакции;
-- наличием как инструментального (в качественном и количественном варианте), так и визуального учета;
-- возможностью автоматизации всех этапов реакции
-- относительно низкой стоимостью диагностических наборов.

Вышеперечисленные преимущества определили широкое применение ИФА во всех областях медицины, в том числе и при диагностике, профилактике и изучении вирусных гепатитов . Диагностические препараты для ИФА, предназначенные для выявления большинства серологических маркеров инфицирования вирусами гепатитов А, В, С и D выпускаются различными предприятиями и фирмами как у нас в стране, так и за рубежом.

В качестве твердой фазы в большинстве коммерческих диагностических препаратов используют полистироловые 96-ти луночные планшеты или полистироловые шарики [фирмы “ДИА-плюс”, “Рош” (“ROCHE”), “ЭББОТТ” (“АВВОТТ”)]. Основные требования, предъявляемые к твердой фазе при проведении ИФА, включают: устойчивость к растворам, используемым в реакции;

наличие высокой специфической емкости, т. е. способности сорбировать на своей поверхности антитела или антигены в количествах, необходимых для проведения реакции в сочетании с как можно меньшей неспецифической сорбцией белков из исследуемых образцов и коньюгатов.

Наиболее распространенным способом иммобилизации антител или антигенов является адсорбция, когда часть молекул за счет ионных и гидрофобных взаимодействий, а также образования водородных связей присоединяется к поверхности твердой фазы.

В настоящее время разработаны различные варианты твердофазного иммуноферментного анализа, и практически все они были апробированы или применены для выявления маркеров инфицирования вирусами гепатитов А, В, С, D и Е. Наиболее простой схемой проведения ИФА является “сэндвич”-метод. Общая схема проведения метода заключается в следующем . На твердой фазе адсорбированы антитела к исследуемому антигену После инкубации исследуемого материала и образования комплекса антитело -- антиген проводится удаление несвязавшихся компонентов, добавляется коньюгат, т. е. антитела к искомому антигену, меченые ферментом. По завершении инкубации с последующим удалением непрореагировавшего коньюгата промывкой образуется комплекс, в котором антиген как бы заключен между двумя слоями антител. Наличие меченных ферментом антител определяется при помощи соответствующего субстрата. “Сэндвич”-метод используется для выявления HBsAg, HBeAg, антигена вируса гепатита А. Для ускорения “сэндвич”-метода, применяется его модификация -- “одностадийный сэндвич-метод”, при которой добавление исследуемого материала и коньюгата проводится одновременно. При использовании диагностических наборов ИФА, основанных на этой схеме проведения реакции, необходимо помнить, что в исследуемом образце не должно быть веществ, ингибирующих активность фермента, т. н. ферментных ядов, (например, азида натрия, применяемого в качестве консерванта). Одной из особенностей этого метода является снижение оптической плотности ферментативной реакции с образцами, имеющими крайне высокую концентрацию исследуемого антигена за счет образования комплекса HBsAg и коньюгата в растворе. Однако тщательный подбор концентрации меченых антител в коньюгате представляемого диагностического набора устраняет возможность получения ложнонегативных результатов с образцами, имеющими высокую концентрацию HBsAg.

Для выявления антител к различным антигенам вирусов гепатитов А, В, С и D применяются разнообразные варианты постановки ИФА, основными из которых являются:

Инфекционные заболевания весьма часто встречаются в ветеринарной практике. Для владельца животного важно вовремя обратить внимание на симптомы недомогания питомца. Для большинства инфекционных заболеваний эти симптомы неспецифичны: угнетение, отказ от корма, повышенная температура тела, рвота, понос; при некоторых заболеваниях встречается хромота и опухание суставов; возможно изменение цвета мочи.

Для ветеринарного врача, к которому приводят заболевшее животное, важно составить список дифференциальных диагнозов и исключить (или подтвердить) их специальными методами диагностики. Однако стоит помнить, что выбор диагностического метода будет зависеть от вида возбудителя, его локализации и стадии заболевания. Методика, применимая для диагностики одной инфекции, совершенно неприемлема для диагностики другой.

В данной статье представлен обзор основных методов диагностики инфекционных заболеваний, которыми располагает современная ветеринарная медицина.

1. Культивирование

Возбудители многих заболеваний, как правило, достаточно требовательны к питательным средам и достаточно сложны для культивирования invitro. Не для всех возбудителей определены условия культивирования. В некоторых случаях используют синтетические или полусинтетические среды – однако при этом рост возбудителей очень медленный (до нескольких месяцев) и всегда присутствует значительный риск грибковой или бактериальной контаминации, несмотря строгое соблюдение асептики. Кроме того, проведение работ по культивированию возможно только в специализированных микробиологических лабораториях. Поэтому в ветеринарии данный метод не нашел широкого применения при диагностике инфекционных заболеваний; работы, связанные с культивированием возбудителей, проводятся, как правило, только в специальных исследовательских институтах с целью их более детального изучения и разработки диагностических тест-систем.

2. Световая микроскопия

1) Микроскопия фиксированных окрашенных препаратов

Является наиболее доступным и потому распространенным методом диагностики инфекционных (особенно трансмиссивных) заболеваний в ветеринарной медицине. Основан на выявлении возбудителя в клиническом материале по характерной морфологии. Однако, несмотря на свою простоту и доступность, у этого метода есть свои недостатки.

Во-первых, у метода световой микроскопии достаточно ограниченная чувствительность. При незначительном количестве возбудителей в материале результат микроскопии может быть отрицательным.

Во-вторых, необходимо тщательное приготовление и окраска мазков для минимизации возможных артефактов.

В-третьих, лаборанту или врачу, интерпретирующему мазок, требуется достаточный опыт и хорошее знание морфологии как клеток тканей, так и возбудителей и умение отличать последних от возможных рефракционных артефактов или преципитатов красителя. И, в-четвертых, точное определение вида возбудителя при использовании только световой микроскопии возможно далеко не всегда. Поэтому световую микроскопию стараются дополнять другими методами диагностики, основанными на обнаружении специфических антител либо генетического материала возбудителя.

2)Темнопольная микроскопия

Вид оптической микроскопии, в которой контраст изображения увеличивают за счет регистрации только света, рассеянного изучаемым образцом. Как правило, используется для обнаружения спирохет - боррелий и лептоспир. Из-за необходимости наличия специального оборудования в рутинной ветеринарной практике применяется редко. Кроме того, с помощью темнопольной микроскопии невозможно определить видовую принадлежность возбудителя и его патогенность.

3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод ферментативного получения ампликонов (большого количества копий) исследуемых фрагментов ДНК путем повторных циклов репликации и денатурации (разделения цепи ДНК на отдельные нити); при этом происходит копирование только исследуемого участка ДНК (при условии его присутствия в данном образце), поскольку только этот участок соответствует заданным условиям.

Метод ПЦР идеально подходит для обнаружения микроорганизмов, трудно визуализирующихся, медленно растущих или сложных в культивировании. ПЦР является наиболее предпочтительным методом для диагностики заболевания в острый период. Основным лимитирующим фактором при использовании ПЦР является содержание в исследуемой пробе достаточного количества материала (нуклеиновой кислоты возбудителя). Для многих возбудителей известно, что их количество в крови меняется с течением времени; таким образом, в какой-то момент времени ПЦР может показать ложноотрицательный результат у инфицированного пациента. Таким образом, для врача крайне важно знать тропность возбудителя к тканям организма и отправлять на исследование тот материал, в котором вероятность обнаружения возбудителя наиболее высока (например, мочу – при диагностике лептоспироза, плаценту или пунктат семенников при подозрении на бруцеллез, синовиальную жидкость - при исследовании на боррелиоз).

4. Серологические методы диагностики

Данные методы основаны на выявлении у животных специфических антител. Заражение инфекционным агентом, если оно происходит впервые, в течение недели вызывает у животного умеренный рост иммуноглобулинов класса М (IgM) и постепенное увеличение иммуноглобулинов класса G (IgG), которое достигает пика через 14 дней. Определение уровня антител у животных с остро начинающимся заболеванием (таким как бабезиоз) дает мало полезной диагностической информации. Для диагностики хронических заболеваний (например, моноцитарного эрлихиоза) измерение уровня антител будет более полезным.

Продукция антител у каждого животного может сильно варьироваться; этот процесс зависит от возраста, иммунного статуса и генетической принадлежности. Лучший способ оценки степени сероконверсии заключается в исследовании парных сывороток, взятых с интервалом в 2-3 недели. Растущий титр антител указывают на недавнюю и, следовательно, клинически значимую инфекцию, особенно если это подтверждается соответствующими клиническими признаками. Альтернативным методом определения недавней инфекции является измерение уровня IgM, однако в ветеринарной практике данный метод практически не используется.

1) Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA)

Принцип метода заключается в том, один их специфических реагентов (антиген) иммобилизуют на твердой фазе. Затем последовательно добавляют другие специфические реагенты, проводя после инкубации каждого из них промывку с целью удаления несвязавшихся компонентов. Один из специфических реагентов, так называемый конъюгат, содержит ферментную метку. Для визуализации результата в конце реакции добавляют хромогеновый субстрат. Через определенный промежуток времени реакцию останавливают и проводят считывание на спектрофотометре.

Для определения титра антител в сыворотке готовят несколько последовательных разведений; титр антител определяется как обратный последнему видимому разведению (к примеру, если последнее разведение было 1:2000, то титр антител составит 2000). Метод твердофазного ИФА является наиболее предпочтительным для определения наличия антител к возбудителям, антигены которых легкодоступны (т.е. это либо легко культивируемые микроорганизмы, либо те, для которых получены рекомбинантные антигены). Кроме того, он может использоваться и для выявления антигенов возбудителя – например при диагностике инвазии Dirofilariaimmitisили вируса лейкемии кошек.

Для использования полноценного твердофазного иммуноферментного анализа необходимо наличие специального лабораторного оборудования. Однако существует экспресс-модификация ИФА (SNAP, IDEXX Laboratories), где антиген/антитела иммобилизированы не на плашке, а на мембранном фильтре. Эти тесты широко используются в клиниках для диагностики трансмиссивных заболеваний (лейшманиоза, дирофиляриоза, анаплазмоза, эрлихиоза и боррелиоза). Однако они не дают возможность зафиксировать рост или снижение титра антител, а также определить их принадлежность к M или G классу.

2) Метод флюоресцирующих антител (МФА, IFA)

В случае, когда культивирование микроорганизма сопряжено с техническими сложностями либо небезопасно, применяют метод иммунофлюоресценции. При этом может быть обнаружен как сам организм в зараженных клетках и тканях пациента (прямой МФА) либо наличие в сыворотке специфичных антител (непрямой МФА). В непрямом МФА зараженные клетки (как правило, культурального происхождения) зафиксированы на предметных стеклах либо планшетках. Сама процедура исследования схожа с таковой в ИФА. Однако в конъюгате вместо фермента здесь используется специальный краситель, дающий при определенной длине волны флюоресцентное свечение, которое можно видеть в специальный микроскоп. Количество антител также определяется по последнему разведению, давшему положительный результат.

Прямой МФА считается менее чувствительным; используется в тех случаях, когда число зараженных клеток невелико (например, для выявления в мазках крови морул Anaplasmaphagocytophilum).

3) Иммуноблот (вестерн-блот)

Таким образом, в статье были рассмотрены основные методы, применяемые сегодня для диагностики инфекционных заболеваний животных. Особое внимание хотелось бы уделить тому, что не существует какого-либо универсального метода для диагностики того или иного заболевания. Поэтому от врача при постановке диагноза требуется комплексный подход; необходимо учитывать анамнез, длительность заболевания, клинические признаки и данные общих лабораторных исследований.

Кроме того, необходимо умение правильно интерпретировать результаты – ведь даже обнаружение антител (особенно класса G) к тому или иному возбудителю не говорит о том, что именно этот этиологический агент является причиной нынешнего состояния животного. Только грамотное применение и интерпретация специальных методов исследования (не только при диагностике трансмиссивных заболеваний) в сочетании с клинической картиной дает возможность правильно поставить диагноз и назначить адекватное лечение.

Читайте также: