Генная инженерия против вич

Обновлено: 19.04.2024

Клинические испытания новых подходов к генной терапии могут проложить путь к функциональному излечению или долговременной ремиссии ВИЧ. American Gene Technologies тестирует генетически модифицированные ВИЧ-специфические CD4 Т-клетки, устойчивые к проникновению вирусов, а Excision BioTherapeutics разрабатывает метод удаления ДНК ВИЧ из хромосом инфицированных клеток. Обзор исследований опубликован в журнале POZ.

Американские генные технологии: AGT103-T

Экспериментальная терапия, получившая название AGT103-T, включает генетически модифицированные CD4 Т-клетки, способные противостоять ВИЧ. Сначала у пациента берут образец клеток периферической крови и отбирают клетки CD4, распознающие белок Gag ВИЧ. Затем в клетку вставляется ген, отключающий рецепторы CCR5, которые ВИЧ использует для проникновения в клетки. В конечном итоге модифицированные CD4 возвращаются в организм.

Согласно данным, первое клиническое испытание AGT103-T проходит успешно. После оценки промежуточных результатов первых 3 участников независимый совет по безопасности не обнаружил серьезных побочных эффектов. Ожидается, что в этом месяце лечение получат еще 2 пациента.

Настоящая проверка функционального излечения — это прекращение приема антиретровирусных препаратов, чтобы увидеть, восстановится ли вирусная нагрузка. Первые участники начнут тщательно контролируемое прерывание лечения в начале 2022 года, сообщают исследователи.

Эксцизионная биотерапия: EBT-101

Excision BioTherapeutics применяет другой подход, используя генную терапию для деактивации генетических кодов ВИЧ в зараженных клетках, тем самым останавливая производство нового вируса.

EBT-101 вводится в виде однократной внутривенной инфузии. Через три месяца после введения участники исследования начнут контролируемый перерыв в лечении антиретровирусными препаратами, чтобы увидеть, как генная терапия влияет на развитие вируса.

В сентябре Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов дало компании добро на начало первой фазы испытаний EBT-101.

Японские ученые применили метод геномного редактирования для инактивации вируса иммунодефицита человека

Разрушив регуляторные гены вируса, вызывающего СПИД, посредством системы геномного редактирования CRISPR/Cas9, группа исследователей из Университета Кобе (Kobe University) заблокировала воспроизведение частиц ВИЧ инфицированными клетками. Об этом сообщает статья в Scientific Reports (Ophinni et al., CRISPR/Cas9 system targeting regulatory genes of HIV-1 inhibits viral replication in infected T-cell cultures).

Поражение вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ-1) – это хроническое заболевание, которое в мире диагностировано у 35 с лишним миллионов человек. Уровень инфекции можно контролировать антиретровирусными препаратами, но полного излечения не бывает.

Одна из основных проблем заключается в невозможности удалить клетки с латентной, еще не проявившейся ВИЧ-инфекцией: по мере размножения вируса его гены внедряются в хромосомы зараженных клеток и воспроизводятся вместе с генетическим материалом клетки, до поры ничем себя не выдавая.

Применяющаяся с недавних пор система геномного редактирования CRISPR/Cas9 представляется японским ученым перспективным инструментом для инактивации генов ВИЧ, встраивающихся в хромосомы пораженных этим вирусом людей: она разрезает гены в определенных местах, что позволяет удалять или добавлять участки ДНК.

Исследователи из Кобе нацелились на два гена, которые регулируют размножение ВИЧ, эти гены называются tat и rev. Исходя из генетической информации о шести основных подтипах вируса иммунодефицита человека, они сконструировали шесть типов направляющей РНК, которая обеспечивает специфичность редактирования системой CRISPR/Cas9.

Дальше ученые создали вектор – специальную конструкцию на основе особого вируса с длинным инкубационным периодом, лентивируса, несущего гены разрезающего фермента Cas9 и направляющую РНК. При внесении такого вектора с редактирующей системой в культуру клеток, которые производили продукты генов tat и rev, авторы добились существенного снижения активности генов-мишеней, и, соответственно, уровня их продуктов.

Никаких побочных, нежелательных мутаций при этом не наблюдалось, равно как и изменения в выживаемости культивируемых клеток. Вводя редактирующую систему в культуру клеток с латентной или постоянной ВИЧ-инфекцией, авторы заметно подавили реактивацию ВИЧ, зависимую от белков иммунной системы цитокинов, а также воспроизведение вирусного материала в хронически инфицированных клетках. Более того, одновременное внесение всех шести типов РНК-проводника почти полностью заблокировало продукцию вируса инфицированными клетками.

Читать статьи по темам:

Читать также:

Инвестиции в редактирование генома

Технология генотерапии пациентов с лимфомами и ВИЧ находится на ранней стадии доклинических исследований и уже на этом этапе смогла привлечь внимание инвестора.

Редактированию генома помогли материально

Реализация проекта позволит довести до клинической практики технологию лечения пациентов с лимфомами и ВИЧ, которым показана трансплантация костного мозга.

Возможно, учёным удалось совершить большой шаг на пути поисков средства, способного вылечить ВИЧ полностью, а не просто взять под контроль размножение вируса.

Т-лимфоциты научатся защищаться от ВИЧ

Ученые использовали систему редактирования генов CRISPR/Cas9,чтобы найти мутации, которые делают иммунные клетки человека устойчивыми к ВИЧ-инфекции.

CRISPR/Cas9 как помощник в борьбе с ВИЧ

Избавиться от вируса иммунодефицита возможно благодаря революционной системе CRISPR/Cas9, которая позволит вырезать гены ВИЧ из ДНК клеток пациента.

Новость

Система CRSIPR/Cas9 удалит вирусную информацию в геноме человека, зараженного ВИЧ

Автор

Редакторы

Генеральным спонсором конкурса, согласно нашему краудфандингу, стал предприниматель Константин Синюшин, за что ему огромный человеческий респект!

CRISPR/Cas9

Рисунок 1. Система CRISPR/Cas9 как один из вариантов бактериального иммунитета. а — Внедрение чужеродной ДНК в клетку бактерии. б — Приобретение спейсера. в — Транскрипция CRISPR-локуса. г — Образование guideРНК. д — Образование активного комплекса Cas9 + guideРНК. е — Связывание чужеродной ДНК. ж — Внесение двухцепочечного разрыва в ДНК. Сокращения см. в тексте.

Но затем в 2012 году бактериальную защитную систему взяли на вооружение ученые, ведь если соединить Cas9 с определенной РНК, то можно разрезать необходимый ген. Разрезанный ген запускает в клетке систему репарации, которая в буквальном смысле пытается соединить концы с концами. При этом происходят различные мутации репарируемого гена — в основном удаления, но бывают и разные вставки. Однако если мы предоставим матрицу для репарации, ген может вернуться к правильной форме. Так можно вносить любые изменения в геном. Это означает, что мы в теории можем лечить генетические заболевания, рак и не только. Сегодня мы поговорим о том, как CRISPR/Cas9 поможет решить проблему избавления от вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).

ВИЧ — возбудитель синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИДа) — относится к роду лентивирусов семейства ретровирусов, чей геном представлен двумя копиями одноцепочечной РНК, на двух концах которой находятся длинные концевые повторы (или по-английски long terminal repeat, LTR) [7]. В самой вирусной частице содержатся еще три фермента: протеаза, обратная транскриптаза и интеграза (рис. 2). Протеаза расщепляет продукты считывания вирусных генов с образованием зрелых белков.

Рисунок 2. Строение вириона ВИЧ. Частица покрыта липидным бислоем, происходящим из клеточной мембраны организма-хозяина, и усеяна молекулами вирусных гликопротеинов.

Жизненный цикл ВИЧ довольно прост (рис. 3). Вначале вирус инфицирует клетку, причем в качестве рецептора служит молекула CD4, а корецепторами становятся рецепторы хемокинов, поэтому поражаются клетки иммунной системы: T-лимфоциты (T-хелперы), моноциты, макрофаги, а также клетки мозга (макрофаги, микроглия, астроциты), клетки лимфоидной ткани желудочно-кишечного тракта и другие. Затем одноцепочечный РНК-геном с помощью обратной транскриптазы превращается в двухцепочечную ДНК, так называемую провирусную ДНК. Наконец интеграза встраивает двухцепочечную провирусную ДНК в геном хозяина. Эта встроенная информация считывается, причем промоторами (то есть местами, привлекающими РНК-полимеразу для транскрипции) служат длинные концевые повторы — LTR. Собираются новые вирусные частицы, поражающие новые клетки. В целом весь этот процесс приводит к частым мутациям вируса, особенно вариабельны поверхностные гликопротеины, в том числе поэтому частицы ВИЧ так неуловимы для нашего иммунитета [8], [9].

Рисунок 3. Жизненный цикл ВИЧ. 1 — зрелая вирусная частица; 2 — связывание с клеткой благодаря рецепторам; 3 — слияние мембран вируса и клетки; 4 — высвобождение вирусной РНК; 5 — превращение РНК в ДНК (обратная транскрипция); 6 — интеграция в геном клетки; 7 — считывание вирусной информации; 8 — сборка и выход вирусной частицы; 9 — новая вирусная частица.

Терапия ВИЧ

Рисунок 4. Удаление провируса из генома человека приведет к невозможности размножения и распространения вируса.

Современная высокоактивная антиретровирусная терапия основывается на ингибировании обратной транскриптазы, протеазы, интегразы, слияния вируса с клеткой, что значительно осложняет жизнь вируса. Но все же ВИЧ-инфекция в настоящий момент остается неизлечимым заболеванием, так как такая терапия никак не влияет на ДНК вируса у нас в геноме: у пациентов, принимающих антиретровирусную терапию, около 10 6 клеток содержат провирус. Сверх того, у пациентов могут быть серьезные побочные эффекты или устойчивость к антиретровирусной терапии [10].

Рисунок 5. Система CRISPR/Cas9, интегрированная в клетки, может препятствовать их заражению вирусом и интеграции вируса в геном.

Предложенная система протестирована японскими учеными в 2013 году на культуре клеток человеческих T-лимфоцитов [8]. В качестве мишени они предложили использовать LTR, а в них — разные участки, необходимые для связывания факторов инициации и элонгации транскрипции. Трехкратное внесение в клетки конструкции CRISPR/Cas9 снижало считывание вирусного генома почти в 3 раза (с 97,8% до 35,5%). Дальнейший анализ показал, что почти все клетки содержали в области провируса различные мутации.

Так как LTR — это концевые повторы, то разрезание с двух концов теоретически может привести к полному вырезанию встроенного в геном вирусного куска. И действительно — почти у трети клеток (31,8%) после трехкратного внесения системы CRISPR/Cas9 этот участок полностью удалялся.

А что насчет мутаций вируса? Ведь если целевой участок изменит свою структуру, система CRISPR/Cas9 не сможет его найти и обезвредить. Понимая это, ученые выбрали именно тот участок LTR, что содержит высококонсервативные последовательности ДНК, практически одинаковые у всех подвидов ВИЧ.

Не все так просто

Рисунок 6. Повышение специфичности разрезания гена с использованием никаз, вносящих одноцепочечные разрывы.

Предложенная система изменения генов не так чудесна, как может показаться на первый взгляд, как бы я ни старалась вас в этом убедить. Есть много подводных камней, которые требуют дальнейшего исследования.

Таким образом, стремительно развивающаяся генная терапия с использованием CRISPR/Cas9 — ключ к избавлению от ВИЧ-инфекции и ассоциированных с ней заболеваний и осложнений. Однако не стоит ожидать, что такое лекарство сегодня-завтра появится на прилавках в аптеке, ведь еще о многом стоит подумать, чтобы разработать действительно эффективное и безопасное лечение.

Новость

Комплекс-белок Cas9/sgRNA/viral RNA (слева) и модель вируса иммунодефицита человека (справа), построенная коллективом Visual science.

Автор

Редактор

Спонсор публикации этой статьи — Виктор Татарский.

Врага нужно знать в лицо

Об иммунитете, апоптозе и вообще.

Иммунная система развивалась сотни миллионов лет. По типу реакции ее обычно делят на врожденный (неспецифичный) и приобретенный (специфичный) иммунитет [1], [2]. Считается, что специфичный (то есть вырабатываемый к конкретному патогену) иммунитет впервые появился у челюстноротых (рыб и всех вышестоящих по эволюционному древу таксонов) после отделения от бесчелюстных (миног и миксин), хотя у вторых имеется аналогичная система защиты [3]. К клеткам специфичного иммунитета относят В-лимфоциты, Т-лимфоциты и NK-клетки (естественные киллеры, natural killer cells). Помимо этого существуют моноциты, которые хоть и не являются истинными инструментами приобретенного иммунитета, однако выполняют некоторые функции по нейтрализации патогена: фагоцитоз, презентация антигена, выделение бактерицидных веществ и цитокинов.

Рисунок 1. Взаимодействия Т-киллеров (слева) и Т-хелперов (справа) с зараженными клетками. Для передачи сигнала о заражении необходимо выполнение двух условий: контакт комплекса МНС-патоген с TcR (T-cell Receptor, рецептор Т-клеток) и CD. Двигаясь по организму, Т-лимфоциты проверяют каждую клетку на предмет наличия у нее антигена в комплексе с МНС. Их можно сравнить с подслеповатой глуховатой бабушкой, пришедшей забирать дитятко из детского сада. Для опознания ей надо подойти вплотную и по нескольким (в данном случае по двум) признакам определить, ее ли это чадо или нет.

Т-лимфоциты, в свою очередь, необходимы для уничтожения клеток, зараженных внутриклеточными паразитами, и опухолевых клеток. Они делятся на два основных типа в зависимости от класса рецепторов, находящихся на внешней стороне их мембраны.

Т-киллеры несут CD8 рецепторы и отвечают за:

Т-хелперы имеют CD4 рецепторы и ответственны за секрецию цитокинов, которые:

активируют макрофаги для борьбы с внутриклеточными паразитами;
способствуют продукции антител В-лимфоцитами.

Но не менее важна роль Т-хелперов в подготовке зрелых Т-киллеров из клеток-предшественниц, активации NK-клеток и моноцитов.

Как же происходит опознавание антигена на молекулярном уровне? Здесь надо упомянуть еще об одном очень важном классе рецепторов — МНС (Major Histocompability Complex или главном комплексе гистосовместимости). Они бывают двух классов: I и II. МНС I присутствует на поверхности всех ядерных клеток организма человека. Он необходим для опознавания клетки натуральным киллером и Т-киллером (рис. 1, 2). Если по какой-то причине МНС I изменен, несет на себе антиген или отсутствует, клетка будет подвергнута апоптозу. МНС II находится на поверхности В-лимфоцитов, макрофагов и дендритных клеток. Он необходим для презентации антигена Т-хелперам (рис. 1, 2). Жизнь пула Т-хелперов можно представить как прогулку с ребенком в зоопарке, только вместо животных — антигены, вместо ребенка — Т-хелпер, а вместо взрослых, объясняющих, кто есть кто, — три перечисленных типа клеток.

Рисунок 2. Процесс передачи сигнала Т-киллеру и Т-хелперу. Первый этап — сборка комплекса МНС-антиген, второй этап — презентация комплекса на поверхности клетки.

Первый этап проникновения вируса в клетку — взаимодействие вирусного белка gp120 (рис. 3) с рецептором CD4. Отсюда понятно, почему ВИЧ размножается именно в Т-хелперах. Взаимодействию способствуют корецепторы CCR5 и CXCR4 [8]. В норме они являются рецепторами цитокинов, а при взаимодействии ВИЧ с клеткой их связь является необходимым условием проникновения вируса внутрь. Мутации в генах этих рецепторов обеспечивают частичную устойчивость носителей таких мутаций (таких людей около 2%, причем некоторые штаммы вируса все равно могут их поражать) [9]. Затем в мембрану клетки погружается белок gp41, после чего мембрана вируса сливается с клеточной, и происходит распаковка генетического материала. По принципу обратной транскрипции с РНК-матрицы вируса с помощью фермента ревертазы (обратной транскриптазы) синтезируются молекулы кДНК (комплементарной ДНК). Синтезированная кДНК вставляется вирусной интегразой в геном клетки хозяина. После попадания в геном хозяина вирус может никак себя не проявлять до нескольких лет — протекает так называемый инкубационный период. Только когда клетки активно пролиферируют, а значит, синтезируют белки на матрице ДНК, начинается сборка вирусных частиц , выход их из клеток и гибель последних (так как каждая частица забирает с собой часть клеточной мембраны клетки, вирусы попросту разрывают клетку).

Рисунок 3. Строение ВИЧ. Белки gp120 и gp41 участвуют в рецепции вируса клеткой и проникновении вирусной частицы внутрь. Липидная оболочка захватывается от клетки хозяина вместе с частью мембранных белков. Белки матрикса синтезируются в клетке после встраивания кДНК в геном в момент наработки клеточных белков для деления. Протеаза, возможно, необходима для разрезания противоапоптотического фактора Bcl-2 [9]. Ферменты обратная транскриптаза и интеграза создают кДНК на матрице РНК и встраивают кДНК в геном Т-хелпера соответственно. Tat — белок, вовлеченный в индукцию апоптоза. Нуклеокапсид — комплекс из РНК и белков вируса, представляющий собой компактную упакованную форму генома. Капсид — белковая оболочка, защищающая содержимое от воздействия внешних условий.

Как иммунитет бактерий правит геномы

Система редактирования геномов CRISPR/Cas известна уже довольно давно (впервые локус описал в 1987 году Есизуми Исино из университета Осаки), но только недавно (в 2005 году) ученые поняли ее истинное предназначение [11], [12].

Как вы уже поняли, система состоит из двух компонентов: CRISPR-локуса (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats или сгруппированные и регулярно разделенные короткие палиндромные повторы) и белков Cas, которые, являются нуклеотид-специфичными эндонуклеазами (а название получили за работу в команде с CRISPR — Crispr associated).

Помимо CRISPR-локуса и блока генов Cas в ДНК бактерии (не обязательно в нуклеоиде [12]) находится ген tracrРНК (transactivated crispr RNA), частично комплементарной палиндромам.

Для формирования специфичной устойчивости к вирусу бактерия, как и человек, должна встретиться с ним дважды.

Первый раз после внедрения вирусной ДНК в клетку происходит разрезание ДНК белками Cas1 и Cas2 на протоспейсеры и встраивание их в начало CRISPR-локуса. Cas1 и Cas2 формируют при этом комплекс, причем Cas2 играет только структурную роль, удерживая ДНК, тогда как Cas1 встраивает ее. Каждый протоспейсер вставляется в CRISPR-локус так, чтобы от другого (уже имеющегося) спейсера его отделял палиндром.

Соответственно, после транскрипции ДНК всего комплекса образуются три продукта (рис. 4):

tracrРНК;
РНК белка Cas (наиболее изученным является Cas9, поэтому далее повествование пойдет о нем), далее транслирующаяся;
pre-crРНК (poly-spacer precursor crRNA или многоспейсерный предшественник crРНК), которая представляет собой транскрипт спейсеров, разделенных образовавшимися из палиндромов шпильками или петлями.

Рисунок 4. Строение CRISPR-локуса и результат транскрипции. leader — лидерная последовательность, отвечающая за начало транскрипции, со стороны которой вставляется новый спейсер. repeat — палиндромный повтор, который после транскрипции превращается в шпильку или петлю.

Второй этап — образование комплекса pre-crРНК/Cas9/РНКаза III. Очевидно, что вся длинная pre-crРНК не может участвовать в опознавании инвазивной ДНК, так как, во-первых, очень длинна, что конформационно неудобно, а во-вторых, при сравнении спейсеров РНК с протоспейсерами инвазивной ДНК длинный транскрипт начнет путаться и в итоге образует клубок, непригодный для дальнейшей работы. Самое логичное — разделить длинную последовательность на короткие участки, которые могли бы проверятся на соответствие инвазивной ДНК белком Cas9. И тащить за собой не надо, и не запутается.

С помощью фермента РНКазы III и при участии tracrРНК pre-crРНК разделяется по границам повторов так, что в белково-нуклеиновый комплекс входят один спейсер и один повтор, комплементарно связанный с tracrРНК (рис. 5) [13]. Повтор полностью теряет свою вторичную структуру, tracrРНК же оставляет несколько шпилек (обычно три).

Рисунок 5. Белково-нуклеиновый комплекс после созревания транскрипта. crРНК состоит из спейсера (слева) и повтора, соединенного с частью tracrРНК (справа). Три петли на tracrРНК нужны для удержания ее эндонуклеазой Cas9.

комплементарность спейсера комплекса Cas9/crРНК/tracrРНК протоспейсеру инвазивной (например, вирусной) ДНК;
наличие в геноме вируса около протоспейсера последовательности из трех нуклеотидов — РАМ (Protospacer Adjacent Motif, прилежащий к протоспейсеру мотив).

Таким образом клетка страхуется от уничтожения своей ДНК. Но даже просто разрезанная в одном месте вирусная ДНК может представлять опасность, поэтому завершает инактивацию негомологическое сращивание концов (non-homologous end joining, NHEJ). При этом происходит инсерция/делеция одного или нескольких нуклеотидов, что приводит к потере инфекционности.

Рисунок 6. Полная схема механизма работы CRISPR/Cas9 системы. а — Транскрипция CRISPR локуса с образованием pre-crРНК. б, в — Разрезание РНК РНКазой III и образование комплексов Cas9/tracrРНК/crРНК. г — Вторичное проникновение в клетку чужеродной ДНК. д — Соединение комплекса с инвазивной ДНК. е — Образование двухнитевого разрыва в протоспейсере.

А где же тут редактирование геномов? А вот где:

во-первых, таким образом можно просто нокаутировать целевой ген и добиться прекращения экспрессии того или иного белка;
во-вторых, после создания двухцепочечного разрыва в образовавшуюся брешь можно вставить нужный нам ген и заставить организм синтезировать нужный нам белок.

Рисунок 7. Сравнение искусственной (а) и естественной (б) систем CRISPR/Cas9. Отличие состоит лишь в том, что искусственная РНК едина, а природная — состоит из двух частей, гены которых разделены.

Битва века

Однако вернемся к теме этой статьи.

Так как система редактирования геномов может помочь в избавлении от ВИЧ? Очень просто: вирус можно вырезать! Нацелив Cas9, путем создания sgРНК с последовательностью, комплементарной вирусной кДНК.

Некоторое время назад группа ученых из немецкого Института экспериментальной вирусологии и иммунологии уже пыталась использовать инструмент редактирования геномов для удаления ВИЧ из культуры HeLa [15]. Они модифицировали Cre-рекомбиназу методом направленной эволюции и один из полученных вариантов использовали для удаления вируса путем контролируемой рекомбинации [16]. Однако надо учитывать, что между Т-хелперами и опухолевой HeLa есть немало различий, к тому же, авторы не предлагают вариантов доставки или экспрессии гена Tre-рекомбиназы (усовершенствованный вариант фермента Cre).

С другой стороны, группа американских исследователей опубликовала в марте этого года статью [17], где подробно описывались метод доставки и механизм удаления вируса. Ученые ставили перед собой задачу не только полностью избавить клеточную культуру Т-хелперов от вируса, но и проверить отсутствие цитотоксического действия самой CRISPR/Cas9 системы. Единственный недостаток этого геномного инструмента в том, что из-за сравнительно небольшой длины спейсера, даже при наличии страхующего элемента PAM, в больших геномах могут быть найдены нецелевые сайты, подверженные разрезанию (off-target sites). Именно поэтому исследователи уделяли данной проблеме немало внимания.

Работа проводилась с использованием штамма ВИЧ-1 и клеточной линии Т-хелперов 2D10, зараженной вирусом в покоящейся стадии. Доставка и экспрессия sgРНК/Cas9 осуществлялась с помощью лентивирусного вектора.

Для оценки того, вырезался ли вирус из двух мест встраивания (1-я и 16-я хромосомы), было проведено полногеномное секвенирование. Оно показало, что в клетках, где экспрессировались и гены Cas9, и sgРНК, провирусная ДНК отсутствует.

Был проведен анализ того, могут ли гены, куда встроился провирус (RSBN1 и MSRB1), и близлежащие гены нормально транскрибироваться после его вырезания. Ученые показали, что как RSBN1, так и MSRB1 нормально экспрессируются. Соседние гены также не претерпели изменений.

С помощью биоинформатических методов и анализа баз данных было показано, что sgРНК/Cas9 не проявляет активности по отношению к нецелевым сайтам.

Таким образом, можно с уверенностью сказать, что группа Камински впервые успешно удалила ВИЧ из культуры зараженных Т-хелперов. Данное достижение приблизило человечество к победе на ВИЧ. Да, это только культура клеток. Да, до внедрения данной техники в медицину пройдут годы, а может и десятки лет, но данная работа является уникальной в своем роде, ибо ученые не только бросили вызов одному из страшнейших заболеваний на планете, но и смогли победить его — пусть даже масштаб сражения пока невелик.

Перспективы применения данной технологии очевидны: введя пациенту вектор, содержащий гены Cas9 и sgРНК, мы добьемся их экспрессии и полного удаления вируса из клеток. Современная терапия, направленная против ретровирусов, являющаяся основным средством борьбы с ВИЧ, не удаляет вирус из клеток, так как провирус остается встроенным в ДНК хозяина. В свою очередь, данный подход не оставляет вирусу шансов укрыться.

Развитием генетических технологий Россия пока похвастать не может. Проектов, связанных с внедрением в лечебную практику приемов редактирования ДНК, в нашей стране считанные единицы. Один из них мы сегодня представляем. Вполне реально, что лет через пять будет завершена разработка уникальной технологии генной терапии, позволяющей полностью вылечить пациента, больного ВИЧ. И работают над ней петербургские ученые.

Новость эта весьма актуальна, ибо сегодня Россия уже находится на критической грани: число ВИЧ-инфицированных превышает один миллион человек, то есть заражен 1% взрослого населения. Показатели такие же, как и в США, где все началось гораздо раньше.

Вирус давно вышел за границы групп риска. 90% инфицированных в мире – обычные люди, чаще всего 30 – 40-летние, традиционной сексуальной ориентации, не наркоманы. Из-за того что инфекция протекает скрытно и вирус, попав в организм, не дает о себе знать порой и 10, и 15 лет – все эти годы человек может при половых контактах передавать его другим людям.

Но сам по себе вирус, хотя и остается хронической на всю жизнь инфекцией, не убивает человека. Убивают осложнения. Поэтому врачи говорят не о лечении ВИЧ, а о способах коррекции вызванного вирусом иммунодефицита.

Для этого есть лекарства, которые помогают иммунной системе устоять. Таблетки контролируют вирус, он перестает размножаться в организме. Терапия эта пожизненная, но она позволяет лишь сдерживать скорость развития заболевания: если прервать лечение, осложнения не заставят себя ждать. К тому же и сами препараты дают серьезные побочные эффекты.

Вот почему с того самого момента, как ВИЧ был впервые обнаружен, ученые поставили перед собой задачу найти метод полного излечения. Создавали все более совершенные лекарства, исследовали. Открытие произошло, как это обычно бывает, случайно.

Американский вирусолог Дэвид Балтимор обнаружил фермент, названный им обратной транскриптазой (ревертазой). Тем самым он опроверг одну из догм молекулярной биологии, которая гласила, что генетическая информация течет однонаправленно от ДНК к РНК и белкам. Открытие обратной транскриптазы показало, что генетическая информация может передаваться двунаправленно между ДНК и макромолекулой РНК, что позволяет вирусам встраивать свой генетический материал в клетки. Так открылась возможность генной инженерии – генной терапии. За это открытие Балтимор (совместно со своими коллегами Ренато Дульбекко и Хоуардом Темином) в 1975 году стал лауреатом Нобелевской премии по медицине.

Как же это происходит в случае ВИЧ?

Тогда и возникла идея: а нельзя ли врожденную невосприимчивость одних использовать в лечении других? Первый такой эксперимент около десяти лет назад провел доктор Геро Хюттер в клинике Шарите в Берлине. Кроме ВИЧ-инфекции у пациента был еще и лейкоз, что случается часто, и больному требовалась пересадка костного мозга. Врачи использовали этот шанс: выбрали донора, невосприимчивого к ВИЧ, от которого и пересадили больному клетки костного мозга. ВИЧ-инфекция у того исчезла. Этот эксперимент показал, что в принципе для излечения достаточно убрать с поверхности клеток крови рецептор CCR5, который вирус использует для проникновения.

Казалось бы, вот оно – решение проблемы. Но, увы, повторить берлинский опыт не удавалось много лет. Пересадка костного мозга – метод дорогой, сложный и крайне рискованный. Много осложнений возникает после трансплантации, ведь чужеродные клетки должны еще прижиться в организме больного. Да и в любом случае такого донора надо подбирать очень тщательно по множеству критериев.

ФОТО из личного архива М. О. Поповой

О том, как развивались события дальше, рассказывает М. О. ПОПОВА, врач-гематолог из Первого медицинского университета им. Павлова. Марина Олеговна – сотрудник НИИ детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р. М. Горбачевой, координатор нового проекта, его вдохновитель и активный двигатель:

– Действительно, сама по себе идея очень интересная. Дело за технологией, которая позволит все это осуществить.

– Я гематолог, давно занимаюсь трансплантацией костного мозга и знаю, как осуществить редактирование ДНК, чтобы получить принципиально новый метод лечения. Мы как раз сейчас заняты его разработкой. Конечно, можно было сидеть и ждать, когда какая-нибудь крупная фармацевтическая компания разработает такой метод, потом придет к нам, врачам, и скажет: вот, покупайте! Но зачем ждать?

Нам в НИИ Горбачевой представился шанс: наши коллеги из Гамбургского университета, с которыми мы давно сотрудничаем, запатентовали инструмент редактирования ДНК для внесения мутации в ген CCR5 любых клеток – так называемые генетические ножницы. Этот патент – своего рода краеугольный камень, позволяющий привлечь финансирование и создать метод, который мы задумали.

– Но для этого нужен серьезный инвестор. Пока желающих вкладывать средства в науку, как известно, не так много.

Между стартапом и университетом имеется долгосрочное партнерство, оформленное в виде договора о сотрудничестве, что является хорошим примером государственно-частного партнерства. Компания получает коммерческое развитие технологии, а университет – развитие научного направления, опыт, публикации, научный продукт. В будущем договор будет расширен на этапе проведения клинического исследования – университет станет местом, где впервые в нашей стране редактирование генома применено у человека.

– На какой стадии проекта вы сейчас находитесь?

– Нам удалось решить сложнейшую научную задачу: создан эффективный и безопасный протокол редактирования гена CCR5 в гемопоэтических стволовых клетках. Удалось достичь не только высокой точности этой процедуры, но и немалой эффективности в 70 – 90%, а в отдельных экспериментах бывало и 97%. Ряд решений, которые лежат в основе такого результата, – это наше ноу-хау. Кстати, если судить по опубликованным работам, то у зарубежных научных групп эффективность варьируется в пределах от 30 до 90%.

– Пока идут только лабораторные исследования или вы уже продвинулись к человеку?

Таким образом, проект уверенно вышел на стадию доклинических исследований. Их мы будем проводить совместно с Национальным медицинским исследовательским центром онкологии им. Н. Н. Петрова.

В НМИЦ уже много лет существуют отдел онкоиммунологии и лаборатория, где производятся клеточные противоопухолевые вакцины. Там активно занимаются трансплантацией костного мозга у взрослых и детей. Мы у себя в НИИ им. Р. М. Горбачевой довели исследования до высокой эффективности в лаборатории, а работу с донорами – для получения продукта в большом формате – проводим уже на базе НМИЦ на специальном оборудовании.

– Когда примерно планируете начать клинические исследования?

– Планируем, что следующие этапы доклинической разработки и проведение клинических исследований будем проводить совместно – Первый мед, НМИЦ им. Петрова в сотрудничестве с Университетом Гамбурга. По нашим прикидкам, клинические исследования начнутся в 2022 году. При подтверждении безопасности и эффективности нашего метода можно ожидать, что применять его на практике начнут где-то в 2025 году.

Сложно, конечно, в настоящее время все точно рассчитывать, учитывая пандемию коронавируса, которая вносит свои коррективы, а также проблемы, которые естественным образом возникают в таких высокотехнологичных и инновационных разработках. Но мы смотрим в будущее с оптимизмом.

Если технология успешно пройдет клинические испытания, ее применение избавит от пожизненной антиретровирусной терапии многих ВИЧ-пациентов. Более того, появится надежда на создание нового класса генетических лекарств для лечения других ранее неизлечимых заболеваний, для спасения десятков тысяч жизней.

СПРАВКА

Что такое генетические ножницы?

Любой живой организм состоит из клеток, в каждой из которых свернута в клубок ДНК – двойная спираль генетического кода. У человека спираль – это две цепочки информации длиной по три миллиарда звеньев, накопленных нашими предками за миллионы лет эволюции.

Эта технология произвела настоящую революцию в биологии и медицине. Она уже используется для разработки методов лечения онкологических и глазных заболеваний. А в будущем, как надеются ученые, она сможет полностью избавить человечество и от целого ряда наследственных.

Читайте также: