Для культивирования возбудителя коклюша используют питательную среду

Обновлено: 27.03.2024

Рецензент: доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой инфекционных болезней УГМА Борзунов В.М.

Литусов Н.В. Возбудители коклюша и паракоклюша. Иллюстрированное учебно-методическое пособие. – Екатеринбург: Изд-во УГМА, 2013. - 32 с.

В иллюстрированном учебно-методическом пособии рассматриваются вопросы истории открытия и изучения возбудителей коклюша и паракоклюша, их морфологические, тинкториальные, культуральные, биохимические, антигенные свойства, факторы патогенности, эпидемиология, патогенез коклюша, клинические признаки заболевания, вопросы профилактики и лечения коклюша и паракоклюша.

Учебно-методическое пособие предназначено для внеаудиторной подготовки студентов, обучающихся по специальностям 060101 (лечебное дело), 060103 (педиатрия), 060105 (медико-профилактическое дело), 060201 (стоматология) и 060301 (фармация).

Морфологические и тинкториальные свойства .

Факторы патогенности возбудителя коклюша.

Особенности возбудителя паракоклюша .

Список учебной, методической литературы и Интернет-ресурсов .

Коклюш (лат. pertussis – конвульсивный кашель, франц. coqueluche – петушиный крик) - острое инфекционное заболевание дыхательных путей, сопровождающееся воспалением гортани, трахеи и бронхов и развитием приступов спазматического кашля. Коклюш относится к группе антропонозных инфекций. Китайцы называли это заболевание “стодневным кашлем”, подчеркивая затяжное течение заболевания. Название болезни “коклюш” появилось в 1724 г. Паракоклюш клинически проявляется в виде легкой формы коклюша.

В 1578 г. французский врач Г. де Байю (рисунок 1) впервые описал клинические симптомы коклюша во время эпидемии этого заболевания в Париже.

В 1784-1789 гг. российский ученый Н.М. Максимович-Амбодик (рисунок 2) опубликовал труд “Искусство повивания”, в котором впервые в отечественной литературе описал коклюш.

Рисунок 2 – Нестор Максимович Максимович-Амбодик (1744-1812 гг.).

Подробное описание клинической картины коклюша представил в своей монографии “Педиятрика” русский врач - основоположник педиатрии в России С.Ф. Хотовицкий (рисунок 3).

Рисунок 3 – Степан Фомич Хотовицкий (1796-1885 гг.).

Возбудитель коклюша был обнаружен в 1900 году в мазках, приготовленных из мокроты больных, а выделен в чистой культуре в 1906 году бельгийскими бактериологами Ж. Борде и О. Жангу (рисунки 4 и 5).

Рисунок 4 – Жюль Борде (Jules Jean-Baptiste Vincent Bordet, 1870-1961 гг.).

Рисунок 5 – Октав Жангу (Octave Gengou, 1875-1957 гг.).

В честь первооткрывателей возбудитель коклюша получил название палочка Борде-Жангу.

Возбудитель паракоклюша был выделен и изучен в 1937 г. Г. Эльдерингом и П. Кендриком.

Возбудители коклюша и паракоклюша относятся к отделу Gracilicutes ,

порядку Burkholderiales , семейству Alcaligenaceae , роду Bordetella . Бордетеллы – это бактерии, обитающие в респираторном тракте человека и некоторых видов животных. Среди бордетелл выделяют виды: B. ansorpii , B. avium , B. bronchiseptica ,

B. hinzii , B. holmesii , B. parapertussis , B. pertussis , B. petrii , B. trematum . Для человека патогенными являются виды B. pertussis (палочка Борде-Жангу, возбудитель коклюша) и B. parapertussis (возбудитель паракоклюша). Иногда у человека развивается респираторное заболевание по типу ОРВИ, вызванное B. bronchiseptica

Морфологические и тинкториальные свойства

Бордетеллы представляют собой короткие грамотрицательные палочки овоидной формы (коккобациллы) размером 0,2-0,3х0,4-1,2 мкм. Клетки располагаются отдельно или группами. При окраске толуидиновым синим они окрашиваются биполярно за счет зерен волютина. Клетки возбудителей коклюша и паракоклюша неподвижные. Клетки других видов бордетелл ( В. bronchiseptica , В. avium , В. hinzii , В. trematum ) обладают подвижностью. Бордетеллы не образуют спор. У возбудителя коклюша имеются пили. У бактерий из колоний S-формы выявляется нежная микрокапсула у (рисунки 6 - 9).

а б в Рисунок 6 – Бордетеллы: а – схематическое изображение, б – окраска по Граму, в –

Рисунок 7 – Сканирующая микроскопия B. pertussis .

Рисунок 8 – Электронная микрофотография бордетелл.

Рисунок 9 – Капсула B. pertussis (указано стрелками), компьютерное изображение.

Бордетеллы являются облигатными аэробами. Оптимальная температура для их выращивания 35-36 0 С. Возбудитель коклюша весьма требователен к питательным средам. Классическими средами для культивирования возбудителя коклюша являются казеиново-угольный агар (КУА), картофельно-глицериновый агар с кровью и пенициллином или цефалоспорином (среда Борде - Жангу), угольно-кровяной агар (среда Реган-Лоу), молочно-кровяной агар. Кровь и активированный уголь являются сорбентами метаболитов (ненасыщенных жирных кислот, сульфидов, перекисей), накапливающихся в процессе роста микробных клеток. Антибиотики препятствуют размножению посторонней микрофлоры.

На КУА B. pertussis на 3-4 день образует гладкие выпуклые колонии диаметром около 1 мм, блестящие, серовато-кремового цвета и вязкой консистенции, напоминающие капельки ртути или жемчужины (рисунок 10). Колонии паракоклюшных бактерий на КУА образуются на 2-3 день, а колонии B. bronchiseptica выявляются уже на 1-2 день культивирования.

Рисунок 10 – Рост B. pertussis на казеиново-угольном агаре.

На среде Борде-Жангу на 3-4 день коклюшные палочки формируют мелкие (диаметром около 1 мм), гладкие, блестящие, куполообразные колонии, напоминающие капельки ртути и имеющие жемчужный или металлический блеск (рисунок 11).

Рисунок 11 - Рост B. pertussis на среде Борде-Жангу.

На кровяном агаре вокруг колоний возбудителей коклюша и паракоклюша образуется не четко выраженная зона гемолиза (рисунок 12).

Рисунок 12 - Рост B. pertussis на кровяном агаре.

Таким образом, колонии возбудителя паракоклюша по внешнему виду похожи на коклюшные колонии, но имеют более крупные размеры и появляются раньше. У паракоклюшных бактерий за счет образования пигмента в результате синтеза тирозиназы среда с тирозином окрашивается в коричневый цвет.

При выращивании на плотных питательных средах основной формой колоний возбудителя коклюша является S-форма или так называемая I фаза по

Лесли и Гарднеру (вирулентные культуры). Через промежуточные фазы II и III культуры коклюшного микроба переходят в шероховатую R-форму (фаза IV), что сопровождается изменением культуральных, биохимических и антигенных свойств, а также утратой вирулентности. От больных коклюшем в раннем периоде заболевания выделяют возбудитель в форме S-вариантов (фаза I). Такие варианты продуцируют токсины и факторы, необходимые для колонизации респираторного тракта. При температуре 25 О С вирулентные штаммы становятся авирулентными (R- формами). В авирулентном состоянии коклюшная палочка способна персистировать в носовых ходах.

При выращивании бордетелл в жидкой среде вначале образуется пленка на поверхности, а через 10-14 часов – густой слизистый осадок.

Биохимическая активность у бордетелл не выражена. Коклюшные бактерии не ферментируют сахара, не образуют индола, не редуцируют нитраты, не обладают протеолитической активностью. Все бордетеллы продуцируют каталазу, гиалуронидазу, коагулазу. Дифференциальные признаки разных видов бордетелл представлены в таблице 1.

Таблица 1 – Дифференциальные признаки видов бордетелл

Время появления колоний, ч

Размер колоний, мм

Образование коричневого пигмента на

среде с тирозином

Агглютинация видовыми специфическими

неадсорбированными коклюшными и

сыворотками к агглютиногенам:

У бордетелл выделяют соматический термостабильный О-антиген и поверхностные термолабильные капсульные К-антигены или агглютиногены (так называемые факторы 1-16). Фактор 7 является общим для всех бордетелл (общеродовой агглютиноген), фактор 1 характерен для B. pertussis , фактор 14 – для

B. parapertussis , фактор 12 – для B. bronchiseptica (видовые агглютиногены).

Видовые агглютиногены используют для получения монорецепторных (факторных)

сывороток, позволяющих дифференцировать представителей рода Bordetella . Кроме видоспецифического агглютиногена 1 коклюшный микроб содержит также факторы 2, 3, 4, 5, 6 и 13. По содержанию основных агглютиногенов 1, 2 и 3 выделяют 4 серотипа возбудителя коклюша (1.2.3, 1.0.3, 1.2.0, 1.0.0). Эти серотипы различаются по вирулентности. Антигенными свойствами обладают также коклюшный токсин, филаментозный гемагглютинин, поверхностный белок пертактин. Коклюшный анатоксин, филаментозный гемагглютинин, пертактин, фимбриальные агглютиногены коклюшного микроба обладают иммуногенными свойствами, поэтому используются при конструировании вакцинных препаратов.

Возбудитель коклюша – облигатный паразит, поэтому вне организма он быстро погибает (в течение нескольких часов). В сухой мокроте он сохраняется в течение нескольких часов, в капельках аэрозоля – в течение 20-23 часов. Он обладает высокой чувствительностью к действию ультрафиолетовых лучей, дезинфицирующих веществ и температуры. Под влиянием прямых солнечных лучей возбудитель погибает в течение 1 часа, при воздействии рассеянного солнечного света – в течение 2 часов. При 50-55 О С коклюшный микроб погибает через 10-30 минут, при кипячении - мгновенно. Возбудитель коклюша обладает чувствительностью к полимиксину, стрептомицину, тетрациклину, биомицину, но устойчив к пенициллину и сульфаниламидам.

Факторы патогенности возбудителя коклюша

Факторы патогенности возбудителя коклюша можно условно разделить на следующие группы:

1. Факторы адгезии :

- фимбриальные агглютиногены (Fim, нитевидные выросты на поверхности бактерий, к которым вырабатываются специфические антитела - агглютинины);

- филаментозный гемагглютинин (FHA, волокнистый гемагглютинин, поверхностный белок палочковидной формы, молекулярная масса 22 кД);

- белок наружной мембраны пертактин (PRN, молекулярная масса 69 кД); - белок наружной мембраны BrkА (Bordetella resistance to killing А);

- белок наружной мембраны BrkВ (Bordetella resistance to killing В). 2. Токсины бордетелл :

Морфология возбудителя коклюша. Тинкториальные свойства возбудителя коклюша. палочка Борде-Жангу. Bordetella pertussis.

Bordetella pertussis — мелкая овоидная палочка, размером 0,2-0,5x1,0-1,2 мкм. Неподвижна, образует капсулу. Клетки возбудителя коклюша плохо окрашиваются по Граму, предпочтительно использовать толуидиновый синий, выявляющий биполярные метахро-матические гранулы (клеточные липоиды).

Коклюшная палочка — строгий аэроб; каталаза-положительна. Углеводы практически не ферментирует, требовательна к питательным средам. Кроме того, росту возбудителя коклюша препятствуют накапливающиеся в среде жирные кислоты, ингибирующие их рост. Поэтому в культуральные среды вносят адсорбенты — активированный уголь, крахмал, альбумин и др.

Морфология возбудителя коклюша. Тинкториальные свойства возбудителя коклюша. палочка Борде-Жангу. Bordetella pertussis

Наиболее часто используют агар Борде-Жангу и казеиново-угольный агар (КУА).

• Через 3-5 сут на агаре Борде-Жангу коклюшная палочка образует небольшие (1 мм в диаметре) сероватые, выпуклые и блестящие колонии, напоминающие капельки ртути или жемчужины, окружённые зоной слабого гемолиза.
На КУА колонии возбудителя коклюша блестящие, серовато-кремового цвета. При изменении состава питательной среды или условий культивирования бордетеллы быстро изменяют тип роста и антигенные свойства. Переход от S-формы (I фаза) к R-форме (IV фаза) происходит через промежуточные II и Ш фазы и сопровождается изменением набора Аг и потерей вирулентных свойств.

• В жидких средах (20% кровяной бульон) бактерии дают незначительное помутнение, образуют плёнку (иногда со спускающимися вниз отростками типа сталактитов); к 10-14-м суткам культивирования образуют осадок, среда при этом становится прозрачной.

- Вернуться в оглавление раздела "микробиология"

Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.

Использование: биотехнология, медицинская микробиология, диагностика коклюша, питательная среда. Сущность: сухая питательная среда для выделения коклюшного микроба содержит солянокислотный гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, агар, натрий хлористый, крахмал, уголь активированный, амилопектин, натрий углекислый при сбалансированном определенном содержании компонентов. Количественное соотношение компонентов питательной среды и ее pH обеспечивают повышенный уровень интенсивности роста коклюшного микроба и чувствительность среды. 1 табл.

Формула изобретения

Питательная среда для выделения и культивирования коклюшного микроба, содержащая агар, кислотный гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, крахмал, минеральные соли, уголь активированный и воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит амилопектин, из минеральных солей натрий хлористый и натрий углекислый при следующей количественном соотношении компонентов, г/л:
Кислотный гидролизат казеина 18,0 20,0
Дрожжевой экстракт 4,5 5,5
Натрий хлористый 4,5 5,5
Крахмал 1,5 2,5
Амилопектин 4,0 6,0
Уголь активированный 3,5 4,5
Натрий углекислый 0,5 0,7
Агар 11,0 13,0
Вода Остальное
рН 6,8 7,2.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано при диагностике коклюша.

За рубежом ведущие фирмы ("Difco", "Gibco", "BBL") выпускают в сухом виде среды для культивирования и выделения коклюшного микроба, содержащие в своем составе бактопептоны, экстракты мяса, ферментативные гидролизаты казеина, желатина, витамины и 10 15% дефибринированной крови.

Эти среды богаты по питательным ценностям, но сложны по составу 3
В настоящее время в микробиологической диагностике коклюша используется ряд сред лабораторного изготовления: среда Борде-Жангу (картофельно-глицериновый агар), молочно-кровяной агар. В промышленном производстве эти среды не выпускаются, при лабораторном изготовлении требуют больших материальных и временных затрат, нестандартны [5]
В нашей стране единственной коммерческой средой для диагностики коклюша является казеиново-угольный агар (КУА), выпускаемый в НПО "Питательные среды", г. Махачкала [6] которая состоит из следующих компонентов, г:
Гидролизат казеина 28,62
Экстракт дрожжей 2,86
Калий фосфорнокислый Однозамещенный 0,5
Медь сернокислая 0,005
Магний хлористый 0,4
Крахмал растворимый 2,0
Цистеин 0,3
Уголь активированный 5,0
Агар-агар 12,5-13,0
Вода дистиллированная До 1 л
Недостатками этой среды являются ее нестандартность, низкие ростовые качества, что вызывает серьезные нарекания со стороны санитарно-эпидемиологической службы. В процессе работы с казеиново-угольным агаром приходится предпринимать дополнительные меры для улучшения ее качества, повышения чувствительности путем дополнительного внесения в среды отдельных аминокислот, витаминов, крови, угля и т.д.

Задачей изобретения является создание промышленной сухой питательной среды, стандартной, обеспечивающей стабильность результатов при выделении коклюшного микроба.

Это достигается сбалансированностью компонентного состава среды, содержащей солянокислотный гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, агар, натрий хлористый, крахмал, уголь активированный, кроме того, дополнительно содержащей амилопектин, натрий углекислый при следующем содержании компонентов, г/л:
Солянокислотный гидролизат казеина 18,0-20,0
Дрожжевой экстракт 4,5 5,5
Натрий хлористый 4,5 5,5
Крахмал 1,5 2,5
Амилопектин 4,0 6,0
Уголь активированный 3,5 4,5
Натрий углекислый 0,5 0,7
Агар-агар 11,0 12,0
Вода дистиллированная Остальное
pH 7,00,2
Количественное соотношение компонентов питательной среды и ее pH обеспечивают повышенный уровень интенсивности роста коклюшного микроба и чувствительность среды.

Пример 1. Питательную среду готовят следующим образом. Навески ингредиентов взвешивают, тщательно перемешивают, растирают в ступке, переносят в колбу, растворяют в дистиллированной воде.

Закрыв колбу ватно-марлевой пробкой, стерилизуют при 120 o C в течение 20 мин. Охладив до температуры 45-50 o C, тщательно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри. Получают питательную среду следующего состава, г/л:
Солянокислотный гидролизат казеина 19,0
Дрожжевой экстракт 5,0
Натрий хлористый 5,0
Крахмал 2,0
Амилопектин 5,0
Уголь активированный 4,0
Натрий углекислый 0,6
Агар 12,0
Вода дистиллированная Остальное
pH 7,0
Для биологического контроля питательной среды использовали культуру Bordeteiia pertussis музейных штаммов и свежевыделенные штаммы от больных коклюшем. Посевы культивировали при (370,5 o C).

Учет результатов проводят через 3-5 суток. Результаты представлены в таблице.

Пример 2. Питательную среду готовят как описано в примере 1, со следующим содержанием компонентов, г/л:
Солянокислотный гидролизат казеина 18,0
Дрожжевой экстракт 4,5
Натрий хлористый 4,5
Крахмал 1,5
Амилопектин 4,0
Уголь активированный 3,5
Натрий углекислый 0,5
Агар 11,0
Вода дистиллированная Остальное
pH 7,0
Проверка предлагаемой среды проводилась посевом музейных и свежевыделенных штаммов Bordeteiia pertussis.

Учет результатов проводили через 3 5 суток. Результаты аналогичны примеру 1.

Пример 3. Проверка предлагаемой среды производилась посевом музейных и свежевыделенных штаммов Bordetella pertussis на питательную среду с максимальным содержанием компонентов следующего состава, г/л:
Солянокислотный гидролизат казеина 20,0
Дрожжевой экстракт 5,5
Натрий хлористый 5,5
Крахмал 2,5
Амилопектин 6,0
Уголь активированный 4,5
Натрий углекислый 0,7
Агар микробиологический 13,0
Вода дистиллированная Остальное
pH 7,2
Учет результатов проводили через 3 5 суток.

Результаты аналогичны примеру 1.

Морфология колоний на испытанных средах идентична типичная для коклюшного микроба.

Из таблицы видно, что предлагаемая среда по чувствительности и интенсивности роста превосходит коммерческую среду.

Предлагаемая среда позволяет поддерживать жизнеспособность штаммов Bordetella pertussis (как свежевыделенных от больных, так и музейных) и дает возможность использовать ее для хранения культур.

Предлагаемая питательная среда пригодна для диагностических целей при выявлении больных коклюшем, а также для накопления биомассы.

Источники информации принятые во внимание при экспертизе
1. Handbook Culture Media MERCK, 1982.

2. The manual of microbiogical culture media (Gibco BRL, 1988).

3. The Oxoid manual of culture media, indredient and ofher laboratory services (Oxoid Limited, 1979).

4. Manual of BBL products and laboratory procedures, 1991.

5. Инструкция по бактериологическому и серологическому исследованиям при коклюше и паракоклюше. Минздрав СССР, 1983.

6. Каталог сухих питательных сред, выпускаемых в СССР для медицинской бактериологии, М. 1980, в.1,с.14.

Род Bordetella относится к семейству Alcaligenaceae и включает 9 видов: B. ansorpii, B. avium, B. bronchiseptica, B. hinzii, B. holmesii, B. parapertussis, B. pertussis, B. petrii, B. Trematum.

Бактерии рода Bordetellae - мелкие грамотрицательные коккобациллы. В мазках - часто биполярно окрашенные, одиночные или в парах, имеют нежную капсулу. Все, за исключением B. petrii, - строгие аэробы. Температура выращивания бордетелл 35 - 37 °C. Бордетеллы требовательны к условиям роста: 130 - 150 мг% аминного азота, кровь, дрожжевой экстракт, никотиновая кислота, аминокислоты (цистин, пролин, метионин, серин, глютамин и др.).Наиболее требователен возбудитель коклюша, он растет только на специальных средах, в то время как остальные представители рода растут на кровяном агаре. Классической средой для первичного выделения B. pertussis является среда Борде-Жангу (картофельно-глицериновый агар), позднее были предложены синтетические и полусинтетические среды, в частности казеиново-угольный агар (КУА). На указанных средах бордетеллы вырастают в виде характерных колоний: на среде Борде-Жангу - выпуклые, гладкие, блестящие, серебряного цвета, напоминающие капли ртути, окруженные зоной гемолиза; на КУА - выпуклые, гладкие, серого цвета, с жемчужным, желтоватым или беловатым оттенком. Колонии маслянистые, легко снимаются петлей. B. parapertussis и B. holmesii за счет образования пигмента вызывают потемнение сред с кровью, образуют бурую подложку.

Возбудители коклюша и паракоклюша - облигатные паразиты, нестойкие. Погибают при прогревании до 50 °C за 30 мин. при обработке дезинфицирующими растворами. Во внешней среде не сохраняются. Устойчивы ко многим антибиотикам.

B. pertussis наименее активна ферментативно, образует оксидазу. B. parapertussis вырабатывает ферменты тирозиназу и уреазу и не образует оксидазы. Наиболее активна B. bronchiseptica: вырабатывает уреазу, оксидазу, утилизирует цитраты, восстанавливает нитраты до нитритов.

К факторам патогенности B. pertussis в первую очередь относят коклюшный токсин. Это экзотоксин, белок, состоящий из двух функциональных частей (A и B) и пяти структурных субъединиц (S1 - S5): фрагмент A (соответствует субъединице S1) - обладает ферментативной активностью, ингибирует клеточную аденилатциклазу. Участок B (состоит из субъединиц S2 - S5) отвечает за присоединение токсина к рецепторам клеток-мишеней. Токсин обладает высокой иммуногенностью, в инактивированной форме включен в состав всех бесклеточных коклюшных вакцин. Определение антител к коклюшному токсину методом ИФА применяется для диагностики коклюша и контроля эффективности вакцинации.

Филаментозный гемагглютинин - поверхностный белок, участвующий в адгезии, обладает протективными свойствами. Включен в состав бесклеточных коклюшных вакцин. В ряде коммерческих ИФА-тест-систем для диагностики коклюша предлагается определять уровень антител различных классов к антигенному комплексу, в состав которого входят гемагглютинин и коклюшный токсин. В отличие от токсина гемагглютинин не является строго специфичным для B. pertussis, присутствует также у B. parapertussis, может давать перекрестные реакции с H. influenzae, C. pneumoniae и рядом других бактерий.

Пертактин - белок наружной мембраны, относится к системе адгезинов, продуцируемых бактериями при попадании в человеческий организм. Обладает протективными свойствами, входит в состав ряда бесклеточных коклюшных вакцин.

Аденилатциклаза-гемолизин - это комплекс экзоферментааденилатциклазы, которая при попадании в клетки катализирует образование цАМФ, с токсином - гемолизином. Токсин - основной фактор патогенности, действующий на начальном этапе инфекции, кроме того с ним связывают протективные свойства комплекса.

Агглютиногены - поверхностные белки, ответственные за выработку агглютинирующих антител. У бордетелл выделено 16 агглютиногенов. В зависимости от наличия в бактериальной клетке агглютиногенов 2 и 3 выделяют четыре серотипа B. pertussis: 1.2.0; 1.0.3; 1.2.3; 1.0.0. Понятие об агглютиногенах тесно связано с фимбриями (Fim). В геноме всех B. pertussis присутствуют гены fim2 и fim3, то есть теоретически любой штамм может продуцировать агглютиногены 2 и/или 3. Фимбрии включены в состав некоторых бесклеточных коклюшных вакцин.

Серотипирование B. pertussis в отечественной практике основано на агглютинации бактериальных клеток монофакторными сыворотками, т.е. антителами к агглютиногенам, в реакции агглютинации (РА) на стекле, а в зарубежной практике - на агглютинации бактериальных клеток моноклональными антителами к фимбриальным антигенам в реакции агглютинации в микропланшете. Для диагностики коклюша в России до настоящего времени используется РА с цельноклеточнымдиагностикумом, в которой определяются агглютинирующие антитела к агглютиногенам.

Все вышеперечисленные факторы присутствуют у свежевыделенных штаммов коклюшного микроба. Однако при хранении на искусственных питательных средах проявляется изменчивость возбудителя. Установлено, что в процессе сапрофитизации коклюшный микроб проходит четыре фазы: свежевыделенный микроб (гладкий штамм), обладающий высокими вирулентными и иммуногенными свойствами, относится к первой фазе. По мере перехода к четвертой фазе постепенно утрачивается иммуногенность, вирулентность, меняются культурально-биологические свойства.

2.1.Возбудитель дифтерии. Морфологические, культуральные, биохимические и антигенные свойства.

Биовары. Дифференциация возбудителя дифтерии и условно-патогенных коринебактерий.

Факторы патогенности, дифтерийный токсин, генетический контроль его образования.

Патогенез дифтерии. Бактерионосительство.

В род Воrdetella включены Bord. Pertussis, Bord. Parapertussis, Bord. Bronchoseptica.

Вordetella pertussis выделена от больных коклюшем в 1906 году Ж Борде и О Жангу.

Морфология Возбудитель коклюша представляет собой мелкие неподвижные коккобактерии, они слабо окрашиваются обычными анилиновыми красками, причем концы клеток воспринимают краситель более интенсивно, грамотрицательны.

Колонии 1 и 2-й фазы мелкие с ровными краями, выпуклые (S-форма). При микроскопии мазков обнаруживаются небольшие с закругленными концами овоидные бактерии, которые хорошо агглютинируются до титра гомологичными сыворотками. Колонии 3 и 4-й фазы ( R-формы) крупные, плоские, блестящие; бактерии агглютинируются сыворотками 1 и 2-й фаз, но агглютинируются до титра гомологичными сыворотками.

Ферментативные свойства. Бардетеллы не ферментируют белки, углеводы, мочевину, образуют каталазу.

Токсинообразование. Возбудитель коклюша образует термолабильный экзотоксин, вызывающий у кроликов и морских свинок геморрагический отек, некроз и изъязвление, продуцирует гистаминсенсибилизирующий и стимулирующий лимфоцитоз факторы.

Бактерии коклюша обладают способностью коагулировать плазму крови кролика, барана, теленка и человека.

Антигенная структура. Бактерии рода Bordetella содержат общий термостабильный соматический О антиген и различные специфические агглютиногены. У бордетелл выявлено 14 антигенных комнонентов ( факторов). Фактор 7 является родовым, общим для всех бордетелл; фактор 1 свойственен Bord. pertussis, фактор 14- Bord, parapertussis, фактор 12 - у Bord. Bronchoseptica. чаще других у Bord. pertussis встречаются типы 1,2;1,3 и 1,2,3. У Bord. parapertussis - 8,9,10,a У Bord. Bronchoseptica- 8,9,10,11,13.

Перекрестного иммунитета между палочкой коклюша, паракоклюша и бронхосептика не наблюдается.

Патогенез заболевания у человека. Возбудитель передается от больного к здоровому воздушно-капельным путем. Наиболее заразны больные в катаральный период. Роль различных предметов, окружающих больного, в связи с неустойчивостью возбудителя к воздействию факторов внешней среды ничтожна. Источника инфекции могут быть больные с атипичными формами болезни. Коклюш является болезнью детей младшего возраста. Инкубационный период длится 9 суток. Болезнь характеризуется типичными симптомами и цикличным течением. Различают три периода типичного коклюша: 1) катаральный период продолжается около 2 недель; 2) конвульсивный период ( судорожного кашля) сопровождается приступами кашля при нормальной температуре тела и продолжается 4-6 недель; 3) период угасания ( разрешения) длится 2-3 недели.

Бактерии размножаются в слизистой оболочке верхних дыхательных путей; в кровь они не проникают. Экзотоксины, выделяемые палочкой коклюша, вызывают катаральное воспаление слизистой оболочки трахеи и бронхов; раздражают рецепторы слизистой оболочки и обуславливают непрерывный поток импульсов в центральную неврную систему, образуя стойкий очаг возбуждения. Приступы кашля развиваются под влиянием как специфических ( экзотоксин), так и неспецифических ( звук, инъекции, осмотры) раздражителей. При возникновении более сильных центров возбуждения доминантный очаг возбуждения угасает, приступы прекращаются.

Лабораторная диагностика. Объектами исследования являются мокрота больных или отделяемое слизистой оболочки носоглотки. Материал берут специальным тампоном. Мокроту сеют на среду Борде-Жангу, молочно-кровяной агар, гидрализатно-казеиновую среду, казеиново-угольную среду и др. Для подавления роста посторонней микрофлоры добавляют антибиотики (пенициллин) Хороший результат дает метод “кашлевые пластинки”. Через 2-5 суток роста на среде Борде=Жангу появляются т+ипичные мелкие колонии, выпуклые, блестящие, похожие на перламутр или капли ртути. Выделенную чистую культуру идентифицируют по морфологическим, культуральным, биохимическим и антигенным свойствам. Со второй недели болезни ставят реакцию агглютинации с помощью которой выявляют не только типичные, но и атипичные формы заболевания.

Коринебактерии К группе Coryneform, роду Сorynebacterium относят бактерии, имеющие булавовидные утолщения на концах: коринебактерии, патогенные для человека и животных, коринебактерии для растений непатогенные коринебактерии (дифтероиды).

коринебактерии дифтерии (Corynebacterium diphtheriae). Нетоксигенные коринебактерии дифтерии не вызывают дифтерийную инфекцию. “Этиологическая” значимость этих микроорганизмов при неинфекционной Возбудителем дифтерийной инфекции являются Токсигенные патологии ( фарингит, артрит, эндокардит и т.д.) требует специального доказательства.

Таксономически близкими виду коринебактерий дифтерии являются C. ulcerans и C. pseudotuberculosis ( C. ovis). Данные микроорганизмы природные патогены крупного и мелкого рогатого скота, лошадей. Отмечена способность этих видов бактерий вырабатывать токсин, подобный дифтерийному. Встречаются и “нетоксигенные” штаммы. Известны случаи выделения “токсигенных” C. ulcerans при клинической картине заболевания, сходного с дифтерией.

На слизистой оболочке ротоглотки и носа в норме часто встречается ложнодифтерийная палочка Гофмана ( C pseudodiphthericum).

Леффлер Ф. (1884) выделил возбудитель в чистой культуре, Э. Ру и Иерсен А. (1888) получили токсин, Э Ру (1894) Беринг и Китозато (1890) получили -антитоксическую сыворотку, Р. Рамон (1923) получил дифтерийный анатоксин.

Морфология Дифтерийные коринебактерии - прямые или слегка изогнутые палочки, им характерен значительный полиморфизм- разнообразие размеров и формы клеток. Клетки имеют форму булавы, ракетки, овоида. Взаиморасположение клеток напоминает римские цифры Х,V. При окраске часто обнаруживается выраженная внутриклеточная исчерченность, что объясняется наличием зерен волютина. Описано сродство волютина к метиленовому синему и, при обработке этим красителем, гранулы или полоски ( скопления гранул) прокрашиваются в синий цвет, а протоплазма в отдельных случаях может приобретать розовый оттенок. Использование в бактериологической практике окраски по Граму является нецелесообразным, поскольку клетки C. Diphtheriae легко обесцвечиваются спиртом и могут выглядеть в мазках грамвариабельными или даже грамотрицательными. Для C. ulcerans b C. pseudodiphthericum характерна склонность к параллельному расположению клеток. 24-48 часовые культуры этих видов имеют чаще всего овоидную форму клеток. У дифтерийных коринебактерий наблюдаются булавовидные утолщения по концам; иногда появляются ветвистые и нитевидные формы, а также короткие образования, почти кокковидные и дрожжеподобные. В мазках они располагаются под углом, принимая вид растопыренных пальцев, не образуют спор, капсул и жгутиков, грамположительны.

Культивирование. Возбудитель дифтерии - аэроб или факультативный анаэроб, оптимальная температура роста 37 град. Хорошо культивируется на средах, содержащих белок ( свернутая сыворотка), кровяной агар, сывороточный агар), а также на сахарном бульоне. Для первичного посева исследуемого материала используются следующие питательные среды: среда Клауберга 11( к питательной основе добавляется глицериновая смесь, “лаковая кровь” и теллурит калия), Кровяной теллуритовый агар (КТА), сывороточный агар (для отсева колоний), мартеновский агар с мясной водой двойной концентрации сухая хинозольная дифференциально-диагностическая среда Бучина. Дифтерийные коринебактерии развиваются в течение 16=18 часов; рост их напоминает шагреневую кожу; колонии между собой не сливаются.

По культуральным и биологическим свойствам коринебактерии дифтерии подразделяются на три биовара:gravis, mitis и intermedius, которые отличаются друг от друга по ряду признаков. Коринебактерии биовара гравис, как и колонии C.ulcerans на теллуритовом агаре, содержащем дефибринированную кровь и теллурит калия, через 48 часов образуют крупные шероховатые R-формы розеткообразные колонии черного или серого цвета имеют радиальную исчерченность.

Коринебактерии дифтерии вариант гравис ферментируют декстрин, крахмал и гликоген, в бульоне образуют поверхностную пленку и зернистый осадок, обычно высокотоксичны и обладают более выраженными инвазионными свойствами.

Коринебактерии биовара митис на теллуритовом агаре растут с образованием темных гладких S форма блестящих колоний. Они ферментируют крахмал и гликоген, декстрин ферментируют не постоянно, вызывают гемолиз эритроцитов всех видов животных, в бульоне отмечается диффузное помутнение. Культура этого типа, как правило менее токсигенны и инвазионны, чем коринебактерии биовара гравис.

Коринебактерии биовара интермедиус занимают промежуточное положение. Колонии у них на теллуритовом агаре мелкие ( R-,S-формы), черного цвета, не ферментирует крахмал и гликоген, в бульоне растут с появлением мути и зернистого осадка. Колонии C. pseudodiphthericum имеют характерный светлый ободок.

Ферментативные свойства Дифтерийные коринебактерии ( все три биовара) не свертывают молоко, не разлагают мочевину, не выделяют индол, слабо образуют сероводород, восстанавливают нитраты в нитриты, а также теллурит калия в сульфат теллурита, вследствие чего колонии дифтерийных коринебактерий на теллуритовом агаре становятся четными или серыми. Дифтерийные коринебактерии ферментируют глюкозу и мальтозу, непостоянно - галактозу, крахмал, декстрин, глицерин.

Дифтерийный экзотоксин представляет собой сложный комплекс. Он получен в кристаллическом виде.

Токсигенные штаммы дифтерийных коринебактерий наряду с лизогенностью характеризуются выраженной дегидрогиназной и нейраминидазной активностью.

Под влиянием умеренного фага ( конвертирующий фаг) коринебактерии биовара гравис в ряде случаев происходит фаговая конверсия непатогенных коринебактерий биовара митис в Токсигенные. Дифтерийные коринебактерии продуцируют бактериоцины ( коринецины), наделяющие их некоторыми селективными преимуществами.

Антигенная структура. Путем реакции агглютинации у возбудителя дифтерии установлено 11 сероваров.

Токсины, образуются различными штаммами биовара гравис и митис, не различаются между собой и полностью нейтрализуются стандартным дифтерийным антитоксином. Рядом авторов установлено наличие у коринебактерий дифтерии вариантоспецифических термолабильных поверхностных белковых антигенов ( К-антигенов) и группоспецифических термостабильных соматических полисахаридных антигенов.

Среди коринебактерий дифтерии имеется 19 фаготипов, с помощью которых выявляются источники инфекции; фаготипы учитываются также при идентификации выделенных культур.

Патогенез заболевания у человека. Источником инфекции являются больные и носители. Заразное начало передается воздушно-капельным путем, иногда с частицами пыли; передача возможна также через различные предметы( игрушки, посуда, полотенца, и платки и т.д.), пищевые продукты ( молоко, различные холодные блюда и другое), инфицированные дифтерийными коринебактериями.

В эпидемиологии дифтерии большую роль играют носители. В среднем число носителей из реконвалесцентов и здоровых лиц колеблется в пределах 3-5%.

Наибольшая заболеваемость дифтерией отмечается в осенние месяцы года, что объясняется скученностью и снижением сопротивляемости организма под влиянием охлаждения.

В патогенезе дифтерии ведущую роль играет гистотоксин, которых блокирует протиосинтез в клетках млекопитающих, инактивирует Фермент трансферазу, ответственную за образование полипептидной цепи.

Дифтерийные коринебактерии благодаря наличию у них диффузионного фактора обладают способностью протекать в кровь и ткани больных людей и зараженных животных. Диффузионный фактор представляет собой фермент гиалуронидазу, обладающую способностью расщеплять гиалуроновую кислоту. К факторам инвазионности относятся нейраминидаза, некротический фактор, фибринолизин.

В клинике и эксперименте на животных доказано влияние на развитие болезни патогенных стафилококков и стрептококков, которые в значительной степени усиливают тяжесть инфекции.

У человека на месте внедрения возбудителя дифтерии ( зев нос, трахея, коньюнктива глаза, кожа, вульва влагалища, раневая поверхность) образуются пленки с большим количеством дифтерийных коринебактерий и других микробов. Продуцируемый экзотоксин вызывает некроз и воспаление слизистых оболочек или кожи; всасываясь он поражает нервные клетки, сердечную мышцу и паренхиматозные органы, обусловливает явление общей, тяжелой интоксикации. Глубокие изменения происходят в сердечной мышце, сосудах, надпочечнике, а также в центральной и периферической нервной системы.

По локализации процесса наиболее часто наблюдается дифтерия зева и дифтерийный круп, затем дифтерия носа. Сравнительно редко встречается дифтерия глаз, ушей, половых органов, кожи. На дифтерию зева приходится более 90% всех заболеваний, второе место занимает дифтерия носа.

Лабораторная диагностика. Объектом для исследования служит отделяемое зева, носа, иногда вульвы, глаз, кожи, которые берут стерильным ватным тампоном.

Материал, подлежащий исследованию, высевают на специальные среды- свернутую сыворотку, среду Клауберга 11, кровяной теллуритовый агар, сывороточно-теллуритовый агар и другие. Через 12-24-48 часов культивирования производится микроскопия мазков. По результатам микроскопии дают предварительный ответ,

В бактериологической практике опираться только на морфологические свойства колоний или микробной клетки при идентификации C. diphtheriae, не представляется возможным. Описаны случаи бактериологической гипо- и гипердиагностики ( в 55% и 14,5% случаев соответственно). Когда используется только учет морфологических признаков. При идентификации коринебактерий дифтерии необходимо использовать комплекс тестов, в первую очередь, определение патогенности (токсигенности), основного признака возбудителя дифтерии.

Определение токсигенных свойств производится бактериологами в первые сутки роста подозрительных колоний на чашках первичного посева материала. Во избежание ошибок при определении токсигенных свойств коринебактерий, необходимо изучать данный признак у максимального числа выросших колоний с чашек первичного посева.

Ферментативная активность микроорганизмов изучается путем определения ферментов цистиназы, уреазы, способности расщеплять до кислоты глюкозу, сахарозу, крахмал. В редких случаях, когда необходимо идентифицировать C. ulcerans, добавляется тест на восстановление нитратов в нитриты.

Таким образом, выделенный микроорганизм является возбудителем дифтерии, если он обладает токсигенными свойствами, определенным спектром ферментативной активности ( расщепление глюкозы, крахмала, отсутствие разложения сахарозы, наличие фермента цистиназы, отсутствие фермента уреазы) и характерными морфолого-культуральными признаками ( образование колоний черного или серого цвета на кровяно-теллуритовых средах, с учетом, при необходимости, морфологии клеток - полиморфные, не образующие спор палочки).

В настоящее время для выявления слаботоксигенных штаммов C. diphtheriae, определения уровня токсинообразования циркулирующих штаммов и, в некоторых случаях, для сокращения сроков идентификации дифтерийного токсина и выдачи предварительного ответа может использоваться реакция непрямой гемагглютинации для выявления дифтерийного токсина.

РНГА-двухкомпонентная реакция, предполагающая использование диагностикума эритроцитарного дифтерийного антительного, действующим началом которого являются связанные с эритроцитами очищенные специфической сорбцией поликлональные антитоксические противодифтерийные антитела *антитоксин), вступающий во взаимодействие лишь с дифтерийным токсином ( анатоксином). При наличии в исследуемой пробе токсина образуется специфический комплекс: дифтерийный токсин+сенсибилизированные антитоксином эритроциты. В результате формируется осадок в виде агглютината эритроцитов.

Для изучения напряженности противодифтерийного иммунитета проводят определение уровня антитоксических противодифтерийных антител в сыворотке крови человека в ВПГА.

Реакция пассивной гемагглютинации ( РПГА) - двухкомпонентная реакция, предполагающая взаимодействие диагностикума эритроцитарного дифтерийного антигенного, который представляет собой эритроциты с адсорбированными на них дифтерийным анатоксином, и антитоксических противодифтерийных антител, находящихся в сыворотке крови обследуемых. При наличии в исследуемой сыворотке антитоксина образуется специфический комплекс: антитоксин+ сенсибилизированные анатоксином эритроциты. В результате формируется осадок в виде агглютината эритроцитов.

Пяткин К.Д., Кривошеин Ю.С.- Микробиология, М. 1981

Тимаков В.Д. ,Левашев В.С. Борисов Д.В.- Микробиология, М, 1983

Джавец Э., Мельник Дж. Л., Эйдельберг Э.А.- Руководство по медицинской микробиологии, М., 1982.

Читайте также: