Генная инженерия в лечении вич

Обновлено: 19.04.2024

Почему в XXI веке стоит перестать бояться диагноза ВИЧ

Однако страхи и предрассудки, связанные с ВИЧ и его терминальной стадией – СПИДом, живы и сейчас. Причина – в нехватке знаний. Именно это приводит к тому, что люди, получившие положительный тест, воспринимают диагноз трагически, а общество стигматизирует ВИЧ-инфицированных. В материале ТАСС – об истории возникновения вируса, поиске лекарств и опасных мифах.

История одного вируса

О страшном вирусе, пришедшем от обезьян, активно заговорили в 80-е годы прошлого века. Предполагается, что он появился в Конго еще в 60-х, а потом перекинулся с африканского континента в Америку и пошел по свету. В начале 80-х, когда стало известно о первых заболевших, никто не понимал, что происходит с людьми и как их лечить.

Вирус стремительно распространялся по планете: уже к 1991 году его диагностировали у десяти миллионов, а к началу XXI века СПИД унес жизни 21,8 миллиона человек.

Ученые установили, что ВИЧ – ретровирус, который поражает клетки иммунной системы и делает организм уязвимым для внешних агентов, атакующих иммунитет. Иммунодефицит, развивающийся в результате заражения ВИЧ-инфекцией, приводит к повышенному риску возникновения у человека ряда заболеваний, которым здоровая иммунная система может противостоять. ВИЧ-инфицированные заболевают туберкулезом в сто раз чаще здоровых людей. Кроме того, у них чаще развиваются онкология и оппортунистические инфекции – заболевания, вызванные условно-патогенными вирусами, бактериями или простейшими. К таким, например, относятся герпес, кандидоз и вирус папилломы человека.

На протяжении многих лет информация о смертельной опасности заболевания вызывала панику и порождала мифы. В то же время очевидная опасность болезни заставила ученых всего мира сплотиться и начать поиски эффективной терапии.

Сегодня, когда с ВИЧ-инфекцией в мире живет более 38 миллионов человек, такая терапия существует и доступна во многих странах. Речь об антиретровирусной терапии (АРВТ). И, хотя препарат для полного излечения от вируса еще не изобрели, благодаря современным лекарствам заболевание перешло в разряд полностью контролируемых. ВИЧ-положительный человек, принимая назначенные врачом препараты, живет обычной жизнью.

Путь к одной таблетке

Путь к созданию эффективных лекарств был нелегким. Поначалу, как и в случае с пандемией COVID-19, ученые пытались использовать те лекарственные средства, которые уже существовали на рынке. Тогда надежды возлагали на противораковый препарат, но они не оправдались.

Эра антиретровирусной терапии началась с регистрации в 1987 году нового препарата. Он многие годы входил в клинические рекомендации по лечению пациентов, но со временем выяснилось, что вирус способен спонтанно мутировать в организме и быстро обретать к препарату устойчивость.

Поиски действенной терапии продолжились. В начале 1990-х пришло понимание, что одной таблетки для лечения этого заболевания недостаточно: ученые стали разрабатывать комбинации различных препаратов. Появились новые лекарства из группы нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы (НИОТ). Эти антиретровирусные препараты структурно схожи с органическими соединениями, входящими в состав рибонуклеиновой кислоты (РНК) и дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) – они могут конкурентно блокировать определенный фермент ВИЧ и замедлять синтез вирусной ДНК.

Дело в том, что все гены у этого вируса хранятся в РНК, а у людей – в ДНК. Поэтому для размножения вирус с помощью обратной транскриптазы должен переписать свои гены из одного формата в другой. Препараты из группы НИОТ мешают этому процессу: не дают вирусу переносить гены из РНК в ДНК.

Однако в 1993 году на международной конференции по СПИДу ученые огласили данные исследования, согласно которому, сочетание лекарств только этой группы не дает долгосрочного эффекта. Примерно в это же время начали использовать новую группу препаратов – ингибиторы протеазы, действующие на другой фермент вируса. А в 1996 году появился еще один класс антиретровирусных препаратов – ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (ННИОТ). Как и НИОТы, препараты этого класса блокируют фермент вируса, мешая построению РНК ВИЧ, то есть размножению вируса.

Ученые выяснили, что сочетание лекарств из нескольких групп препаратов прекращает размножение вируса в организме, поскольку препараты влияют на разные ферменты вируса, блокируя его воспроизведение на разных этапах.

Это открытие легло в основу новой трехкомпонентной терапии ВИЧ-инфекции, разработанной в 1996 году. Она и сейчас остается основой большинства известных схем АРВТ. В нее входит два препарата НИОТ и третий, отличающийся по своему действию.

С 1997 года ВИЧ стал контролируемой хронической инфекцией, а люди, которые получают лекарства, перестают умирать от СПИДа. Вирусная нагрузка у людей, принимающих антиретровирусную терапию, снижена до неопределяемого уровня, они могут создавать семьи с ВИЧ-отрицательными партнерами, рожать здоровых детей, что было невозможно представить себе еще в 80-е годы. И теперь в лечении таких пациентов появилась новая цель: предоставить людям, живущим с ВИЧ, максимально удобные препараты, которые не будут влиять на их жизнь, позволят свести риск развития резистентности (невосприимчивости к терапии) и появления побочных эффектов к минимуму.

С каждым годом появляется все больше новых препаратов и даже новых групп препаратов, токсичность терапии постоянно снижается. Так, в 2007 году появился еще один новый класс препаратов – ингибиторы интегразы, которые блокируют внедрение ВИЧ в ДНК клетки хозяина. В настоящее время этот класс насчитывает пять различных препаратов.

Эти лекарства эффективны по нескольким причинам. Прежде всего, такая схема намного удобнее: человек пьет всего одну таблетку в день и может выбирать комфортное для себя время приема, не нужно подстраивать весь день под график терапии. Кроме того, риск забыть выпить одну таблетку намного ниже, а процент пациентов, которые придерживаются лечения, выше. Когда человек принимает несколько таблеток несколько раз в день, всегда есть шанс случайно не выпить один из препаратов в схеме или пропустить полностью прием терапии, а это повышает риск развития невосприимчивости к лекарствам.

На современном этапе перед медициной стоят новые задачи: добиться полного освобождения от вируса. Кроме того, мировое медицинское сообщество ждет появления первых препаратов инъекционной терапии пролонгированного действия. Их разработка началась в 2010-х. Они позволят заменить ежедневный прием таблеток инъекционным введением лекарства раз в два месяца, что еще больше упростит лечение.

Современная АРВТ состоит из одного комбинированного препарата или нескольких монопрепаратов. В России чаще назначают многокомпонентную терапию. Комбинированные препараты получают в основном дети, а также пациенты, у которых возникают сложности с приемом терапии или резистентность к схемам, состоящим из монопрепаратов.

Правда или ложь

Столкнувшись с диагнозом впервые, люди ищут информацию в Интернете и находят непроверенные и устаревшие данные, а иногда и откровенную ложь. Движение ВИЧ-диссидентов распространяет информацию о бесполезности лечения: по их мнению, терапия приводит к проблемам со здоровьем и даже летальным исходам.

Проблема в том, что доступной информации о высокоактивной антиретровирусной терапии не так много или написана она сложным наукообразным языком. В результате люди до сих пор верят мифам, связанным с ВИЧ и АРВТ. При ближайшем рассмотрении эти мифы легко развенчать.

1. ВИЧ-положительные люди не могут иметь отношений с ВИЧ-отрицательными людьми, потому что могут инфицировать близких.

Иногда люди боятся подойти к ВИЧ-инфицированному, обнять его. На самом деле ВИЧ не распространяется воздушно-капельным путем и через общие предметы быта. Вирус иммунодефицита человека передается исключительно через кровь, сперму, материнское грудное молоко и другие биологические жидкости. Столкнувшись с кислородом, вирус погибает.

При этом, если ВИЧ-инфицированный принимает назначенные лекарства правильно, при достижении неопределяемой вирусной нагрузки он не заразит партнера даже при незащищенном сексе. Иногда достичь полной неопределяемости вируса можно за две недели терапии, однако считается, что человек не передает ВИЧ только спустя полгода после первого анализа с неопределяемой нагрузкой. Однако даже в этом случае не стоит отказываться от средств барьерной контрацепции: они защищают от многих других заболеваний.

2. ВИЧ-положительным нельзя иметь детей.

3. От ВИЧ умирают.

Сегодня мировая медицина считает ВИЧ хронической инфекцией, поддающейся контролю. Опыт показал, что, если принимать современные препараты, ВИЧ-положительные люди живут столько же, сколько в среднем обычный человек.

Люди с ВИЧ-инфекцией могут принимать антиретровирусные препараты и вести нормальный образ жизни, пока ученые придумывают лекарство, способное раз и навсегда остановить вирус.

4. ВИЧ распространен только внутри традиционных групп риска.

Последний, но самый важных миф. ВИЧ вышел за пределы традиционных групп риска – людей, употребляющих инъекционные наркотики, представителей ЛГБТ-сообщества и секс-работниц. Более 60% новых случаев инфицирования связаны с гетеросексуальными контактами. Поэтому каждый человек должен ответственно относиться к своему здоровью и здоровью близких: использовать барьерные средства контрацепции и регулярно, раз в полгода-год, сдавать анализ на ВИЧ. Часто передача вируса происходит именно из-за незнания своего статуса и несвоевременного начала приема антиретровирусных препаратов.

Клинические испытания новых подходов к генной терапии могут проложить путь к функциональному излечению или долговременной ремиссии ВИЧ. American Gene Technologies тестирует генетически модифицированные ВИЧ-специфические CD4 Т-клетки, устойчивые к проникновению вирусов, а Excision BioTherapeutics разрабатывает метод удаления ДНК ВИЧ из хромосом инфицированных клеток. Обзор исследований опубликован в журнале POZ.

Американские генные технологии: AGT103-T

Экспериментальная терапия, получившая название AGT103-T, включает генетически модифицированные CD4 Т-клетки, способные противостоять ВИЧ. Сначала у пациента берут образец клеток периферической крови и отбирают клетки CD4, распознающие белок Gag ВИЧ. Затем в клетку вставляется ген, отключающий рецепторы CCR5, которые ВИЧ использует для проникновения в клетки. В конечном итоге модифицированные CD4 возвращаются в организм.

Согласно данным, первое клиническое испытание AGT103-T проходит успешно. После оценки промежуточных результатов первых 3 участников независимый совет по безопасности не обнаружил серьезных побочных эффектов. Ожидается, что в этом месяце лечение получат еще 2 пациента.

Настоящая проверка функционального излечения — это прекращение приема антиретровирусных препаратов, чтобы увидеть, восстановится ли вирусная нагрузка. Первые участники начнут тщательно контролируемое прерывание лечения в начале 2022 года, сообщают исследователи.

Эксцизионная биотерапия: EBT-101

Excision BioTherapeutics применяет другой подход, используя генную терапию для деактивации генетических кодов ВИЧ в зараженных клетках, тем самым останавливая производство нового вируса.

EBT-101 вводится в виде однократной внутривенной инфузии. Через три месяца после введения участники исследования начнут контролируемый перерыв в лечении антиретровирусными препаратами, чтобы увидеть, как генная терапия влияет на развитие вируса.

В сентябре Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов дало компании добро на начало первой фазы испытаний EBT-101.

Новость

Система CRSIPR/Cas9 удалит вирусную информацию в геноме человека, зараженного ВИЧ

Автор

Редакторы

Генеральным спонсором конкурса, согласно нашему краудфандингу, стал предприниматель Константин Синюшин, за что ему огромный человеческий респект!

CRISPR/Cas9

Рисунок 1. Система CRISPR/Cas9 как один из вариантов бактериального иммунитета. а — Внедрение чужеродной ДНК в клетку бактерии. б — Приобретение спейсера. в — Транскрипция CRISPR-локуса. г — Образование guideРНК. д — Образование активного комплекса Cas9 + guideРНК. е — Связывание чужеродной ДНК. ж — Внесение двухцепочечного разрыва в ДНК. Сокращения см. в тексте.

Но затем в 2012 году бактериальную защитную систему взяли на вооружение ученые, ведь если соединить Cas9 с определенной РНК, то можно разрезать необходимый ген. Разрезанный ген запускает в клетке систему репарации, которая в буквальном смысле пытается соединить концы с концами. При этом происходят различные мутации репарируемого гена — в основном удаления, но бывают и разные вставки. Однако если мы предоставим матрицу для репарации, ген может вернуться к правильной форме. Так можно вносить любые изменения в геном. Это означает, что мы в теории можем лечить генетические заболевания, рак и не только. Сегодня мы поговорим о том, как CRISPR/Cas9 поможет решить проблему избавления от вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).

ВИЧ — возбудитель синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИДа) — относится к роду лентивирусов семейства ретровирусов, чей геном представлен двумя копиями одноцепочечной РНК, на двух концах которой находятся длинные концевые повторы (или по-английски long terminal repeat, LTR) [7]. В самой вирусной частице содержатся еще три фермента: протеаза, обратная транскриптаза и интеграза (рис. 2). Протеаза расщепляет продукты считывания вирусных генов с образованием зрелых белков.

Рисунок 2. Строение вириона ВИЧ. Частица покрыта липидным бислоем, происходящим из клеточной мембраны организма-хозяина, и усеяна молекулами вирусных гликопротеинов.

Жизненный цикл ВИЧ довольно прост (рис. 3). Вначале вирус инфицирует клетку, причем в качестве рецептора служит молекула CD4, а корецепторами становятся рецепторы хемокинов, поэтому поражаются клетки иммунной системы: T-лимфоциты (T-хелперы), моноциты, макрофаги, а также клетки мозга (макрофаги, микроглия, астроциты), клетки лимфоидной ткани желудочно-кишечного тракта и другие. Затем одноцепочечный РНК-геном с помощью обратной транскриптазы превращается в двухцепочечную ДНК, так называемую провирусную ДНК. Наконец интеграза встраивает двухцепочечную провирусную ДНК в геном хозяина. Эта встроенная информация считывается, причем промоторами (то есть местами, привлекающими РНК-полимеразу для транскрипции) служат длинные концевые повторы — LTR. Собираются новые вирусные частицы, поражающие новые клетки. В целом весь этот процесс приводит к частым мутациям вируса, особенно вариабельны поверхностные гликопротеины, в том числе поэтому частицы ВИЧ так неуловимы для нашего иммунитета [8], [9].

Рисунок 3. Жизненный цикл ВИЧ. 1 — зрелая вирусная частица; 2 — связывание с клеткой благодаря рецепторам; 3 — слияние мембран вируса и клетки; 4 — высвобождение вирусной РНК; 5 — превращение РНК в ДНК (обратная транскрипция); 6 — интеграция в геном клетки; 7 — считывание вирусной информации; 8 — сборка и выход вирусной частицы; 9 — новая вирусная частица.

Терапия ВИЧ

Рисунок 4. Удаление провируса из генома человека приведет к невозможности размножения и распространения вируса.

Современная высокоактивная антиретровирусная терапия основывается на ингибировании обратной транскриптазы, протеазы, интегразы, слияния вируса с клеткой, что значительно осложняет жизнь вируса. Но все же ВИЧ-инфекция в настоящий момент остается неизлечимым заболеванием, так как такая терапия никак не влияет на ДНК вируса у нас в геноме: у пациентов, принимающих антиретровирусную терапию, около 10 6 клеток содержат провирус. Сверх того, у пациентов могут быть серьезные побочные эффекты или устойчивость к антиретровирусной терапии [10].

Рисунок 5. Система CRISPR/Cas9, интегрированная в клетки, может препятствовать их заражению вирусом и интеграции вируса в геном.

Предложенная система протестирована японскими учеными в 2013 году на культуре клеток человеческих T-лимфоцитов [8]. В качестве мишени они предложили использовать LTR, а в них — разные участки, необходимые для связывания факторов инициации и элонгации транскрипции. Трехкратное внесение в клетки конструкции CRISPR/Cas9 снижало считывание вирусного генома почти в 3 раза (с 97,8% до 35,5%). Дальнейший анализ показал, что почти все клетки содержали в области провируса различные мутации.

Так как LTR — это концевые повторы, то разрезание с двух концов теоретически может привести к полному вырезанию встроенного в геном вирусного куска. И действительно — почти у трети клеток (31,8%) после трехкратного внесения системы CRISPR/Cas9 этот участок полностью удалялся.

А что насчет мутаций вируса? Ведь если целевой участок изменит свою структуру, система CRISPR/Cas9 не сможет его найти и обезвредить. Понимая это, ученые выбрали именно тот участок LTR, что содержит высококонсервативные последовательности ДНК, практически одинаковые у всех подвидов ВИЧ.

Не все так просто

Рисунок 6. Повышение специфичности разрезания гена с использованием никаз, вносящих одноцепочечные разрывы.

Предложенная система изменения генов не так чудесна, как может показаться на первый взгляд, как бы я ни старалась вас в этом убедить. Есть много подводных камней, которые требуют дальнейшего исследования.

Таким образом, стремительно развивающаяся генная терапия с использованием CRISPR/Cas9 — ключ к избавлению от ВИЧ-инфекции и ассоциированных с ней заболеваний и осложнений. Однако не стоит ожидать, что такое лекарство сегодня-завтра появится на прилавках в аптеке, ведь еще о многом стоит подумать, чтобы разработать действительно эффективное и безопасное лечение.

Новость

Комплекс-белок Cas9/sgRNA/viral RNA (слева) и модель вируса иммунодефицита человека (справа), построенная коллективом Visual science.

Автор

Редактор

Спонсор публикации этой статьи — Виктор Татарский.

Врага нужно знать в лицо

Об иммунитете, апоптозе и вообще.

Иммунная система развивалась сотни миллионов лет. По типу реакции ее обычно делят на врожденный (неспецифичный) и приобретенный (специфичный) иммунитет [1], [2]. Считается, что специфичный (то есть вырабатываемый к конкретному патогену) иммунитет впервые появился у челюстноротых (рыб и всех вышестоящих по эволюционному древу таксонов) после отделения от бесчелюстных (миног и миксин), хотя у вторых имеется аналогичная система защиты [3]. К клеткам специфичного иммунитета относят В-лимфоциты, Т-лимфоциты и NK-клетки (естественные киллеры, natural killer cells). Помимо этого существуют моноциты, которые хоть и не являются истинными инструментами приобретенного иммунитета, однако выполняют некоторые функции по нейтрализации патогена: фагоцитоз, презентация антигена, выделение бактерицидных веществ и цитокинов.

Рисунок 1. Взаимодействия Т-киллеров (слева) и Т-хелперов (справа) с зараженными клетками. Для передачи сигнала о заражении необходимо выполнение двух условий: контакт комплекса МНС-патоген с TcR (T-cell Receptor, рецептор Т-клеток) и CD. Двигаясь по организму, Т-лимфоциты проверяют каждую клетку на предмет наличия у нее антигена в комплексе с МНС. Их можно сравнить с подслеповатой глуховатой бабушкой, пришедшей забирать дитятко из детского сада. Для опознания ей надо подойти вплотную и по нескольким (в данном случае по двум) признакам определить, ее ли это чадо или нет.

Т-лимфоциты, в свою очередь, необходимы для уничтожения клеток, зараженных внутриклеточными паразитами, и опухолевых клеток. Они делятся на два основных типа в зависимости от класса рецепторов, находящихся на внешней стороне их мембраны.

Т-киллеры несут CD8 рецепторы и отвечают за:

Т-хелперы имеют CD4 рецепторы и ответственны за секрецию цитокинов, которые:

активируют макрофаги для борьбы с внутриклеточными паразитами;
способствуют продукции антител В-лимфоцитами.

Но не менее важна роль Т-хелперов в подготовке зрелых Т-киллеров из клеток-предшественниц, активации NK-клеток и моноцитов.

Как же происходит опознавание антигена на молекулярном уровне? Здесь надо упомянуть еще об одном очень важном классе рецепторов — МНС (Major Histocompability Complex или главном комплексе гистосовместимости). Они бывают двух классов: I и II. МНС I присутствует на поверхности всех ядерных клеток организма человека. Он необходим для опознавания клетки натуральным киллером и Т-киллером (рис. 1, 2). Если по какой-то причине МНС I изменен, несет на себе антиген или отсутствует, клетка будет подвергнута апоптозу. МНС II находится на поверхности В-лимфоцитов, макрофагов и дендритных клеток. Он необходим для презентации антигена Т-хелперам (рис. 1, 2). Жизнь пула Т-хелперов можно представить как прогулку с ребенком в зоопарке, только вместо животных — антигены, вместо ребенка — Т-хелпер, а вместо взрослых, объясняющих, кто есть кто, — три перечисленных типа клеток.

Рисунок 2. Процесс передачи сигнала Т-киллеру и Т-хелперу. Первый этап — сборка комплекса МНС-антиген, второй этап — презентация комплекса на поверхности клетки.

Первый этап проникновения вируса в клетку — взаимодействие вирусного белка gp120 (рис. 3) с рецептором CD4. Отсюда понятно, почему ВИЧ размножается именно в Т-хелперах. Взаимодействию способствуют корецепторы CCR5 и CXCR4 [8]. В норме они являются рецепторами цитокинов, а при взаимодействии ВИЧ с клеткой их связь является необходимым условием проникновения вируса внутрь. Мутации в генах этих рецепторов обеспечивают частичную устойчивость носителей таких мутаций (таких людей около 2%, причем некоторые штаммы вируса все равно могут их поражать) [9]. Затем в мембрану клетки погружается белок gp41, после чего мембрана вируса сливается с клеточной, и происходит распаковка генетического материала. По принципу обратной транскрипции с РНК-матрицы вируса с помощью фермента ревертазы (обратной транскриптазы) синтезируются молекулы кДНК (комплементарной ДНК). Синтезированная кДНК вставляется вирусной интегразой в геном клетки хозяина. После попадания в геном хозяина вирус может никак себя не проявлять до нескольких лет — протекает так называемый инкубационный период. Только когда клетки активно пролиферируют, а значит, синтезируют белки на матрице ДНК, начинается сборка вирусных частиц , выход их из клеток и гибель последних (так как каждая частица забирает с собой часть клеточной мембраны клетки, вирусы попросту разрывают клетку).

Рисунок 3. Строение ВИЧ. Белки gp120 и gp41 участвуют в рецепции вируса клеткой и проникновении вирусной частицы внутрь. Липидная оболочка захватывается от клетки хозяина вместе с частью мембранных белков. Белки матрикса синтезируются в клетке после встраивания кДНК в геном в момент наработки клеточных белков для деления. Протеаза, возможно, необходима для разрезания противоапоптотического фактора Bcl-2 [9]. Ферменты обратная транскриптаза и интеграза создают кДНК на матрице РНК и встраивают кДНК в геном Т-хелпера соответственно. Tat — белок, вовлеченный в индукцию апоптоза. Нуклеокапсид — комплекс из РНК и белков вируса, представляющий собой компактную упакованную форму генома. Капсид — белковая оболочка, защищающая содержимое от воздействия внешних условий.

Как иммунитет бактерий правит геномы

Система редактирования геномов CRISPR/Cas известна уже довольно давно (впервые локус описал в 1987 году Есизуми Исино из университета Осаки), но только недавно (в 2005 году) ученые поняли ее истинное предназначение [11], [12].

Как вы уже поняли, система состоит из двух компонентов: CRISPR-локуса (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats или сгруппированные и регулярно разделенные короткие палиндромные повторы) и белков Cas, которые, являются нуклеотид-специфичными эндонуклеазами (а название получили за работу в команде с CRISPR — Crispr associated).

Помимо CRISPR-локуса и блока генов Cas в ДНК бактерии (не обязательно в нуклеоиде [12]) находится ген tracrРНК (transactivated crispr RNA), частично комплементарной палиндромам.

Для формирования специфичной устойчивости к вирусу бактерия, как и человек, должна встретиться с ним дважды.

Первый раз после внедрения вирусной ДНК в клетку происходит разрезание ДНК белками Cas1 и Cas2 на протоспейсеры и встраивание их в начало CRISPR-локуса. Cas1 и Cas2 формируют при этом комплекс, причем Cas2 играет только структурную роль, удерживая ДНК, тогда как Cas1 встраивает ее. Каждый протоспейсер вставляется в CRISPR-локус так, чтобы от другого (уже имеющегося) спейсера его отделял палиндром.

Соответственно, после транскрипции ДНК всего комплекса образуются три продукта (рис. 4):

tracrРНК;
РНК белка Cas (наиболее изученным является Cas9, поэтому далее повествование пойдет о нем), далее транслирующаяся;
pre-crРНК (poly-spacer precursor crRNA или многоспейсерный предшественник crРНК), которая представляет собой транскрипт спейсеров, разделенных образовавшимися из палиндромов шпильками или петлями.

Рисунок 4. Строение CRISPR-локуса и результат транскрипции. leader — лидерная последовательность, отвечающая за начало транскрипции, со стороны которой вставляется новый спейсер. repeat — палиндромный повтор, который после транскрипции превращается в шпильку или петлю.

Второй этап — образование комплекса pre-crРНК/Cas9/РНКаза III. Очевидно, что вся длинная pre-crРНК не может участвовать в опознавании инвазивной ДНК, так как, во-первых, очень длинна, что конформационно неудобно, а во-вторых, при сравнении спейсеров РНК с протоспейсерами инвазивной ДНК длинный транскрипт начнет путаться и в итоге образует клубок, непригодный для дальнейшей работы. Самое логичное — разделить длинную последовательность на короткие участки, которые могли бы проверятся на соответствие инвазивной ДНК белком Cas9. И тащить за собой не надо, и не запутается.

С помощью фермента РНКазы III и при участии tracrРНК pre-crРНК разделяется по границам повторов так, что в белково-нуклеиновый комплекс входят один спейсер и один повтор, комплементарно связанный с tracrРНК (рис. 5) [13]. Повтор полностью теряет свою вторичную структуру, tracrРНК же оставляет несколько шпилек (обычно три).

Рисунок 5. Белково-нуклеиновый комплекс после созревания транскрипта. crРНК состоит из спейсера (слева) и повтора, соединенного с частью tracrРНК (справа). Три петли на tracrРНК нужны для удержания ее эндонуклеазой Cas9.

комплементарность спейсера комплекса Cas9/crРНК/tracrРНК протоспейсеру инвазивной (например, вирусной) ДНК;
наличие в геноме вируса около протоспейсера последовательности из трех нуклеотидов — РАМ (Protospacer Adjacent Motif, прилежащий к протоспейсеру мотив).

Таким образом клетка страхуется от уничтожения своей ДНК. Но даже просто разрезанная в одном месте вирусная ДНК может представлять опасность, поэтому завершает инактивацию негомологическое сращивание концов (non-homologous end joining, NHEJ). При этом происходит инсерция/делеция одного или нескольких нуклеотидов, что приводит к потере инфекционности.

Рисунок 6. Полная схема механизма работы CRISPR/Cas9 системы. а — Транскрипция CRISPR локуса с образованием pre-crРНК. б, в — Разрезание РНК РНКазой III и образование комплексов Cas9/tracrРНК/crРНК. г — Вторичное проникновение в клетку чужеродной ДНК. д — Соединение комплекса с инвазивной ДНК. е — Образование двухнитевого разрыва в протоспейсере.

А где же тут редактирование геномов? А вот где:

во-первых, таким образом можно просто нокаутировать целевой ген и добиться прекращения экспрессии того или иного белка;
во-вторых, после создания двухцепочечного разрыва в образовавшуюся брешь можно вставить нужный нам ген и заставить организм синтезировать нужный нам белок.

Рисунок 7. Сравнение искусственной (а) и естественной (б) систем CRISPR/Cas9. Отличие состоит лишь в том, что искусственная РНК едина, а природная — состоит из двух частей, гены которых разделены.

Битва века

Однако вернемся к теме этой статьи.

Так как система редактирования геномов может помочь в избавлении от ВИЧ? Очень просто: вирус можно вырезать! Нацелив Cas9, путем создания sgРНК с последовательностью, комплементарной вирусной кДНК.

Некоторое время назад группа ученых из немецкого Института экспериментальной вирусологии и иммунологии уже пыталась использовать инструмент редактирования геномов для удаления ВИЧ из культуры HeLa [15]. Они модифицировали Cre-рекомбиназу методом направленной эволюции и один из полученных вариантов использовали для удаления вируса путем контролируемой рекомбинации [16]. Однако надо учитывать, что между Т-хелперами и опухолевой HeLa есть немало различий, к тому же, авторы не предлагают вариантов доставки или экспрессии гена Tre-рекомбиназы (усовершенствованный вариант фермента Cre).

С другой стороны, группа американских исследователей опубликовала в марте этого года статью [17], где подробно описывались метод доставки и механизм удаления вируса. Ученые ставили перед собой задачу не только полностью избавить клеточную культуру Т-хелперов от вируса, но и проверить отсутствие цитотоксического действия самой CRISPR/Cas9 системы. Единственный недостаток этого геномного инструмента в том, что из-за сравнительно небольшой длины спейсера, даже при наличии страхующего элемента PAM, в больших геномах могут быть найдены нецелевые сайты, подверженные разрезанию (off-target sites). Именно поэтому исследователи уделяли данной проблеме немало внимания.

Работа проводилась с использованием штамма ВИЧ-1 и клеточной линии Т-хелперов 2D10, зараженной вирусом в покоящейся стадии. Доставка и экспрессия sgРНК/Cas9 осуществлялась с помощью лентивирусного вектора.

Для оценки того, вырезался ли вирус из двух мест встраивания (1-я и 16-я хромосомы), было проведено полногеномное секвенирование. Оно показало, что в клетках, где экспрессировались и гены Cas9, и sgРНК, провирусная ДНК отсутствует.

Был проведен анализ того, могут ли гены, куда встроился провирус (RSBN1 и MSRB1), и близлежащие гены нормально транскрибироваться после его вырезания. Ученые показали, что как RSBN1, так и MSRB1 нормально экспрессируются. Соседние гены также не претерпели изменений.

С помощью биоинформатических методов и анализа баз данных было показано, что sgРНК/Cas9 не проявляет активности по отношению к нецелевым сайтам.

Таким образом, можно с уверенностью сказать, что группа Камински впервые успешно удалила ВИЧ из культуры зараженных Т-хелперов. Данное достижение приблизило человечество к победе на ВИЧ. Да, это только культура клеток. Да, до внедрения данной техники в медицину пройдут годы, а может и десятки лет, но данная работа является уникальной в своем роде, ибо ученые не только бросили вызов одному из страшнейших заболеваний на планете, но и смогли победить его — пусть даже масштаб сражения пока невелик.

Перспективы применения данной технологии очевидны: введя пациенту вектор, содержащий гены Cas9 и sgРНК, мы добьемся их экспрессии и полного удаления вируса из клеток. Современная терапия, направленная против ретровирусов, являющаяся основным средством борьбы с ВИЧ, не удаляет вирус из клеток, так как провирус остается встроенным в ДНК хозяина. В свою очередь, данный подход не оставляет вирусу шансов укрыться.

Новость

иллюстрация Вячеслава Федорова

Авторы

Редактор

Генеральный партнер конкурса — ежегодная биотехнологическая конференция BiotechClub, организованная международной инновационной биотехнологической компанией BIOCAD.

Спонсор конкурса — компания SkyGen: передовой дистрибьютор продукции для life science на российском рынке.

На школьных уроках биологии мы узнавали, что мутации — это изменения, дающие потомству не только новый цвет волос или глаз, но неизлечимые болезни. Но оказывается, что в реальной жизни каждый человек, помимо наследования генетического материала родителей, рождается с, примерно, 70 новыми мутациями [1]. В большинстве случаев это не является для него чем-то фатальным, а просто делает отличным от другого, даже самого близкого родственника.

Зачастую мутациями называют лишь часть всех изменений — только те, что приводят к очевидному отличию фенотипа (например болезням). Однако есть существенный процент мутаций, которые в норме присутствуют у более чем 1% популяции, но не заметны невооруженным секвенатором глазом.

Полиморфизмы встречаются повсюду в геноме. От их расположения можно ожидать разного воздействия: снипы в промоторной зоне гена могут иногда приводить к изменению уровня экспрессии этого гена, SNP в транслируемых участках генома могут несколько модифицировать строение или эффективность синтеза как РНК, так и белка, влияние SNP в сайте сплайсинга может быть более значительным, чем просто в транслируемой части. Почти у каждого гена найден целый ряд полиморфизмов, которые потенциально могут влиять на его работу в клетке.

Рисунок 1. Визуальный пример однонуклеотидных полиморфизмов в популяции. Кружок — диплоидный организм, например, человек. Соответственно, рассматривая один полиморфизм, мы имеем дело с двумя аллелями. На рисунке видно, что аллель С > A.

иллюстрация Вячеслава Федорова

Находят полиморфизмы посредством анализа результатов больших проектов по секвенированию популяций. Благодаря ним у нас есть более-менее точная статистика встречаемости огромного количества снипов в разных группах человеческих особей (рис. 1). Стоит отметить, что многие относительно замкнутые малые сообщества могут нести в себе доселе не найденные и, уж тем более, не описанные полиморфизмы, но, в целом, можно вполне смело говорить о том, что сухих данных (которые можно описывать и исследовать на предмет зависимостей) у ученых уже очень много. Доступ к этим находкам есть у каждого, кто знает, как искать (рис. 2).

Рисунок 2. Небольшой участок человеческого генома, в районе гена ACE1 (ангиотензинпревращающего фермента 1). Синяя стрелка — база данных полиморфизмов описанных в литературе (cited variations); над ней — база данных полиморфизмов с доказанным клиническим значением (clinical). Красная стрелка — база данных всех найденных снипов (live RefSNPs). Обратите внимание, полиморфизмы окрашены в разные цвета в зависимости от их типа: красные — SNV/SNP (однонуклеотидные вариации); желтые — инсерции; фиолетовые — делеции; синие — indel (инсерция+делеция).

Проявления снипов чрезвычайно разнообразны, например, доказано, что они влияют на частоту суицидального и агрессивного поведения [3], заболеваемость серповидно-клеточной анемией (но полиморфизмом, то есть вариантом нормы, такую мутацию можно назвать только для тех популяций, которые еще недавно были подвержены постоянной опасности малярии) [4], [5], склонность к развитию мужского бесплодия [6], восприимчивость к инфекциям и характер их протекания.

Полиморфизмы имеют единую кодировку (рис. 3):

Рисунок 3. Кодировка полиморфизмов. rs — reference sequence (референсный сиквенс).

иллюстрация Вячеслава Федорова

Часто можно встретить рядом с названием полиморфизма такое обозначение: rs0000 G>A. Оно призвано показать что G — мажорный аллель, а A — минорный (встречается в популяции реже). Может также встречаться такая форма: G/A, в таком случае указания на минорность нет, а порядок не имеет значения. Стоит обратить внимание на то, что обозначение G>A равнозначно обозначению C>T, и в контексте одного полиморфизма могут встречаться обе формы записи. Происходит так потому, что секвенирование может проходить как по плюс-цепи ДНК (кодирующей цепи), так и по минус-цепи (комплементарной кодирующей). Так, у одних исследователей в определенном месте генома будет встречаться A/G, а у других — T/C.

Интерфероны да интерлейкины (минутка иммунологии)

Цитокины играют важную роль в воспалительных и инфекционных процессах. Влияя на регуляцию экспрессии соответствующих генов, снипы могут влиять на протекание инфекционного процесса.

Цитокины — небольшие молекулы, которые передают сигналы между клетками. Их можно разделить на несколько групп: интерфероны, интерлейкины, хемокины, лимфокины и факторы некроза опухоли.

Интерфероны (IFN, от англ. interferon) — белки, выделяемые в ответ на попадание в организм вирусов, бактерий и некоторых химических соединений. IFN делятся на три типа. К первому типу относят IFN-α, IFN-β и IFN-ω, ко второму — IFN-γ, к третьему — IFN-λ. Нас будут интересовать IFN первого и третьего типов, так как они вырабатываются в ответ на вторжение в организм вирусов.

Когда в организм попадает вирус, его гликопротеины или, например, РНК распознаются рецепторами опознавания паттерна, к которым относятся знаменитые Toll-подобные рецепторы, после чего начинается синтез IFN. Далее зараженная клетка выпускает IFN, которые взаимодействуют со своими специфичными рецепторами на других клетках, что приводит к синтезу различных белков, таких как протеинкиназа R и олигоаденилатсинтетаза (РНКаза L), которые теми или иными способами препятствуют размножению вируса.

Интерлейкины (IL, от англ. interleukin) — довольно большая группа цитокинов. Различные IL регулируют рост, дифференцировку и подвижность клеток. Мы же рассмотрим некоторые IL, которые вырабатываются в ответ на вирусную инфекцию:

IL-12 участвует в защите человека от внутриклеточных патогенов, таких как вирус кори и ВИЧ-1.
IL-15секретируется фагоцитами после инфицирования вирусами (например, вирусом герпеса). Этот цитокин индуцирует пролиферацию T-клеток и NK-клеток, которые уничтожают инфицированные вирусом клетки.
IL-28 активирует уже знакомую нам олигоаденилатсинтетазу.

Полиморфизмы и инфекционные болезни (не ковид, честно)

Вирусом гриппа ежегодно заражается около 7% взрослых людей, и до 25% детей до 5 лет [7]. Хотя большинство людей восстанавливается после инфекции в течение недели, небольшой процент все же страдает от тяжелого респираторного дистресс-синдрома или других редких осложнений.

Оказывается, некоторые снипы могут повышать вероятность возникновения осложнений течения болезни. Например, rs12252-G/G A>G интерферон-индуцируемого трансмембранного белка 3 (IFITM3) вызывает более быстрое прогрессирование инфекции и более высокую летальность [8]. Возможно, из-за полиморфизма в гене этого белка происходит альтернативный сплайсинг транскрипта, что приводит к укорачиванию и изменению мембранной локализации IFITM3. Ген белка IFITM3 содержит два экзона и может кодировать два варианта белка, которые различаются наличием 21 аминокислоты на N-конце. У значительного числа пациентов с осложнениями был минорный (то есть редко встречающийся) генотип, изменяющий акцепторный сайт сплайсинга, без которого выполнить правильный сплайсинг невозможно. Также минорный генотип уменьшал рестрикцию вируса клеточными системами in vitro [9].

Хотя данный SNP и снижает противовирусную активность по отношению к гриппу, относительно ретровирусов она повышается, что может быть объяснением распространенности этого снипа в человеческой популяции [10].

Также было выяснено, что некоторые SNP в генах, кодирующих белки легочного сурфактанта (англ. SFTPs), включая SFTPA и SFTPB, ассоциированы с тяжелым протеканием гриппа [11].

Другим, менее знаменитым вирусом, а именно вирусом Эпштейна—Барр (Epstein—Barr virus, EBV), было когда-либо заражено более 90% общемировой популяции людей [12]. Хотя обычно инфекция проходит мягко или бессимптомно, EBV способен вызывать острый инфекционный мононуклеоз и различные виды онкологических заболеваний, в частности, лимфому [12]. Снипы влияют на противовирусный иммунный ответ, а также на реактивацию EBV, посредством изменения генов цитокинов, вызывающих воспаление, а также способных контролировать EBV. Например, высокие уровни продукции IL-10 защищают от первичной и хронической инфекции EBV [13]. Так, три полиморфных сайта в промоторной зоне гена, кодирующего IL-10, влияют на уровень продукции интерлейкина. Генотип, в котором представлены все три SNP (rs1800871 A>G, rs1800872 T>G и rs1800896 G>A), связан с устойчивостью к EBV [14], [15].

иллюстрация Вячеслава Федорова

Инфекция респираторно-синцитиальным вирусом (англ. RSV) может приводить к разным клиническим исходам — от легкой простуды до тяжелого бронхиолита, пневмонии или астмы. Примерно у 1–2% инфицированных детей развивается заболевание, требующее госпитализации [19], [20]. Генетические исследования здоровых по отношению к другим болезням детей выявили SNP в генах, участвующих в иммунной защите, которые чрезмерно представлены у пациентов, госпитализированных с RSV.

Уже знакомые нам SFTPs могут, как и в случае с вирусом гриппа, влиять на инфекцию RSV напрямую, ограничивая инфицирование эпителия легких RSV и регулируя иммунный ответ на вирус. Полиморфизмы в генах SFTPA2 и SFTPD были ассоциированы с тяжелой инфекцией RSV в группах пациентов из Финляндии и США [21–23]. Несколько исследований также продемонстрировали связь между полиморфизмом стартового кодона гена рецептора витамина D (который кодирует и внутриклеточный рецептор, и фактор транскрипции, что тоже примечательно) и тяжестью вызванного RSV-инфекцией бронхиолита [24–26]. Этот полиморфизм усугубляет патогенез RSV, потому что из-за него кодируется неправильный рецептор витамина D, который не может поддерживать противовирусные цитокиновые реакции, опосредованные STAT1 (STAT1 — фактор транскрипции, который участвует в положительной регуляции генов за счет сигналов интерферонов) [27].

А завершает наш парад (но не обзор) вирус, которым инфицировано более 2% населения Земли [28], вирус, от которого, по данным Всемирной организации здравоохранения, в 2016 году погибло 399 000 человек [29], вирус, который может вызывать цирроз или рак печени. Да, как вы уже догадались, это вирус гепатита C (ВГC).

Известно, что у 10–15% больных хроническим вирусным гепатитом C (ХВГC) есть риск развития цирроза печени в течение 20–30 лет от момента инфицирования, но в то же время у значительной части больных цирроз печени не формируется на протяжении всей жизни [28]. Более того, известно, что у представителей европеоидной расы чаще наблюдается спонтанное выздоровление и устойчивый ответ на противовирусную терапию, чем у афроамериканцев [30], но реже, чем у представителей монголоидной расы [31]. Все это наталкивает на мысль, что в развитии болезни немалую роль играют генетические факторы. И действительно, было обнаружено, что пятинуклеотидная делеция в промоторе гена интерферон-индуцируемого хемоаттрактанта T-клеток (CXCL11) чаще встречается у больных ХВГC, чем у контрольной группы [32]. Эта делеция приводит к уменьшению активности промотора гена CXCL11 в присутствии реплицирующегося ВГС in vitro и ослаблению миграции T-лимфоцитов in vivo. Также был идентифицирован SNP гена IL-28B, который связан с устойчивым ответом на терапию интерфероном у европейцев [33] и японцев [34]. Этот снип располагается в 8900 п.н. от участка конца транскрипции IL-28B в регионе между генами IL-28A и IL-28B. Было показано, что аллель G, в отличие от аллеля T, ассоциирован с низким уровнем ответа на противовирусную терапию. Так, у пациентов, гомозиготных по аллелю G, спонтанное выздоровление и устойчивый ответ на терапию наблюдался в два раза реже, чем у пациентов, гомозиготных по аллелю T [35].

Рубрика ковида

Недавно ворвавшаяся в жизнь всей планеты инфекция SARS-CoV-2 сразу притянула к себе внимание биоинженеров, вирусологов, биоинформатиков и вообще всех. А пристальное внимание ученых в совокупности с возросшим финансированием дает свои плоды. Статей уже, буквально за год, по запросу coronavirus на PubMed вышло 39 300 штук. Такой объем данных трудновато даже просмотреть, но мы постарались взглянуть на этот массив с точки зрения именно полиморфизмов. В первую очередь стоит понять в каком направлении копают ученые, какие гены притягивают внимание.

Разумеется, на ум сразу приходит ген белка ACE2 (ангиотензинпревращающего фермента 2), через который вирус проникает в клетку. И действительно, есть ряд работ тем или иным методом предсказывающих или показывающих влияние вариаций ACE2 на течение болезни. Так, было показано, что упрощающие проникновение вируса в клетку гемизиготные варианты ACE2 приводят к повышенной смертности у мужчин [36], в то время как некоторые редкие полиморфизмы того же гена улучшают клиническую картину и облегчают протекание болезни.

Гемизиготность — генетическое состояние клетки или организма, при котором отсутствует одна хромосома из пары или отсутствует участок одной хромосомы из пары. Например, гены Х-хромосомы в мужском кариотипе, или линии раковых клеток, у которых отсутствуют целые участки хромосом.

Другой часто исследуемый ген — белка IFITM3 (интерферон-индуцируемого трансмембранного белка 3). Важен он тем, что в ответ на интерфероновый сигнал блокирует вход вирусов в цитоплазму, а также может инактивировать уже образующиеся в клетке вирусные частицы. Для него уже выявлены полиморфизмы, влияющие на протекание ковида. Например rs12252 A>G: в случае гомозиготного G-аллеля вероятность тяжелого протекания и летального исхода выше [37].

Вирус входит в клетку не только через ACE2, ему также нужна помощь в протеолитической активации spike-белка. На роль такой протеазы-помощницы лучше всего подходит TMPRSS2 (мембранно-связанная сериновая протеаза). В работе [38] выявлена, помимо прочих, зависимость встречаемости нескольких снипов гена TMPRSS2 и склонности к заражению.

Забавное наблюдение

Мы выделили ферменты ACE2 и TMPRSS2, как ключевые клеточные белки, нужные для проникновения SARS-CoV-2 в клетку. А теперь давайте посмотрим на РНК-профили экспрессии этих генов (рис. 5). Видите, где максимальный уровень экспрессии?

Читайте также: