Диагностикум для выделения стрептококков

Обновлено: 17.04.2024

Для определения чувствительности стрептококков используют следующие питательные среды:

Для методов серийных разведений в бульоне необходимо использовать бульон Мюллера-Хинтон с добавлением 2,0 - 5,0 % лизированной лошадиной крови. Кровь лизируют замораживанием-оттаиванием с последующим центрифугированием для освобождения от теней эритроцитов.
Для методов серийных разведений в агаре и ДДМ используют агар Мюллера-Хинтон с добавлением 5 % дефибринированной бараньей крови.

Указанные добавки асептически вносят в питательную основу после автоклавирования и охлаждения до 48 - 50 °С.

Определение чувствительности Streptococcus pneumoniae

Бета-лактамные антибиотики (в частности пенициллин) являются препаратами выбора для терапии пневмококковых инфекций. В то же время критерии интерпретации результатов определения чувствительности пневмококков к этим препаратам постоянно пересматриваются в связи с появлением новых клинических и экспериментальных данных об эффективности различных бета-лактамов при пневмококковых инфекциях, вызванных штаммами с различным уровнем чувствительности к пенициллину.

Механизм резистентности S.pneumoniae к пенициллину и другим бета-лактамным антибиотикам обусловлен изменением пенициллиносвязывающих белков (ПСБ) клеточной стенки. В результате ступенчатых мутаций уменьшается сродство ПСБ к бета-лактамным антибиотикам.

При этом установлено, что при лечении инфекций дыхательных путей, вызванных штаммами S.pneumoniae с промежуточным уровнем резистентности к пенициллину, бета-лактамные антибиотики остаются клинически эффективными, но применение их при менингите приводит к неудаче терапии.

В связи с этим при разработке критериев интерпретации результатов определения чувствительности S.pneumoniae к бета-лактамным антибиотикам было проведено подразделение штаммов по источникам выделения (инфекции дыхательных путей, ликвор) и пересмотрены критерии оценки чувствительности к амоксициллину, цефотаксиму и цефтриаксону. Критерии интерпретации результатов определения чувствительности к пенициллину не пересмотрены.

Следует обратить внимание на несколько важных особенностей определения чувствительности S.pneumoniae:

невозможность определения чувствительности к бета-лактамным антибиотикам (пенициллину, аминопенициллинам, цефалоспоринам, карбапенемам) ДДМ;
невозможность определения чувствительности S.pneumoniae к АБП методом разведений в агаре.

Поэтому определение чувствительности пневмококков к пенициллину и другим бета-лактамным антибиотикам подразумевает последовательное (выделение S.pneumoniae из нестерильных локусов) или одновременное (при тяжелых инфекциях, выделении пневмококков из крови и ликвора) выполнение двух исследований:

Скрининг с диском, содержащим 1,0 мкг оксациллина, с целью выявления возможной пенициллинорезистентности. Скрининговый метод позволяет разделить микроорганизмы на две группы: группу чувствительных штаммов и группу, в которую входят часть чувствительных, а также умеренно-резистентные и резистентные штаммы пневмококков.
Определение МПК пенициллина и других бета-лактамных антибиотиков методом разведений в бульоне или с помощью Е-тестов у штаммов, отнесенных ко второй группе по результатам скрининга.

Скрининг на наличие пенициллинорезистентности у штаммов S.pneumoniae

Постановка теста

Методика проведения исследования не отличается от обычной процедуры определения чувствительности пневмококков к АБП ДДМ.

Интерпретация результатов

При выявлении диаметра зоны подавления роста штамма пневмококка вокруг диска с 1 мкг оксациллина ≥ 20 мм, S.pneumoniae расценивается как чувствительный ко всем бета-лактамным антибиотикам.
При выявлении диаметра зоны подавления роста < 20 мм необходимо определение МПК всех бета-лактамных антибиотиков (пенициллина, аминопенициллинов, цефалоспоринов II - IV поколенй, карбапенемов) методами серийных разведений в бульоне или с помощью Е-тестов.

Макролиды и линкозамиды

Вторыми по значимости в лечении пневмококковых инфекций являются макролидные и линкозамидные антибиотики. Оценка чувствительности S.pneumoniae к перечисленным антибиотикам возможна как диско-диффузионным методом, так и методом серийных разведений. В связи с разнообразием механизмов устойчивости S.pneumoniae к макролидам в повседневной практике могут встречаться различные варианты перекрестной резистнетности микроорганизмов к АБП этой группы.

Однако в практических целях для характеристики чувствительности S.pneumoniae к рассматриваемой группе АБП достаточно оценить чувствительность к эритромицину и клиндамицину, что позволяет дифференцировать два основных фенотипа:

MLS_B - перекрестная устойчивость ко всем макролидам, линкозамидам и стрептограминам В, обусловленная метилированием мишени действия препаратов.
М - устойчивость к 14- и 15-членным макролидам (при сохранении чувствительности к 16-членным макролидам, линкозамидам и стрептограминам), обусловленная активным выыедением АБП.

Фторхинолоны

Традиционные фторхинолоны (пефлоксацин, офлоксацин, ципрофлоксацин и ломефлоксацин) не являются адекватными для лечения пневмококковых инфекций, соответственно, оценивать чувствительность к этим препаратам нецелесообразно. В последние годы в лечении пневмококковых инфекций важное место заняли антипневмококковые фторхинолоны (левофлоксацин, спарфлоксацин, моксифлоксацин и гатифлоксацин). Частота устойчивости к перечисленным препаратам минимальна, однако, поскольку между ними не наблюдают полной перекрестной резистентности, возникает необходимость включения в исследование всей группы.

АБП других групп

Из антибиотиков других групп для лечения пневмококковых инфекций применяют ко-тримоксазол, хлорамфеникол, тетрациклины. Однако роль перечисленных препаратов в последние годы резко снижается в связи с нарастанием устойчивости, меньшей клинической эффективностью в сравнении с бета-лактамами, макролидами и антипневмококковыми фторхинолонами, также значительным числом нежелательных эффектов.

Для лечения тяжелых пневмококковых инфекций, вызванных штаммами с высоким уровнем устойчивости к антибактериальным препаратам других групп, в ряде случаев рекомендуется ванкомицин.

Критерии интерпретации результатов определения чувствительности S.pneumoniae (пограничные значения диаметров зон подавления роста и МПК АБП) приведены в таблице 17.

Таблица 17.

Определение чувствительности Streptococcus spp. группы "viridans"

Проводить определение чувствительности штаммов стрептококков группы "viridans", выделенных из нестерильных локусов в рутинной практике нецелесообразно. У штаммов, выделенных из стерильных в норме локусов организма, необходимо, в первую очередь, исследовать чувствительность к пенициллину. Воспроизводимые результаты при определении чувствительности стрептококков группы "viridans" к пенициллину удается получить только при помощи метода серийных разведений, ДДМ не пригоден для этой цели.

Штаммы, чувствительные к этому антибиотику, следует расценивать как чувствительные ко всем бета-лактамным антибиотикам. Часть штаммов, устойчивых к пенициллину, могут сохранять чувствительность к некоторым цефалоспоринам III поколения (цефотаксиму и цефтриаксону), IV поколения (цефепиму) и карбапенемам. Однако критерии интерпретации результатов определения чувствительности в настоящее время установлены только для цефотаксима и цефтриаксона.

Определенный интерес может представлять изучение чувствительности стрептококков группы "viridans" к эритромицину и другим макролидам, клиндамицину, тетрациклину и хлорамфениколу, однако клиническое значение получаемых при этом данных не определено.

В случае сниженной чувствительности или резистентности зеленящих стрептококков к пенициллину, при выдаче результатов тестирования клиницистам целесообразно рекомендовать проведение комбинированной терапии бета-лактамами с аминогликозидами, которые проявляют синергизм при совместном применении с бета-лактамами, несмотря на отсутствие у аминогликозидов собственной значимой активности в отношении стрептококков.

Определение чувствительности бета-гемолитических стрептококков

К бета-гемолитическим стрептококкам относятся микроорганизмы, принадлежащие к различным серологическим группам по Лансфельд (А, B, C, G). Среди них наибольшее клиническое значение имеют стрептококки группы А (Streptococcus pyogenes) и группы В (Streptococcus agalactiae).

Препаратами выбора для лечения инфекций, вызванных бета-гемолитическими стрептококками, являются бета-лактамы, причем достоверных случаев устойчивости к АБП этой группы не описано. Не описана и устойчивость к ванкомицину. Следовательно, оценивать чувствительность к указанным АБП в рутинной практике нецелесообразно.

При выделении из нестерильных локусов необходимость в оценке чувствительности возникает только для S.pyogenes и S.agalactiae. Примерный перечень препаратов для определения чувствительности этих микроорганизмов включает: макролиды (эритромицин) и линкосамиды (клиндамицин). С целью мониторига антибиотикорезистентности возможно определение чувствительности к хлорамфениколу и левофлоксацину. Для бета-гемолитических стрептококков, выделенных из стерильных локусов, необходимо определять чувствительность ко всем вышеперечисленным препаратам одновременно.

Примерный перечень АБП, рекомендуемых для определения чувствительности S.pneumoniae, стрептококков группы "viridans" и бета-гемолитических стрептококков, выделенных из различных локусов организма, представлен в таблице 18.

Таблица 18.

Критерии интерпретации результатов определения чувствительности Streptococcus spp. (кроме S.pneumoniae) (пограничные значения диаметров зон подавления роста и МПК АБП) приведены в таблице 19.

Негемолитические стрептококки. Зеленящие стрептококки. Патогенез и клиника поражений зеленящими стрептококками. Микробиологическая диагностика негемолитических стрептококков. Выделение зеленящих стрептококков.

Негемолитические стрептококки представлены гетерогенной группой бактерий, дающих а-гемолиз (неполный). Они также лишены групповых Аг, но значительно отличаются от пневмококков. Поскольку большая их часть вызывает позеленение кровяных сред, они также известны как зеленящие стрептококки. Бактерии входят в состав микробных ценозов полости рта (составляют 30—60% всей микрофлоры) и кишечника человека.

Патогенез и клиника поражений зеленящими стрептококками

Негемолитические стрептококки отличает низкая вирулентность; вызываемые ими системные поражения можно в определённой степени рассматривать как оппортунистические .

Основную их часть составляют бактериальные эндокардиты, развивающиеся после проникновения негемолитических стрептококков в кровоток при травмировании слизистых оболочек (например, после чистки зубов, пережёвывании грубой пищи). Эндокардиты носят злокачественный характер и сопровождаются поражением сердечных клапанов. Способность вызывать эндокардиты обусловлена особенностями структуры гликанов (декстранов) клеточной стенки бактерий, облегчающих адгезию стрептококков к агрегатам тромбоцитов и фибрина на поврежденных клапанах. Для поражений характерны эмболии периферических сосудов: в ЦНС их отмечают в 30% случаев, в селезёнке — в 40% (данные аутопсий), в кожных покровах и глазах — в 20-40%.

Вторая по значимости, но несравненно более частая, патология — кариозное поражение зубов, вызываемое зеленящими стрептококками биогруппы mutans. Микроорганизмы содержат поверхностный белок, связывающий гликопротеины слюны, и (совместно с другими бактериями) образуют бактериальные бляшки на поверхности зубов. Бактерии разлагают сахарозу, поступающую с пищей, до молочной кислоты, вызывающей деминерализацию зубной эмали.

Микробиологическая диагностика зеленящих стрептококков

Микробиологическая диагностика негемолитических стрептококков аналогична мероприятиям, провидимым для выделения и идентификации прочих стрептококков. На наличие возбудителей указывает появление мелких (диаметром около 0,5 мм) колоний, окружённых зоной а-гемолиза. Дальнейшую дифферешш-ровку обычно проводят по отсутствию способности расти в жидких средах, содержащих 6,5% NaCl, и гидролизовать эскулин в присутствии солей жёлчных кислот (могут быть положительны у 10% изолятов); также дифференцирующим признаком считают отсутствие чувствительности к оптохину (последний не ингибирует рост бактерий). Дополнительным признаком служит высокая чувствительность большинства изолятов к пенициллину.

Лечение инфекций вызванных негемолитическими стрептококками

Лечение инфекций вызванных зеленящими стрептококками принципиально не отличается от проводимого при других стрептококковых инфекциях.

- Вернуться в оглавление раздела "Микробиология."

Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.

Микробиологическая диагностика стрептококка. Диагностика стрептококковой инфекции. Выявление стрептококка. Выделение стрептококка.

Основу микробиологической диагностики стрептококковой инфекции составляют выделение и идентификация возбудителя. При этом обычно биохимические характеристики изолятов не изучают. Прочие методы диагностики стрептококковой инфекции имеют различные ограничения.

Через 24 ч на КА стрептококки группы А образуют блестящие вязкие колонии (рис. 2, см. цветную вклейку). В жидких средах бактерии дают придонный, иногда поднимающийся вверх рост. Весьма информативные методы раннего выявления стрептококков — определение чувствительности к антимикробным агентам методом дисков.

Наиболее часто их используют для идентификации стрептококков в мазках из зева. Для дифференцировки стрептококков группы А от прочих b-гемолитических стрептококков применяют тест чувствительности к бацитрацину. Более чем в 99% случаев изоляты стрептококков группы А чувствительны к бацитрацину, тогда как представители других серогрупп обычно устойчивы (рис. 12-8). Также можно применить тест чувствительности к триметоприм-сульфаметоксазолу.

Стрептококки групп А и В обычно чувствительны к действию антимикробного агента.

По сравнению с чувствительностью к бацитрацину более специфичен тест гидролиза пиррол идонил-b-нафтиламида (ПИР-тест). S. pyogenes — единственный стрептококк, дающий положительную реакцию. Для этого в пробирки вносят полоски фильтровальной бумаги, пропитанные ПИР. Под действием бактериальных пептидаз ПИР расщепляется до b-нафтиламида, и после внесения 0,01% раствора p-диметиламиноциннамальальдегида полоски окрашиваются в вишнёво-красный цвет.

Стрептококки группы А легко можно выявить в мазках из зева, используя коммерческие наборы; групповой А-Аг экстрагируют химическими реагентами или ферментами и идентифицируют в реакциях латекс-агглютинации, коагглютинации или ИФА. Для экспресс-диагностики ревматического процесса и гломерулонефрита можно определять AT к стрептолизину О или стрептодорназе; серологические исследования также позволяют выявить носителей. Следует помнить, что AT к стрептолизину О не образуются при кожных инфекциях, вызываемых стрептококками группы А.

Лечение стрептококковой инфекции

Основу лечения стрептококковой инфекции составляет адекватная антибактериальная химиотерапия. Лечение ревматизма проводят пенициллинами короткого действия, профилактику — пенициллинами длительного действия (бициллин-5), причём антибиотикопрофилактику предпочтительно проводить круглогодично.

Клинические проявления стрептококковой инфекции группы B. Клиника стрептококковых поражений группы Б. Микробиологическая диагностика стрептококков группы B. Лечение инфекций вызванных стрептококками группы В.

Принципы микробиологической диагностики стрептококковой инфекции группы B аналогичны таковым при выделении стрептококков группы А. Колонии, выросшие на КА, через 24 ч после посева прозрачные или мутноватые, выпуклые, диаметром 0,5-1,0 мм, окружены зоной гемолиза (5-15% изолятов может не проявлять гемолитических свойств). S. agalactiae обычно не чувствителен к бацитрацину и триметоприм сульфаметоксазолу, что определяют в тесте с соответствующими дисками.

Весьма специфичен тест гидролиза гиппурата. Обычно его используют для дифференцировки со S. pyogenes (даёт отрицательную реакцию). Другая дифференцирующая реакция — САМР-тест, основанный на феномене усиления гемолитического действия золотистого стафилококка в присутствии гемолизинов других бактерий (рис. 12-9).

Дальнейшую идентификацию стрептококковой инфекции группы B проводят путём серотипирования в реакции латекс-агглютинации или коаглютинации с коммерческими реагентами либо при помощи инкубации мазков с моноклональными AT, меченными флюоресцеинами. Микроорганизмы можно быстро идентифицировать в мазках отделяемого влагалища, используя коммерческие наборы, аналогичные применяемым для выявления стрептококков группы А.

Лечение стрептококковой инфекции группы B

Подходы и методы терапии инфекций, вызванных стрептококками группы В, аналогичны таковым, применяемым для лечения поражений, обусловленных стрептококками группы А.

При изучении антибиотикограмм сопутствующей микрофлоры стрептококковых инфекций выявлен антибиотик, обладающий бактерицидным действием на сопутствующую микрофлору, но не снижающий репродуктивную активность стрептококков. На основании проведенных исследований предложен способ получения изолированных колоний стрептококков, заключающийся в следующем: для выделения аэробных стрептококков проводят посев исследуемого материала на 5% кровяной МПА, а затем на поверхность питательной среды с посевом наносят диски с гентамицином в количестве 8–9 штук. Через 18–20 часов роста бактерий при температуре 37°С на поверхности плотной питательной среды вокруг дисков с гентамицином наблюдается рост изолированных колоний стрептококков. Для выделения стрептококков, обладающих анаэробными свойствами, предварительно делали посев исследуемого материала на печеночный бульон Китта-Тароцци, а затем через 18–20 часов проводили пересев на 5% кровяной МПА для получения изолированных колоний стрептококков. Предложенный способ позволяет повысить процент выделения стрептококков из исследуемого материала, сократить время проведения микробиологических исследований по выделению изолированных колоний стрептококков.

2. Клиническая лабораторная аналитика. Т. IV. Частные аналитические технологии в клинической лаборатории / под ред. В.В. Меньшикова. – М.: Медицинское информационное агентство, 2004. – 691 с.

3. Лабинская А.С.. Микробиология с техникой микробиологических исследований. – М.: Медицина, 1978. – 394 с.

4. Медицинская микробиология / под ред. В.И. Покровского, О.К. Поздеева. – М.: ГЭОТАР Медицина, 1999. – 1200 с.

6. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология / под ред. А.А. Воробьева. – М.: Медицинское информационное агентство, 2004. – 691 с.

7. Национальная концепция профилактики инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи. – М.: Минздрав России, 2011. – 22 с.

Стрептококковые инфекции продолжают оставаться в числе наиболее острых проблем здравоохранения во всех странах мира. Бактерии рода Streptococcus классифицируют по антигенным свойствам (на основании имеющихся полисахаридов), выделяя серогруппы, изучают биохимические и гемолитические свойства. Наиболее патогенным для человека является Streptococcus pyogenes группы А, вызывающий у человека гнойно-воспалительные и инфекционно-аллергические заболевания. Диагностика стрептококковых инфекций включает использование бактериоскопического метода, определение стрептококковых антигенов в патологическом материале с помощью ИФА или латекс-агглютинации, бактериологического метода идентификации возбудителей инфекции и серологического метода по определению антител к стрептококкам группы А. В последнее время широко распространен метод ПЦР, позволяющий установить диагноз заболевания в 3 раза чаще по сравнению с классическими бактериологическими методами исследований [1, 2, 4]. Эти данные свидетельствуют о необходимости совершенствования микробиологической диагностики стрептококковых инфекций. Стрептококки колонизируют кожные покровы, слизистые оболочки, носоглотку, желудочно-кишечный тракт и влагалище [5]. Для возбудителей инфекции характерна множественность механизмов и факторов передачи, но наиболее характерен воздушно-капельный механизм передачи. У школьников в холодный сезон года носительство стрептококков в носоглотке достигает 25% [6].

В большинстве случаев возникновение стрептококковых инфекций связано с оказанием медицинской помощи (ИСМП). Причинами роста заболеваемости гнойно-воспалительными стрептококковыми инфекциями являются селекция и формирование госпитальных штаммов, обладающих высокой вирулентностью и множественной лекарственной устойчивостью, что требует совершенствования систем надзора и контроля за ИСМП [7].

Описан общепринятый способ получения чистой культуры стрептококков [6], который имеет следующие недостатки: изолированные колонии можно получить только на 3-й день микробиологического исследования, в процессе культивирования бактерий не удаляется посторонняя сопутствующая микрофлора слизистых оболочек зева и миндалин, на 2-й день пересева материала на кровяной мясопептонный агар (МПА) не всегда удается определить микробы, подозрительные на стрептококк, и поэтому приходится делать пересев на кровяной МПА бактерий, не относящихся к стрептококкам, что требует большего расхода питательных сред для выделения изолированной колонии стрептококков. Известно также, что гемолитические свойства стрептококков не являются диагностическим тестом для выявления патогенных стрептококков. Патогенные стрептококки под влиянием антибиотиков и факторов внешней среды могут утратить гемолитическую активность, что существенно затрудняет выделение стрептококков из исследуемого материала.

Итак, сложность лабораторной диагностики и эпидемиологические предпосылки циркуляции стрептококков в лечебно-профилактических учреждениях (ЛПУ) дают основания для совершенствования методов лабораторной диагностики стрептококковых инфекций.

Цель исследования - повышение эффективности выделения возбудителей стрептококковых инфекций из исследуемого материала при возникновении ИСМП.

Задача исследования. На основании изучения антибиотикограмм сопутствующей микрофлоры стрептококковым инфекциям выявить антибиотик, обладающий бактерицидным действием на сопутствующую микрофлору, но не влияющим на снижение репродуктивной активности стрептококков. Добавление данного антибиотика в питательную среду для роста стрептококков позволит разработать способ получения изолированных колоний стрептококков.

Материал и методы исследования

В период с 1997 по 2011 г. обследовано 5300 больных. В содержимом из зева выделена сопутствующая микрофлора стрептококковой инфекции. Для определения чувствительности выделенной сопутствующей микрофлоры к антибиотикам использовали диско-диффузионный метод. В опытах использовано 16-20 часовых культур бактерий. Концентрацию бактерий доводили по стандарту мутности до 0,5 ед. по McFarland на физиологическом растворе хлорида натрия (рН 7,2-7,4). Приготовленную взвесь вносили на чашки Петри с 5% кровяным МПА в количестве 0,2 мл и равномерно распределяли на поверхности питательной среды. Через 15 минут на поверхность питательной среды наносили диски с антибиотиками. Посевы инкубировали при 37°С в течение 24 часов с последующим определением задержки роста бактерий вокруг дисков с антибиотиками. Использовали следующие диски с антибиотиками: стрептомицин, эритромицин, гентамицин, амикацин, линкомицин, бензилпенициллин, олеандомицин, цефаклор, цефуроксим, цефатоксим, цефалексин.

Предложенный способ получения изолированных колоний стрептококков поясняется графическим материалом. На рисунке представлена схема получения изолированных колоний стрептококков.

Схема получения изолированных колоний стрептококков. Обозначения: 1 - сбор исследуемого материала от больного (слизь из зева и с миндалин), 2-5% кровяной МПА, 3 - среда Кита-Тароцци для выращивания бактерий с анаэробным типом дыхания, 4 - диски с гентамицином, 5 - выросшие изолированные колонии стрептококков на кровяном МПА, обладающих аэробными и анаэробными свойствами

Результаты исследований и их обсуждение

По сравнению с традиционными методами микробиологической диагностики стрептококковых инфекций предложенный способ позволяет уменьшить расход питательных сред, повысить процент выделения стрептококков из исследуемого материала, что позволяет своевременно и в более полном объеме проводить противоэпидемическое расследование и осуществлять мероприятия, направленные на предупреждение возникновения ИСМП стрептококковой этиологии.

Следует отметить, что сложность и низкая эффективность выделения стрептококков из исследуемого материала при диагностике инфекционных заболеваний связана с тем, что сопутствующая микрофлора по сравнению со стрептококками более устойчива во внешней среде, неприхотлива к питательным средам, как правило, обладает антагонистическими свойствами и поэтому при инфекционных заболеваниях выделенную микрофлору от больных часто выделяют и идентифицируют преимущественно из группы условно-патогенной сопутствующей микрофлоры. При обследовании ожоговых больных в популяциях сопутствующей микрофлоры наиболее часто определялся эпидермальный стафилококк.

Итак, стрептококки, в отличие от условно-патогенной микрофлоры и стафилококков, менее устойчивы во внешней среде, часто обладали анаэробными свойствами и медленнее размножались на питательных средах. Поэтому не всегда удается выделять чистую культуру стрептококков традиционными микробиологическими методами.

Предложенный способ позволил повысить процент выделения стрептококков из исследуемого материала, сократить время проведения микробиологических исследований по выделению изолированных колоний стрептококков, уменьшить количество ложноотрицательных результатов исследований и снизить расход питательных сред в процессе лабораторной диагностики стрептококковых инфекций. Сокращение сроков проведения лабораторных исследований позволяет в ранние сроки и в более полном объеме проводить противоэпидемические мероприятия при возникновении ИСМП, вызываемых стрептококками.

Читайте также: