Элективная среда для культивирования возбудителя дифтерии

Обновлено: 24.04.2024

Дифтерия – это острое инфекционное заболевание, вызываемое дифтерийной палочкой Corynebacterium diphthеriae. Заболевание характеризуется воспалительным процессом слизистых оболочек(значительно реже кожи) с образованием фибринозных пленок и общей интоксикацией.

Чаще всего воспалительный процесс развивается в зеве, гортани, трахеи. Реже в других органах (встречается дифтерия половых органов, кожи). Возбудитель дифтерии был открыт в 1883 году Клебсом, а впервые выделил культуру этих бактерий в 1884 году3 Леффлер.

C.diptheriae полиморфны, могут иметь булавовидные утолщения на концах (corine – булава). Иногда у них могут появляться ветвистые формы. Но чаще всего дифтерийные коринебактерии имеют прямую форму размерами 0,3-0,8 х 3-8 мкм.

В микропрепаратах палочки располагаются под углом друг к другу. У C.diptheriae по полюсам клетки расположены по одному зерна валютина (зерна Бабеша-Эрнста), которые можно обнаружить при окрашивании препаратов по Нейссеру или по Леффлеру.

Возбудители дифтерии грамположительны. Неподвижны, жгутиков не имеют. Спор и капсул не образуют.

Коринебактерии продуцируют экзотоксин, обладающий гистотоксическим, дермонекротизирующим и гемолизирующим действием.

Бактерии хорошо развиваются при 370С на элективных питательных средах (при рН 7,2-7,4), содержащих кровь или сыворотку.

По степени вирулентности с учетом культуральных и биохимических свойств принято различать три типа дифтерийных бактерий: тип gravis (вызывает наиболее тяжелое заболевание), тип mitis (вызывает легкие формы заболевания) и тип intermedius (промежуточный).

C.diphtheriae имеют термолабильные типоспецифические белковые и группоспецифические термостабильные полисахаридные антигены.

Дифтерийные бактерии хорошо развиваются при 37 г8радусах на элективных питательных средах (при рН 7,2 – 7,4), содержащих кровь или сыворотку.

Для культивирования дифтерийных бактерий широко используются среда Ру (свернутая лошадиная сыворотка), среда Леффлера (свернутая бычья сыворотка с глюкозным бульоном) и сывороточный агар.

Дифтерийные бактерии на плотных питательных средах развиваются 18 – 20 часов, образуя колонии, не сливающиеся между собой.

Тип gravis по способу биологического окисления приближается к аэробам, а тип mitis – к факультативным анаэробам.

При культивировании на плотных питательных средах тип gravis образует колонии R- формы, тип mitis образует колонии S- формы.

На жидкой питательной среде бактерии дифтерии типа gravis образуют на поверхности пленку и зернистый осадок, бульон при этом остается прозрачным. Палочки типа mitis в этих же условиях образуют более нежную пленку и равномерное помутнение бульона. Коринебактерии intermedius на бульоне растут с образованием равномерного помутнения питательной среды и зернистого осадка на дне пробирки.

Ферментативные особенности дифтерийных палочек имеют большое значение при их дифференцировке.

Все три типа дифтерийных бактерий не ферментируют манит, сахарозу и мочевину.

Коринебактерии типа gravis ферментируют декстрин, крахмал и гликоген. На кровяном агаре с телуритом образуют относительно крупные матовые серо - черные колонии с волнистым краем и радиально исчерченной поверхностью. Дифтерийные палочки типа mitis на этой же среде образуют колонии круглые, выпуклые, блестящие черные и гладкой поверхностью и ровным краем, непостоянно ферментируют декстрин, крахмал и гликоген вообще не ферментируют.

Коринебактерии типа intermedius занимают промежуточное положение, На агаре с теллуритом они образуют мелкие черные блестящие колонии, ферментируют крахмал и гликоген.

По антигенной структуре различают 11 серологических вариантов бактерий дифтерии. У них есть вариантоспецифические термолабильные поверхностные белковые антигены и группоспецифические термостабильные соматические полисахаридные антигены.

Следует отметить, что экзотоксин, продуцируемый разными штаммами типов gravis и mitis по антигенной структуре не дифференцируются и поэтому нейтрализуются одной и той же дифтерийной антитоксической сывороткой. Дифтерийные бактерии сравнительно устойчивы к действию факторов окружающей среды.

Выделяясь во внешнюю среду со слизью из зева или с фибринозными пленками, бактерии дифтерии при комнатной температуре на свету могут до 3 недель сохранять жизнеспособность. В пленках от дифтерийных больных при комнатной температуре в темноте бактерии сохраняются несколько месяцев. Хорошо переносят высушивание. Не изменяют вирулентности под воздействием малых концентраций дезинфицирующих веществ.

В засохших пленках из зева больного сохраняются до 3 месяцев, на белье, обуви, верхней одежде больного – до 4 недель, в мокроте – до 3 месяцев. На посуде, книгах, игрушках, которыми пользовался больной – до 30 дней, на вилках и ложках – до 24 часов.

Дифтерийные бактерии устойчивы к низким температурам. Присутствие света, влаги, а также высокая температура обуславливают их быструю гибель. На рассеянном свету дифтерийные бактерии погибают в течение 4-8 часов, в чистой воде – через 8 часов, при 500С – через 10 минут.

Чувствительны к дезинфицирующим средствам. В 10% перекиси водорода микробы погибают через 3 минуты, в 1% растворе карболовой кислоты – через 10 минут, в 1% растворе сулемы, в 5% растворе хлорамина и в 50-ти градусном этиловом спирте – через 1 минуту.

Очень чувствителен к действию различных факторов дифтерийный экзотоксин. Он легко разрушается под влиянием света, кислорода воздуха, повышенной температуры. Более устойчив к действию ультразвука.

Источником инфекции являются больные дифтерией, реконвалесценты или носители (среди здоровых людей носители составляют до 5%).

Возбудитель в основном передается аэрогенным путем (воздушно-капельным или воздушно-пылевым). Передача возбудителя возможна и через различные предметы (игрушки, посуду, книги, полотенца, белье и пр.), а также через инфицированные коринебактериями пищевые продукты (молоко, холодные блюда и пр.).

Заболеваемость дифтерией и носительство дифтерийных микробов наблюдается повсеместно независимо от климато-географических условий. Сезонность при дифтерии выражена отчетливо. Максимум заболеваний приходится на холодную пору года, минимум – на теплую. Около 80% всех случаев заболеваемости приходится на детей. Наиболее уязвимы дети до 16 лет.

Наиболее частыми воротами дифтерийной инфекции служит слизистая оболочка зева и носа, хотя местом проникновения дифтерийных бактерий могут быть также слизистая оболочка гортани, трахеи, глаз, половых органов, места повреждения кожных покровов.

При инфицировании человека коринебактериями дифтерии, возбудитель размножается на месте внедрения. По месту локализации возбудителя различают дифтерию зева, носа, кожи, половых органов, глаз, ушей. Чаще всего (в 90% случаев) регистрируется дифтерия зева, в меньшем количестве случаев – дифтерия носа. Остальные варианты дифтерии встречаются редко.

По истечении инкубационного периода (2-7 дней), в результате размножения дифтерийных бактерий в тканях и действия токсина на слизистую оболочку, развивается патологический процесс на месте локализации клеток возбудителя. Вначале это проявляется в виде катарального, а затем через 1-3 дня в виде фибринозного дифтерического или крупозного воспаления. При развитии процесса на слизистых оболочках, покрытых многослойным плоским эпителием (полость зева, глотки), возникает воспаление, при котором фибринозная пленка плотно связана с подлежащей тканью.

Ведущую роль в развитии клинических проявлений играет гистотоксин, выделяемый размножающимися коринебактериями дифтерии.

Токсин оказывает не только местное действие. Токсином поражаются нервная и сердечнососудистая системы, надпочечники и почки.

По степени интоксикации организма различают легкие, субтоксические и токсические формы дифтерии. Особенно тяжело протекают токсическая и геморрагическая формы дифтерии зева.

Исход заболевания зависит от тяжести течения, сроков начала серотерапии, а также от развития тех или иных осложнений, связанных с поражением миокарда, нервной системы, почек и надпочечников.

Важную роль в борьбе с распространением инфекции играет выявление бактерионосителей.

Каждый больной дифтерией независимо от клинической формы подлежит госпитализации в инфекционное отделение. В очаге инфекции (в квартире), где находился больной до госпитализации, делают тщательную дезинфекцию помещения. Обстановки, предметов ухода за больным, посуды, белья и прочих предметов с которыми контактировал больной.

Необходимо помнить о том, что выделение вирулентных дифтерийных бактерий после клинического выздоровления больного во многих случаях может продолжаться до 14 дней.

Лица, находившиеся в контакте с больным, подлежат карантину, длящемуся до получения отрицательных результатов бактериологического исследования, прежде всего материала из зева и носа.

Специфическая профилактика осуществляется введением вакцины (дифтерийный анатоксин), обеспечивающей создание антитоксического иммунитета. Дифтерийный анатоксин может быть применен как моновакцина (адсорбированный дифтерийный анатоксин) или в сочетании со столбнячным анатоксином (адсорбированный дифтерийно – столбнячный анатоксин), а также со столбнячным анатоксином и коклюшной бактериальной вакциной (адсорбированная коклюшно – дифтерийно – столбнячная вакцина).

Лабораторная диагностика при подозрении на дифтерию проводится тремя методами: микроскопическим, иммунной флюоресценции и выделения и идентификации возбудителя.

Лабораторная диагностика особенно важна при стертых и атипичных формах дифтерии, что все чаще стали регистрироваться в последние годы.

Материалом для исследования в большинстве случаев служат выделения зева, носа, реже – вульвы, глаз, кожи.

Предварительно, ориентировочно ответ можно получить (через 30 – 60 минут), сделав мазок тампоном на предметном стекле. Мазок высушивают, фиксируют, окрашиваю по Грамму, Леффлеру и микроскопируют.

Однако, поскольку в последнее время нередко приходится встречаться с атипичными формами дифтерийных бактерий, лабораторную диагностику дифтерии нельзя ограничивать только классическим микроскопическим или флюоресцирующим методами.

Основным методом лабораторной диагностики при подозрении на дифтерию является выделение и идентификация возбудителя по культуральным, биохимическим и токсигенным свойствам.

Следует помнить, что к роду коринебактерий кроме C.diphtheriae, относятся и другие виды, в том числе псевдодифтерийная палочка Гофмана и дифтероиды, виды патогенные для животных.

Выделение чистой культуры проводится путем посева исследуемого материала на сывороточную, кровяную и теллуритовую среды. Для дифференцировки истинных дифтерийных бактерий от ложнодифтерийных и дифтероидов посев делается уколом на 0,5% сахарный агар столбиком и на агаровую среду с 0,2% добавкой масляно – кислого натрия.

В первом случае вырастут только истинные дифтерийные бактерии, во втором – только дифтероиды и ложнодифтерийные бактерии.

Истинные дифтерийные бактерии не расщепляют уреазу, но расщепляют цистин до сероводорода. Токсигенность дифтерийных бактерий можно определить in vitro диффузным методом.

Выявление дифтерийной палочки. Принципы микробиологической диагностики дифтерии. Диагностика дифтерии. Культивирование дифтерии. Определение токсигенности дифтерийной палочки.

С целью раннего выявления дифтерии и определения носителей дифтерийной палочки необходимы выделение и идентификация возбудителя, а также определение его способности к токсинообразованию. Материалом для исследования служат дифтеритические плёнки, слизь из носоглотки или отделяемое из подозрительных поражений кожных покровов.

Забор материала на дифтерию проводят двумя стерильными тампонами: один используют для посева, с другого делают мазки и окрашивают их по Граму и Найссеру. Взятый материал следует доставлять в лабораторию не позднее чем через 3 ч.

Бактериоскопия дифтерийной палочки

Окраска по Граму не является специфичной, так как дифтерийные палочки сравнительно плохо воспринимают красители, но позволяет косвенно идентифицировать непатогенные коринебактерии, располагающиеся в виде палисада (параллельно) или в виде китайских иероглифов. Окраска по Найссеру позволяет выявить характерные зёрна Бабеша-Эрнста и отличить дифтерийную палочку от ложнодифтерийной палочки С. pseudodiphtheriticum (С. hofmannii), часто обитающей в носоглотке.

Культивирование дифтерийной палочки

Бактерии дифтерии выделяют посевом на элективные среды с теллуритом (например, Клауберга II или Маклёода), ложнодифтерийная палочка (палочка Хофманна) теллур не восстанавливает (см. рис. 8 на вклейке). Для выделения чистой культуры дифтерии часть подозрительной колонии засевают на скошенный агар (или среду Ру), вторую часть — на твёрдую питательную среду для определения токсигенности и (не обжигая петли) проводят определение цистиназной активности (проба Пизу). При положительном результате наблюдают образование коричневого облачка вокруг линии укола. Чистую культуру идентифицируют на средах Хйсса, пользуясь укороченным пёстрым рядом (глюкоза, мальтоза, сахароза, мочевина), что позволяет отличить С. diphtheriae от непатоген пых коринебактерии (рис. 14-3).

Определение токсигенности дифтерийной палочки

Определение токсигенности дифтерийной палочки in vivo. Проводят подкожным или внутрикожным заражением 0,5-1,0 мл бактериальной культуры морских свинок массой 250 г. За 24 ч до заражения одно животное иммунизируют дифтерийным антитоксином. При положительном результате неиммунизированные животные погибают в течение 3-5 сут.

Фаготипирование дифтерийной палочки

Для дифференциальной диагностики возбудителей используют набор из 9 кори нефагов. С его помощью можно типировать большинство токсигенных и нетоксигенных штаммов биовара gravis.

Культуральные свойства дифтерийной палочки. Культуральные особенности биоваров дифтерии. Биохимическая активность палочки Клебса-Лёффлера. Бактериоцины дифтерии.

Культуральные свойства дифтерийной палочки. Дифтерийная палочка хорошо растёт при 36-37 °С; оптимум рН 7.4-8,0. Питательные среды должны содержать аминокислоты, витамины, ионы металлов (Са2+, Mg2+ Fe2+ и др.), играющие роль ростовых факторов. На сывороточных средах (например, среде Лёффлера) дают рост уже через 10-12 ч; за это время контаминирующая микрофлора обычно не успевает развиться. Наибольшее распространение получили среды с теллуритом, так как возбудитель резистентен к высоким концентрациям теллурита калия или натрии, ингибирующим рост сопутствующей микрофлоры.

На таких средах дифтерийная палочка образует серовато-чёрные колонии в результате восстановления теллурита до металлического теллура, аккумулирующегося внутри бактерий (рис. 8, см. цветную вклейку). В жидких средах образуют помутнение и осадок; их образование и характер варьируют у различных биоваров.

Биохимическая активность дифтерии

Палочка Клебса-Лёффлера сбраживает с образованием кислоты глюкозу, мальтозу, галактозу, декстрин; не разлагает сахарозу, лактозу, маннит. Способность разлагать крахмал и гликоген варьирует у различных штаммов, что используют для внутривидовой дифференцировки.

Дифтерийная палочка не гидролизует мочевину и не образует индол. Отсутствие способности ферментировать сахарозу и разлагать мочевину — дифференцирующий признак, отличающий дифтерийную палочку от других коринебактерий. Другой дифференцирующий признак — способность разлагать цистин. С. diphtheriae продуцирует каталазу, гиалуронидазу, нейраминидазу, ДНКазу, уреазу и др.

Цистиназная активность — дифференцирующий признак дифтерийной палочки. Дифтерийная палочка лизирует эритроциты морской свинки и кролика.

Биовары возбудителя дифтерии существенно различаются по культуральным и биохимическим свойствам. Среди дифференциально-диагностических биохимических тестов наиболее часто учитывают различия в способности разлагать углеводы и мочевину.

Бактериоцины дифтерии

Дифтерийная палочка образует бактериоцины (корицины), обладающие узким спектром действия. Гены, кодирующие синтез бактериоцинов, передаются плазмидами. Бактериоцины дифтерийной палочки образуют как токсигенные, так и нетоксигенные штаммы.

- Вернуться в оглавление раздела "Микробиология."

Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.

Группа коринебактерий включает представителей родов Corynebacterium представленные неподвижными палочковидными бактериями, способными к ветвлению.

Коринебактерии. Corynebacterium diphtheriae

Род Corynebacterium семейства Corynebacteriaceae отдела Firmicutes образуют неподвижные прямые или слегка изогнутые палочки, окружённые микрокапсулой. Большинство видов коринебактерий — облигатные паразиты слизистых оболочек — патогенные и условно-патогенные для животных и человека виды.

Возбудитель дифтерии. Дифтерийная палочка ( палочка Клебса-Лёффлера ). Дифтерия. Гаротильо

Дифтерия — острое инфекционное заболевание, вызываемое Corynebacterium diphtheriae и её токсином. Дифтерийные палочки вызывают воспаление воздухоносных путей, реже кожных покровов. Токсин палочки Клебса-Лёффлера приводит к дегенерации периферических нервов, сердечной мышцы и других тканей.

Возбудитель дифтерии — Corynebacterium diphtheriae; впервые его выделил Э. Клебс (1883), а чистую культуру возбудителя получил Ф. Лёффлер (1884).

Эпидемиология дифтерии. Распространенность палочки дифтерии

Резервуар дифтерии — человек (больной, реконвалесцент, бактерионоситель); наибольшую эпидемическую опасность представляют больные лица. Реконвалесценты выделяют дифтерийную палочку в течение 15-20 сут. Основной путь передачи дифтерийной палочки — воздушно-капельный; также возможно заражение через предметы, используемые больным, и инфицированные пищевые продукты (обычно молоко).

При комнатной температуре во влажной атмосфере палочка Клебса-Лёффлера сохраняется долго. При 60 °С дифтерийная палочка отмирает в течение 10 мин; в высушенных плёнках выдерживает температуру 98 "С в течение 1 ч, а при комнатной температуре может сохраняться до 7 мес.

На игрушках дифтерийная палочка сохраняется до 2 нед, в пыли — до 5 нед, в воде и молоке — до 6-20 сут, на рассеянном свету остаётся жизнеспособным до 8 ч. Дезинфектанты и антисептики инактивирутют возбудителя дифтерии в течение 5-10 мин.

Пик заболеваемости дифтерией приходится на осенне-зимние месяцы.

Медицинская микробиология:

Среды, тесты для выделения, культивирования и идентификации коринебактерий дифтерии

Для первичного посева материала с целью выделения дифтерийных бактерий используют агаровые среды, содержащие гемолизированную кровь (барана, лошади, кролика, морской свинки, донора) и 0,03-0,04% теллурита калия, подавляющего рост сопутствующей флоры.

Коринебактерии дифтерии восстанавливают металлический теллур из его солей, что способствует окрашиванию их колоний в черный цвет. Наиболее распространенные среды: кровяной теллуритовый агар и один из его вариантов — среда Клауберга-2.

а) Теллуритовая среда для транспортировки и обогащения проб на С. diphtheriae. Среда, применяемая при невозможности доставки материала в течение 3 ч.

Состав:
Полужидкий (0,1%) агар на питательном бульоне, соответствующем требованиям С. diphtheriae
Нормальная сыворотка лошади или крупного рогатого скота — 10%
Теллурит калия K₂TeO₃ — 0,02%

Полужидкий агар разливают в пробирки по 4,5 мл, стерилизуют при 112°С 15 мин и хранят в холодильнике (не более 2 нед.).

Цвет готовой среды бледно-желтый, среда опалесцирует.

Тампоны с материалом из зева и носа сразу после взятия погружают в транспортную среду; по доставке в лабораторию пробирки помещают в термостат для обогащения (подращивания). На другой день тампоном, слегка отжатым о стенки пробирки, делают посевы на один из вариантов кровяного теллуритового агара.

б) Кровяной геллуритовый агар.

Состав:
Агар питательный — 100,0 мл
Кровь дефибринированная гемолизированная — 10,0 мл
Теллурит калия K₂TeO₃ — 0,03-0,04 г

К расплавленному и охлажденному до 45°С питательному агару добавляют 10% дефибринированной гемолизированной крови. Гемолиз достигается путем дву- или трехкратного попеременного замораживания и оттаивания. Можно достичь гемолиза эритроцитов при помощи дистиллированной воды. Для этого дефибринированную кровь отстаивают, удаляют надосадочную жидкость (плазму); к эритроцитарной массе добавляют дистиллированную воду в объеме, равном объему осадка.

Донорская кровь непосредственно из ампулы непригодна, так как содержит различные консервирующие добавки. При необходимости могут быть использованы эритроциты из ампулы для переливания крови после трехкратного отмывания изотоническим (0,85%) раствором натрия хлорида и подвергнутые гемолизу при помощи дистиллированной воды или замораживания/оттаивания.

К смеси агара и крови добавляют теллурит калия в конечной концентрации 0,03-0,04%, используя заранее заготовленный рабочий раствор (2%) теллурита калия. Его готовят путем растворения навески в дистиллированной воде на кипящей водяной бане 30 мин. 2%-ный раствор сохраняют в холодильнике не более 1 мес. Перед употреблением в случае образования в растворе осадка его снова прогревают на водяной бане до исчезновения хлопьев. К кровяному агару добавляют 1,5-2% (по объему) 2%-ного рабочего раствора теллурита.

После тщательного перемешивания среду разливают в чашки Петри и используют для первичного посева материала из зева и носа, а также для высева из транспортной среды. Цвет готовой среды вишнево-красный. Чашки с готовым кровяным теллуритовым агаром можно хранить в холодильнике не более 7 сут.

Основные ингредиенты среды Клауберга-2 (из расчета на 100,0 мл питательной агаровой основы):

Глицериновая смесь. К 40,0 мл дефибринированной крови добавляют 20,0 мл химически чистого глицерина, стерилизованного при 110°С 30 мин

Лаковая кровь. К 34,0 мл стерильной дистиллированной воды добавляют 16,0 мл дефибринированной крови

К 100,0 мл питательной агаровой основы, расплавленной и остуженной до 45°С, добавляют 2,0 мл прокипяченного 2%-ного раствора теллурита калия, 10,0 мл глицериновой смеси и 50,0 мл лаковой крови, тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри.

г) Цистин-теллурит-сывороточный агар (среда Тинсдейла, модифицированная).

Состав:
1-%-ный раствор цистина на 0,1N растворе серной кислоты H₂SO₄ — 12,0 мл
0,1 N раствор натрия гидроксида NaOH — 12,0 мл
2%-ный раствор теллурита калия K₂TeO₃ — 1,8 мл
2,5%-ный раствор натрия тиосульфата Na₂S₂O₃ • 5Н₂О — 1,8 мл
Питательный агар для дифтерийных бактерий, pH -7,6 — 100,0 мл
Нормальная лошадиная сыворотка — 20,0 мл

К расплавленному и остуженному до 45°С питательному агару, pH-7,6-7,8, асепетически добавляют ингредиенты в следующей последовательности: раствор цистина, щелочь, раствор теллурита, раствор тиосульфата, нормальная сыворотка. После внесения каждого ингредиента среду тщательно перемешивают. Незастывшую среду разливают в чашки Петри. Среда должна быть полупрозрачна, кремовожелтого цвета.

С. diphtheriae через 24-48 часов инкубации вырастает в виде мелких (1 мм) черных блестящих колоний, окруженных черно-коричневым ореолом (за счет образования сероводорода). Среда применяется для посева материала только от лиц с подозрением на заболевание дифтерией. Для выявления бактерионосителей среда непригодна по причине ее низких ростовых качеств.

Среду используют для посева материала от больного с подозрением на заболевание дифтерией. Для этого ватный тампон, содержащий исследуемый материал (пленки, слизь из зева, носа, с поверхгости некротических участков и т.д.) вначале окунают концом в конденсационную воду, затем втирают в поверхность свернутой сыворотки. Через 6 часов инкубации дифтерийные бактерии вырастают в виде мелких точечных выпуклых колоний практически в чистой культуре, а сопутствующая флора еще не заметна. Из колоний готовят препараты-мазки, окрашенные синью Лёффлера. Среда может использоваться и для выращивания чистых культур С. diphtheriae.

е) Сывороточный агар (среда для культивирования чистых культур С. diphtheriae). К расплавленному и охлажденному до 45°С питательному агару добавляют 10% нормальной сыворотки лошади или крупного рогатого скота (стерильной или с консервантом — хлороформом). Среду разливают в пробирки по 2,5-3,0 мл и дают застыть в скошенном состоянии. Цвет готовой среды бледно-желтый (сходен с цветом исходной агаровой основы). Пробирки со скошенным сывороточным агаром могут храниться в холодильнике не более 6 дней.

ж) Реактивы и постановка теста на уреазу но методу Заксе. Готовят два раствора: раствор мочевины в спирте (реактив А) и водный забуференный раствор индикатора фенолового красного (реактив И).

Реактив А. Мочевина — 2,0 г
Этиловый спирт 96° — 2,0 мл
Вода дистиллированная — 4,0 мл
Реактив не стерилизуют, хранят в холодильнике.

Реактив В. 0,2%-ный раствор фенолового красного — 1,0 мл
Калия фосфат однозамещенный (KH₂PO₄) — 0,1 г
Калия фосфат двузамещенный (K₂HPO₄ • H₂O) — 0,1 г
Натрия хлорид — 0,5 г
Вода дистиллированная — 99,0 мл

Реактив стерилизуют однократно текучим паром 15 мин, хранят в холодильнике.

В стерильную пробирку вносят ex tempore 19 частей раствора В и 1 часть раствора А, смесь разливают в узкие пробирки по 0,1 мл, по числу испытуемых культур. В каждую пробирку вносят по нескольку петель испытуемой культуры (до помутнения жидкости). Пробирки помещают в термостат на 30 мин. При положительной реакции (наличии уреазы) смесь в пробирке приобретает красный цвет.

з) Среда Пизу (для определения цистиназы у коринебактерий). При невозможности использовать сухую коммерческую среду Пизу ее можно приготовить в лаборатории самостоятельно. В качестве основы берут 1,5%-ный питательный агар, приготовленный для С. diphtheriae на бульоне Мартена, среде ЛГВ, гидролизате казеина, рыбной муке или сухой агар для определения токсигенности. Реакция агаровой основы pH 7,6.

Состав:
1,5%-ный агар на бульоне Мартена или другой питательной основе, пригодной для дифтерийных бактерий, pH 7,6;
1%-ный раствор L-цистина в 0,1 N растворе H₂SO₄ или НС1;
0,1 N раствор NaOH;
10%-ный раствор ацетата свинца, свежеприготовленный и стерилизованный дважды текучим паром;
нормальная лошадиная или бычья сыворотка.

К 90,0 мл расплавленной (при 90°С) или свежесваренной питательной агаровой основы добавляют 2,0 мл 1%-ного раствора L-цистина в кислоте. Смесь перемешивают и добавляют к ней 2,0 мл 0,1 N раствора NaOH. После определения и подправления pH до 7,6 среду стерилизуют при 112°С в течение 30 мин и хранят в холодильнике. При необходимости агаровую среду расплавляют, охлаждают до 45-50°С и стерильно добавляют к ней 1,0 мл 10%-ного раствора ацетата свинца; смесь тщательно перемешивают, добавляют к ней 9,0 мл нормальной сыворотки и разливают в стерильные агглютинационные пробирки по 2,0-3,0 мл. Хранят в холодильнике.

В качестве 0,1 N растворов кислоты и щелочи можно использовать соответствующие фиксаналы.

Среда непрозрачна, имеет желтоватый цвет (цвет питательного агара).

Посев испытуемой культуры производят уколом. Через 20-22 ч по уколу и вокруг него на расстоянии 1,0 см от поверхности образуется темно-коричневое облачко ацетата свинца, окутывающее зону роста и свидетельствующее о расщеплении цистина. При отсутствии цистиназы потемнения среды не наблюдается.

и) Среда для определения токсигенности С. diphtheriae. В качестве основы используют пептон Мартена — продукт самопереваривания свиных желудков, смешанный с равным объемом мясной воды двойной концентрации (1 кг мясного фарша и 1000,0 мл воды), уплотненный агаром 1,5%. Для приготовления этой среды используют агары светлых сортов, обеспечивающих прозрачность. Среду категорически запрещается готовить в железной посуде (или в эмалированной посуде с выщербленной эмалью).

Навеску агара промывают в проточной воде в течение рабочего дня.

После 30-минутного подсушивания чашки засевают вдоль полоски с антитоксином испытуемыми колониями, снятыми непосредственно с кровяного теллуритового агара; каждую колонию засевают в виде отдельной бляшки.

Приготовление бумажек с крезоловым красным 0,1 г крезолового красного растворяют в 100,0 мл 95%-ного спирта и оставляют при температуре 37°С на 24 ч, часто встряхивая. На следующий день смачивают в этом растворе полоски фильтровальной бумаги и быстро высушивают. Ярко-желтый цвет бумажек в щелочной среде переходит в разные оттенки красного.

к) Приготовление раствора антитоксической сыворотки. Берут ампулу лечебной антитоксической противодифтерийной сыворотки (10 000 МЕ/мл), содержимое переносят в стерильную пробирку, куда добавляют стерильный изотонический (0,5%) раствор натрия хлорида до общего объема 10,0 мл. Полученный рабочий раствор, содержащий 1000 ME в 1,0 мл, хранят в холодильнике (не более 1 мес.). Перед постановкой теста на токсигенность из рабочего раствора стерильно отбирают объем, необходимый для приготовления нужного числа чашек. Отобранный объем разводят в 2 раза до конечной концентрации 500 МЕ/мл. Так, для приготовления двух чашек берут 0,25 мл исходного рабочего раствора, содержащего 1000 МЕ/мл, а для 5 чашек — 0,625 мл и т.д„ после чего рабочий раствор разводят вдвое (т.е. до 500 МЕ/мл).

Лежащие в пустой стерильной чашке стерильные полоски фильтровальной бумаги пропитывают полученным раствором антитоксина (500 МЕ/мл) — по 0,25 мл на каждую полоску (т.е. по 125 ME). Обожженным пинцетом полоски накладывают на агаровую среду по диаметру чашки Петри.

Читайте также: