Диагностикум на бруцеллез рпга

Обновлено: 18.04.2024

Метод определения РПГА (реакция пассивной, или непрямой гемагглютинации с эритроцитарным диагностикумом, содержащим полисахаридные антигены кишечноиерсиниозных бактерий серовара О9).

Исследование антител к Yersinia Enterocolitica серотип О9 методом РПГА (реакция пассивной, или непрямой гемагглютинации). Кишечный иерсиниоз - острое инфекционное заболевание, характеризующееся преимущественным поражением желудочно-кишечного тракта, с тенденцией к генерализованному поражению различных органов и систем. Возбудителем иерсиниоза чаще всего является мелкая грамотрицательная палочка Yersinia Enterocolitica серотипов О:3, О:8, О:9. Y.enterocolitica распространены в природе широко. Они могут присутствовать в органах и фекалиях многих видов млекопитающих, птиц, земноводных, членистоногих, а также на овощах, корнеплодах, в почве, пыли, воде. Частый путь передачи инфекции – алиментарный (с заражённой пищей, молоком, водой). Человек, как правило, источником заражения не является. Клинические формы иерсиниоза разнообразны и до некоторой степени обусловлены возрастом и физическим состоянием больного. У детей старшего возраста и подростков клиническая картина часто напоминает аппендицит, симптомы включают лихорадку и разлитую боль в животе. У взрослых иерсиниоз часто проявляется двумя синдромами – реактивным артритом и узловатой эритемой. Сначала наблюдается понос с лихорадкой и болью в животе, а через 1-2 недели развивается артрит, который обычно проходит через 1-4 месяца. Узловатая эритема как постинфекционный синдром отмечается преимущественно у женщин среднего возраста. Иерсиниоз в грудном возрасте опасен осложнением в виде сепсиса. Другие предрасполагающие факторы бактериемии включают заболевания печени, гемохроматоз, сахарный диабет, истощение, иммуносупрессивная терапия, передозировка препаратов железа. Более редкие формы иерсиниоза (атипичная клиника обычно обусловлена серотипами, отличными от Y. enterocolitica О:3, О:8, О:9) – ангина на фоне кишечной симптоматики или без неё, пневмония, абсцесс лёгкого, инфекционный эндокардит, инфекции мочевых путей, абсцессы мягких тканей и конъюнктивит. Частота выявления этого возбудителя в кале больных с поносом, по данным разных исследований, составляет 1-3%. Для лабораторного подтверждения иерсиниоза используют микробиологические тесты (см. тест №460 - Посев на иерсинии и определение чувствительности к антибиотикам), серологические исследования - в том числе, РПГА с Y.enterocolitica, выявление антител к факторам вирулентности Y.enterocolitica методом ИФА (см.тесты №№ 238, 239). Титр антител возрастает через 1 неделю заболевания и достигает пика на 2 неделе. Рекомендовано обследовать больного не менее 2 раз – в начале заболевания и с интервалом в 10-15 дней, диагностически достоверным считают 4-кратный и более прирост титров антител. При отсутствии возможности получения парных сывороток (обследование в боле поздние сроки) допускают использование условно-диагностических титров – при кишечном иерсиниозе для взрослых 1:200-1:400, для детей до 10 лет 1:100-1:200. В сомнительных случаях целесообразно проводить исследование параллельно с постановкой РПГА с Y.pseudotubercelosis, проявляющими иммунологическую общность с Y.enterocolitica. Ценность серодиагностики методом РПГА снижают потенциально возможные перекрёстные реакции (Brucella abortus, Rickettsia spp., Salmonella spp., Morganella morganii).

Специальная подготовка не требуется. Рекомендуется взятие крови не ранее чем через 4 часа после последнего приема пищи.

Для подтверждения клинического диагноза при получении отрицательного результата бактериологического обследования.
В целях ретроспективного подтверждения диагноза.
При позднем обращении больного, назначении антибактериальной терапии.

Интерпретация результатов исследований содержит информацию для лечащего врача и не является диагнозом. Информацию из этого раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. Точный диагноз ставит врач, используя как результаты данного обследования, так и нужную информацию из других источников: анамнеза, результатов других обследований и т.д.

Условно-диагностический титр: взрослые – 1:200-1:400; дети до 10 лет – 1:100-1:200. Диагностически достоверным считают прирост титров в 4 и более раз в динамике за 7-10 дней.

Метод определения РПГА (реакция пассивной гемагглютинации с эритроцитарным диагностикумом, который содержит полисахаридные антигены, выделенные из псевдотуберкулезных бактерий сероварианта 1).

Выявление специфических антител к возбудителю псевдотуберкулёза методом РПГА (реакция пассивной, или непрямой гемагглютинации). Псевдотуберкулёз (дальневосточная скарлатиноподобная лихорадка) – острая инфекция с разнообразными клиническими проявлениями. Возбудитель - Yersinia pseudotuberculosis. К туберкулёзу это заболевание отношения не имеет (исходное название связано с внешним сходством с туберкулёзными бугорками гранулем, выявленных в тканях больных животных). Характерно острое начало с подъёмом температуры до 39-39.5°С, у большинства больных – сыпь, чаще мелкопятнистая. Характерна гиперемия лица, отёчность и гиперемия кистей и стоп. В начале болезни возможны боли в животе, преимущественно в правой подвздошной области, жидкий стул без патологических примесей, симптомы клинически сходные с аппендицитом. Может наблюдаться желтуха с повышением прямого билирубина и трансаминаз. Частым проявлением являются лимфадениты и полиадениты, артралгии, артриты и полиартриты. Заболевание сходно по картине с иерсиниозом, вызываемым Y. Enterocolitica (см. тесты №№ 460, 238, 239, 284, 285). Источником инфекции являются инфицированные животные (крысы, мыши и другие грызуны, домашние животные и птицы, выделяющие возбудителя с испражнениями). Заражение чаще происходит при употреблении загрязнённых овощей и других пищевых продуктов и воды. Антитела против О антигена возбудителя можно наблюдать у концу первой недели заболевания с быстрым ростом их уровня в течение 2 недель и, в дальнейшем, снижением через 2-6 месяцев. Исследование антител следует проводить в динамике - в парных сыворотках, взятых в начале заболевания и далее через 7-10 дней. Диагностически достоверным серологическим показателем считают 4-кратный (и более) прирост титра антител в РПГА. При отсутствии выраженной динамики титров или необходимости оценки одиночных результатов следует учитывать эпидемиологическую обстановку и сроки болезни, при этом допустимо использовать минимальный условно-диагностический титр 1:100-1:200. При групповых вспышках псевдотуберкулеза для детей до 5 лет условно диагностический титр может быть снижен до 1:50-1:100. Существуют указания на потенциальную возможность частичных перекрёстных реакций с другими микроорганизмами – другими видами Yersinia, Vibrio, Salmonella, Brucella, Rickettsia.

Для подтверждения клинического диагноза при получении отрицательного результата бактериологического обследования.
В целях ретроспективного подтверждения диагноза.
При позднем обращении больного, назначении антибактериальной терапии.

Условно-диагностический титр – 1:100. При групповых вспышках псевдотуберкулёза для детей до 5 лет условно-диагностический титр может быть снижен до 1:50.

Синонимы: Бруцелла; бруцеллез (мальтийская, средиземноморская, ундулирующая лихорадка, септицемия Брюса); серологическая диагностика, Brucella spp.; Human brucellosis; serological diagnostics.

Бруцеллез – это инфекционное зоонозное заболевание, характеризующееся лимфаденопатией, длительной лихорадкой, поражением опорно-двигательной, сердечно-сосудистой, нервной и других систем, а также высокой частотой хронизации. Возбудителем заболевания являются микроорганизмы Brucella spp. Они представляют собой грамотрицательные бактерии шаровидной или овоидной формы, обладают высокой способностью к инвазии и внутриклеточному паразитированию. Патогенными для человека являются следующие виды бруцелл: B. melitensis, B. abortus, B. suis, B. canis, B. ceti. При этом на долю B. melitensis приходится подавляющее большинство случаев заражения. Источником инфекции является крупный и мелкий рогатый скот, свиньи. Возбудитель инфекции может попадать в организм человека при употреблении мяса, сырых молочных продуктов (молоко, сыр) – алиментарный путь передачи. Также возможно заражение при непосредственном контакте с инфицированными тканями животных, их выделениями у ветеринаров, работников мясной промышленности, животноводства, сотрудников микробиологических лабораторий. Описаны случаи передачи микроорганизма от человека к человеку, в том числе случаи заражения младенцев при употреблении грудного молока больной матери.

Инкубационный период при бруцеллезе – 7-30 дней. Заболевание имеет разнообразные клинические проявления с поражением множества органов и систем. Различают острую, подострую и хроническую форму бруцеллеза. Встречается латентная форма заболевания с отсутствием выраженной клинической симптоматики или стертым течением инфекции.

Острая и подострая формы бруцеллеза характеризуются слабостью, головной болью, длительной лихорадкой с температурой 39-40 °С и выше, сопровождающейся ознобами и проливными потами. Отмечается лимфаденопатия, увеличение и болезненность при пальпации печени и селезенки, поражение нервной системы (раздражительность, явления менингизма, менингит), поражение сердечно-сосудистой системы, опорно-двигательной системы в виде артралгий. Хроническая форма заболевания является распространенной и характеризуется слабыми признаками интоксикации, рецидивирующим течением с периодами обострений. Отмечается поражение опорно-двигательного аппарата в виде артритов, периоститов, перихондритов крупных суставов с формированием ограничения их подвижности, анкилозов. Также наблюдаются миозиты, фиброзиты, целлюлиты. Поражается центральная и периферическая нервные системы в виде радикулитов, невралгий, невритов, неврозов. В патологический процесс могут вовлекаться сердечно-сосудистая система с развитием васкулитов, миокардита, эндокардита; урогенитальный тракт; органы эндокринной системы. Встречается также локализованная форма бруцеллеза. Она отмечается в 20-40 % случаев инфекции и характеризуется изолированным поражением какого-либо органа, например органов мочеполовой, нервной системы, сердца, а также поражение сустава. Как правило, локализованный бруцеллез – это последствие не распознанной ранее острой формы заболевания.

Диагностика бруцеллеза основана на эпидемиологических, клинических данных и результатах изменений лабораторных показателей. Следует отметить, что диагностика бруцеллеза затруднена из-за того, что заболевание может протекать в бессимптомной, хронической и локализованной форме. Известны бактериологический, серологический, аллергологический, а также определение генетического материала возбудителя методом полимеразной цепной реакции.

Серологическая лабораторная диагностика бруцеллеза заключается в выявлении специфических антител против антигенов возбудителя Brucella spp. Данный метод обладает высокими показателями диагностической чувствительности и быстротой получения результата. На 6-7-й день от начала заболевания начинают синтезироваться специфические антитела класса IgM. На второй неделе заболевания преобладает синтез антител класса IgG, достигая максимального уровня, а затем в течение длительного времени сохраняясь в циркулирующей крови. Титры обоих классов антител непрерывно нарастают, достигая максимальных значений в течение четырех недель от начала инфицирования. Диагностически значимым является нарастание титра специфических антител не менее чем в четыре раза в парных сыворотках, взятых в первые дни болезни и через две недели от ее начала в свежем образце крови. Определение антител к Brucella spp. также рекомендуется для оценки эффективности проводимой терапии. При положительных эффектах лечения отмечается снижения уровня антител, в то время как сохранение высоких титров свидетельствует о неэффективности терапии.

Для чего используется исследование?

Для лабораторной серологической диагностики бруцеллеза;
для диагностики острой, подострой, хронической форм бруцеллеза;
для оценки эффективности проводимой терапии.
Когда назначается исследование?

При клинических проявлениях острой и подострой форм бруцеллеза: слабость, головная боль, длительная лихорадка с температурой 39-40 °С и выше с ознобами, лимфаденопатии, гепатоспленомегалия, артралгии, артриты, поражения сердечно-сосудистой, нервной систем;
при клинических проявлениях хронической формы бруцеллеза: интоксикация, артриты, артралгии, миалгии, миозиты, фиброзиты, целлюлиты, радикулиты, невралгии, васкулитов, миокардиты, эндокардиты;
при симптомах изолированных поражений органов урогенитального тракта, нервной системы, сердечно-сосудистой системы, опорно-двигательной системы, особенно в группе лиц с возможным профессиональным инфицированием (ветеринары, работники мясной промышленности, животноводства, сотрудники микробиологических лабораторий), в эндемичных по бруцеллезу районах.

За 4 часа до забора крови запрещается принимать пищу, допускается пить только бутилированную негазированную воду; за 1-2 дня рекомендуется снизить интенсивность физических нагрузок; за 48 час. исключить курение и употребление алкогольных напитков. За 30 минут исключить курение.

Биологический материал	кровь (сыворотка)
Метод исследования	РПГА с рекцией Хеддльсона
Срок исполнения без учета времени на доставку до лаборатории, дней	от 7 до 9 календарных дней
Формат результата, единицы измерения	полуколичественный, титр

Диагностический титр: 1:100.

бруцеллез;
острая, подострая, хроническая форма бруцеллеза;
бруцеллез, протекающий в виде локализованных форм;
ложноположительные результаты.
Причины понижения:

отсутствие бруцеллеза;
отсутствие или снижение иммунного ответа;
ранние сроки инфицирования;
проведение исследования на поздних сроках от момента возможного инфицирования, когда в крови отсутствуют антитела.
Что может влиять на результат?

Клинический период и форма заболевания;
особенности иммунного ответа у новорождённых детей, пожилых людей и лиц с патологией иммунной системы.
Важные замечания

При серологическом исследовании чаще всего выявляют антитела к общему для многих микроорганизмов липополигосахариду, компоненту клеточной стенки бактерий. Могут отмечаться ложноположительные результаты при наличии инфекции Yersinia enterocolitica O:9, Salmonella urbana группа N, Vibrio cholerae, Francisella tularensis, Escherichia coli O:157, Stenotrophomonas maltophilia и некоторых других микроорганизмов.
Может быть рекомендовано определение генетического материала возбудителя методом полимеразной цепной реакции.

Для чего используется исследование?

Не менее 3 часов после последнего приема пищи. Можно пить воду без газа. Исключить курение за 30 минут до сдачи анализа.

Биологический материал	кровь (сыворотка)
Метод исследования	РПГА
Срок исполнения без учета времени на доставку до лаборатории, дней	2 - 4 календарных дня
Формат результата, единицы измерения	полуколичественный, титр

Диагностический титр: 1:100.

РПГА является специфичным и высоко чувствительным методом выявления бруцеллезных антител в сыворотке крови человека. Для постановки РПГА необходимо иметь: а) бруцеллезный эритроцитарный антигенный диагностикум; б) контрольные (несенсибилизированные) эритроциты; в) нормальную сыворотку кролика; г) бруцеллезную сыворотку.

Для титрования испытуемых сывороток применяется нормальная сыворотка кролика, инактивированная при 56 °C в течение 30 минут и разведенная физиологическим раствором 1:100.

Испытуемую сыворотку разводят физиологическим раствором 1:25 (0,1 мл сыворотки +2,4 мл физиологического раствора) и инактивируют в течение 30 минут при 56 °C. Перед исследованием сыворотку адсорбируют 50% взвесью контрольных эритроцитов. К 1,2 мл инактивированной сыворотки добавляют 0,2 мл 50% эритроцитов, встряхивают и оставляют на 30 минут при комнатной температуре. Затем смесь центрифугируют при 1000 об./мин. в течение 2 минут.

Можно оставить сыворотки с эритроцитами на ночь в холодильнике (+4 °C), в этом случае исключается центрифугирование.

Эритроцитарный диагностикум перед применением разводят физиологическим раствором (pH 7,0 - 7,2) согласно указанию на этикетке и получают 2,5%-ную взвесь, которая применяется в РПГА. Контрольные (несенсибилизированные эритроциты также разводят согласно указанию на этикетке и применяют полученную 2,5%-ную взвесь для контроля сывороток).

Техника постановки РПГА.

Реакцию ставят в прозрачных полистироловых пластинках с лунками. Каждую сыворотку исследуют не менее чем в 6 - 8 разведениях, начиная с 1:50. Сначала нормальную разведенную 1:100 инактивированную сыворотку кролика разливают во все лунки по 0,5 мл. Затем в первую лунку (контроль сыворотки) вносят 0,5 мл испытуемой сыворотки, предварительно инактивированной и разведенной 1:25, перемешивают и 0,5 выливают. Во вторую лунку также добавляют 0,5 мл испытуемой сыворотки (1:25), перемешивают, переносят 0,5 мл в третью лунку и титруют сыворотку до конца ряда, из последней лунки 0,5 мл выливают. Таким образом получают ряд последовательных двукратных разведений испытуемой сыворотки, начиная с 1:50, в объеме 0,5 мл.

В первые лунки (контроль сыворотки) добавляют микропипеткой по 0,05 мл контрольных эритроцитов. Затем в каждую лунку, начиная со второй, с помощью микропипетки добавляют по 0,05 мл диагностикума. Пластины осторожно встряхивают до полного перемешивания содержимого лунки, следя, чтобы не было разбрызгивания жидкости, и оставляют при комнатной температуре. Учет реакции проводят через 2 - 3 часа.

При постановке РПГА предусматриваются следующие контроли:

а) контроль качества нормальной сыворотки кролика (1:100) проводят в двух лунках. К 0,5 мл сыворотки добавляют в первую лунку 0,05 мл 2,5% взвеси диагностикума, во вторую - 0,05 мл контрольных эритроцитов;

б) качество диагностикума проверяют путем титрования специфической бруцеллезной сыворотки, начиная с разведения 1:50 до 1:100000. Затем в каждую лунку добавляют по 0,05 мл 2,5% взвеси диагностикума.

Реакция считается специфической, если в контролях исследуемых и контрольной сыворотки отсутствует гемагглютинация, а титр специфической сыворотки в реакции будет соответствовать титру, указанному на этикетке флаконов эритрицитарного диагностикума.

Оценка реакции проводится по следующей схеме:

4+ - эритроциты покрывают все дно лунки равномерным слоем, иногда наблюдается зонтик.

3+ - эритроциты выстилают все дно лунки тонким равномерным слоем, но площадь его меньше, чем при 4-крестовой реакции, размеры зонтика также меньше.

2+ - агглютинат небольшой, расположен в центре лунки.

1+ - вокруг осадка эритроцитов в центре виден небольшой агглютинат.

Отрицательная реакция - осадок эритроцитов на дне лунки в виде пуговки или маленького кольца.

За титр сыворотки принимают ее последнее разведение с оценкой реакции не менее чем 3+. Оценка результатов исследования сывороток на бруцеллез в РПГА у людей: титр 1:50 - реакция сомнительная, титр 1:100 и выше - реакция положительная. При записи результатов РПГА следует указывать титр сыворотки.

Техника постановки РПГА микрометодом.

РПГА может быть выполнена в микрообъемах с помощью микротитратора типа Такачи (или круглодонных микропланшетах с микропипетками), который позволяет проводить титрование в объемах 25 и 50 мкл. Техника постановки реакции, последовательность всех операций такая же, как и при использовании макрометода. Следует учитывать то, что чувствительность микрометода обычно на одно разведение ниже, чем макрометода.

Для постановки реакции в микротитраторе с помощью пипетки-капельницы в каждую лунку вносят разводящую жидкость в объеме 50 мкл. Затем с помощью титраторов с головкой объемом 50 мкл забираем исследуемую сыворотку, погружая в нее головку. Титратор с сывороткой переносят в первую лунку и делают несколько вращательных движений в обе стороны. Затем титратор переносят в следующую лунку и повторяют манипуляцию. Титрование можно проводить одновременно в нескольких рядах. После титрования всего ряда титратор промывают дистиллированной водой путем вращательных движений, удаляют воду из головки с помощью тампона и обжигают ее на пламени горелки.

В лунки после титрования добавляют 25 мкл эритроцитарного диагностикума, разведенного 1:10, пластины слегка встряхивают до получения гомогенной взвеси. Учет проводят через 2 - 3 часа по аналогичной схеме, как и при использовании макрометода.

Читайте также: