Генотипирование хеликобактер пилори иммуноблот

Обновлено: 28.03.2024

Несмотря на высокий процент инфицирования населения Helicobacter pylori подавляющее большинство инфицированных лиц не имеют клинических проявлений на момент диагностики, но они, тем не менее, представляют собой группу риска, в которой с течением времени развивается хронический гастрит, ЯБЖ, ЯБДК, экстранодальня В-клеточня MALT-лимфома или аденокарцинома желудка.

К настоящему времени у двух штаммов H.pylori (J99 и 26695) определены полные последовательности генома. Геном H.pylori содержит  1600 генов (J. Tomb, 1997; R. Alm, 1999). Ряд генов, продукты которых – белки CagA, VacA, IceA, BabA, считаются факторами патогенности.

Ген cagA (cytotoxin-associated – маркер gene) островка патогенности - cag (cag-PAI) кодирует белки IV секреторной системы Helicobacter pylori, функция которой состоит в доставке эффекторных молекул микроорганизма в клетки макроорганизма. Они позволяют H.pylori модулировать метаболизм эпителиоцитов слизистой оболочки желудка, включая и экспрессию протоонкогенов.

Продукты генов, входящих в состав островка патогенности, способны переносить cagA непосредственно в эпителиоциты слизистой оболочки желудка, где он подвергается фосфорилированию. Фосфорилирование cagA внутри эпителиоцитов приводит к изменению их цитоскелета, в результате чего происходят морфологические изменения эпителиоцитов. Гены островка патогенности также принимают участие в модуляции экспрессии генов эпителиальных клеток, кодирующих митоген-активируемые протеинкиназы, ядерный фактор kB (NF-kB) и активирующий белок-1 (АР-1). Транскрипция гена интерлейкина 8 (ИЛ-8) эпителиоцитами слизистой оболочки желудка также зависит от экспрессии ряда генов, входящих в состав островка патогенности H.pylori.

Другой фактор патогенности H.pylori - ген vacA (vacuоlating-associated cytotoxin) является цитотоксином, который экскретируется и повреждает эпителиальные клетки желудка. При низких значениях рН неактивные додекамеры токсина распадаются на мономеры, которые взаимодействуют с липидным бислоем и восстанавливаются как гексамерные, анион-селективные мембранные каналы. Увеличение проницаемости анионов через эти каналы является свойством всех vacA-продуцирующих штаммов H.pylori (T. Cover, 1992; 1996).

Вакуолизирующий цитотоксин кодируется геном vacA, который присутствует фактически у всех штаммов Helicobacter pylori. Ранее были описаны различные аллельные варианты двух вариабельных участков этого гена. Так, vacA s регион (кодирующий сигнальный пептид) существует в виде s1 или s2 аллельных типов. В s1 типе были идентифицированы s1a, s1b и s1c субтипы. Средний m регион существует в двух аллельных вариантах - m1 или m2 (J. Atheron, 1995; 1997).

Уровень секреции вакуолизирующего цитотоксина определяется мозаичной структурой гена, кодирующего VacA. Генотипы штаммов H.pylori s1m1 и s1m2 vacA имеют максимальный или средний уровень секреции цитотоксина. Генотип штаммов H.pylori s2m2 проявляет незначительную токсическую активность (T. Cover, 1992; J. Guruge, 1998). Между cagA- и vacAs1- генотипами штаммов H.pylori существует строгая ассоциация - большинство vacAs1- штаммов являются cagA позитивными.

Относительно недавно описанный ген iceA (induced by contact with epithelium) существует в двух аллельных формах - iceA1 и iceA2. Предполагается, что iceA1 является маркером язвенной болезни желудка . У больных, инфицированных H. pylori c генотипом iceA1, инфильтрация собственной пластинки слизистой оболочки желудка полиморфно-ядерными нейтрофилами выше, чем у инфицированных H. Pylori с другим генотипом. В ряде работ было показано, что адгезия к эпителиальным клеткам желудка in vitro индуцируется экспрессией IceA1 белка. Однако in vivo детектируются как iceA1, так и iceA2 транскрипты (R. Peek, 1998).

Факторы бактериальной адгезии на эпителий желудка человека также могут вносить вклад в специфический тропизм и патогеность штаммов H. pylori. Ген babA (blood group antigen-binding adhesin) является медиатором адгезии H. pylori с системой антигенов Lewis (Le) на эпителиальных клетках желудка. In vitro было показано, что H.pylori специфически связывается с поверхностью клеток слизистой желудка и регулируется фукосилированными антигенами этой группы. Более того, эксперименты на трансгенных мышах, экспрессиру-ющих Lewis В эпитоп в эпителиальных клетках желудка, показали, что он функционирует как рецептор для H.pylori адгезина и запускает процесс прикрепления бактерии к поверхности слизистых клеток желудка. Прикрепление H. pylori к поверхности слизистых клеток желудка у трансгенных мышей вызывает развитие хронических гастритов и атрофий (R. Falk, 1995; J. Guruge, 1998). Ген, кодирующий белок BabA, был клонирован и идентифицирован как babA2. Адгезия H.pylori, как полагают, служит для защиты бактерии от кислой среды желудка, а также от ее возможного смещения (перемещения) вследствие его перистальтики (J. Guruge, 1998).

В настоящее время не все молекулярно-биологические и клинико-диагностические лаборатории имеют возможность культивирования H.pylori. Между тем, определение факторов патогенности H.pylori, выделенных от пациентов, проживающих в различных регионах РФ, и создание генотипической карты может быть определяющим фактором в эпидемиологии и лечении H.pylori-инфекции.

Частота встречаемости vacAs1, cagA, iceA1 и babA2 генотипов в биопсиях и клинических изолятах H.pylori

Клинические изоляты H.pylori и H.pylori, верифицированные непосредственно в биопсийном материале с помощью ПЦР, были проанализированы на одновременное присутствие vacAs1, cagA, iceA1 и babA2 генотипов.

Исследования одновременного присутствия у клинических изолятов H.pylori генотипов vacAs1, cagA, iceA1 и babA2 показали, что при babA2 положительном генотипе H.pylori 12 из 15 изолятов имели vacAs1 генотип (P=0.385), iceA1 положительный генотип имели 14 клинических изолятов H.pylori (P=0.489). При исследованиях биопсийного материала были получены следующие результаты: vacAs1 генотип H.pylori был верифицирован в 31 случае (˜2=4.789, P=0.028), cagA встречался в 34 случаях (˜2=4.134, P=0.042) и iceA1 генотип в 28 случаях (P=0.207).

В клинических изолятах H.pylori распределение генов патогенности было следующим: тип 1 (vacAs1, cagA и babA2) - 50%, тип 2 (vacAs1, cagA, iceA1 и babA2) –46%. При исследовании биопсийного материала, верифицированного на наличие H.pylori, было обнаружено следующее сочетание генов: vacAs1, cagA и babA2 (тип 1) - 36% случаев, а vacAs1, cagA, iceA1 и babA2 (тип2) - 30%.

Значительных отличий между типами H.pylori 1 и 2 при изучении биопсийного материала и между клиническими изолятами H.pylori не наблюдалось. Но при сравнении клинических изолятов H.pylori и H.pylori, верифицированных в биопсийном материале, разброс в распределении типов 1 и 2 H.pylori был достаточно велик (до 20%).

Распределение генотипов H.pylori в биопсиях при различных заболеваниях желудка

Результаты генотипирования H.pylori при ЯБДК и хроническом гастродуодените приведены в Таблице. CagA генотип H.pylori встречался в биопсийном материале, полученном от пациентов как с ЯБДК, так и с хроническим гастродуоденитом (относительное содержание оценивалось только для значимых выборок). Так cagA генотип H.pylori был верифицирован в 92% случаев у пациентов с ЯБДК и в 94% случаев у пациентов с хроническим гастродуоденитом. Однако ˜2 – тест, также как и тест Фишера не выявил каких-либо предпочтительных ассоциаций между cagA и конкретным заболеванием.

Частота встречаемости генотипа H.pylori vacAs1 при ЯБДК и хроническом гастродуодените также не носит значимого характера. Нам не удалось зарегистрировать каких-либо строгих ассоциаций между vacAs1, vacAm1, iceA1 и babA2 генотипами H.pylori и ЯБДК и хроническим гастродуоденитом. Исходя из данных, представленных в Таблице, можно предполагать, что распределение генотипов H.pylori при ЯБДК и хроническим гастродуодените носит скорее всего случайный характер.

Окончательно вопрос о необходимости генотипирования H.pylori в биопсиях возможно решить только после изучения биопсийного материала, полученного от пациентов с хроническим гастритом, ЯБЖ, экстранодальной В-клеточной MALT-лимфомой или аденокарциномой желудка.

Распределение генотипов cagA, vacA, iceA и babA2 H.pylori в Москве и Московской области

В Москве и Московской области VacAs1 генотип H.pylori был верифицирован в 63% случаев при изучении биопсийного материала и в 77% случаев при изучении клинических изолятов H.pylori. 18 штаммов H.pylori, верифицированных в биопсийном материале, и 2 клинических изолята H.pylori имели генотип vacAs2. Интересно, что штаммы H.pylori, имеющие смешанный генотип vacA (s1/s2 или m1/m2), указывающий на присутствие более чем одного штамма Helicobacter pylori, были верифицированы в биопсийном материале в 44 (50%) случаях и в 4-х клинических изолятах H.pylori (30%).

Нами также были выявлены комбинации vacA s- и m- регионов, cagA, iceA и babA2 генотипов H.pylori. Из 18 возможных генотипов H.pylori vacS1, cagA, iceA1 и babA2 генотип встречался в 31% случаев у H.pylori верифицированного в биопсийном материале, и у 54% клинических изолятов H.pylori. Ни одного образца с генотипом vacAs2/m1 нами найдено не было. Неслучайный характер распределения комбинаций генотипов подтверждается ассоциацией отдельных, индивидуальных генотипов cagA, vacA, iceA и babA. СagA положительные H.pylori в биопсиях и клинических изолятах чаще всего имели vacAs1 (p<0.001) и iceA1 (p<0.001) генотипы.

Как видно из данных, представленных в Таблице результаты генотипирования генов патогенности у H.pylori, верифицированного в биопсийном материале и в клинических изолятах, значительно различаются, особенно для vacAm1, babA2 генотипов.

Тем не менее, на имеющемся биологическом материале (биопсии, клинические изоляты) возможно оценить достоверность результатов, полученных при генотипировании H.pylori в биопсиях по отношению к клиническим изолятам (стандарт генотипирования). Так для vacA, cagA и iceA ошибка определения генотипа в биопсиях по сравнению с культурами составляет 10-15%, а для babA2 20-25%. Результаты генотипирования в биопсиях несколько занижены по отношению к культурам, что вероятно связано с сохранностью ДНК H.pylori (некоторая часть ПЦР анализа ДНК из биопсий производилась ретроспективно).

Распределение генотипов cagA, vacA, iceA и babA2 H.pylori в различных регионах Российской Федерации

Анализ клинических изолятов из Москвы и Московской области (n=13), Красноярска (n=3), Уфы (n=3) и Казани (n=5) показал, что распределение cagA положительного генотипа H.pylori не зависит от регионального распределения, поскольку CagA генотип был выявлен во всех клинических изолятах. VacAs1 генотип H.pylori был выявлен в 33% клинических изолятов из Красноярска и в 100% клинических изолятов из Уфы. Приблизительно одинаковое распределение vacAs1 гнотипа H.pylori встречается в Москве - 77% случаев и в Казани - 60% случаев. Интересно, что распределение vacAm1 генотипа H.pylori не имеет региональной специфичности и встречается в 20% клинических изолятов из Казани и в 33% клинических изолятов из Уфы. Нам не удалось выявить смешанных генотипов H.pylori в Уфе, в то время как в Красноярске 33% клинических изолятов соответствовали vacAs1/s2 генотипу. 31-33% клинических изолятов из Москвы и Уфы и 60-67% из Казани и Красноярска соответствовали vacAm1/m2 генотипу. IceA2 генотип был выявлен только в сочетании с iceA1 генотипом (38% клинических изолятов из Москвы и 60% из Казани). Среди клинических изолятов из Красноярска и Уфы данный генотип вообще не встречался. В клинических изолятах из Уфы и Красноярска в 100% случаев присутствовал iceA1 генотип. Этот же генотип в клинических изолятах из Москвы и Казани встречался в 46% и 40% случаев, соответственно. Значительно варьировало распределение babA2 положительного генотипа у клинических изолятов из различных регионов РФ. Так babA2 генотип встречался в 33% клинических изолятов из Уфы и в 100% клинических изолятов из Красноярска. Необходимо также отметить, что распределение babA2 генотипа по регионам РФ имеет ассиметричный характер по отношению к vacAs1 генотипу. Так, если в Красноярске и Уфе vacAs1 генотип встречался в 33% и 100% случаев, то babA2 генотип в 100% и 33%, соответственно. Суммируя приведенные выше результаты, можно предполагать, что распределение генотипов H.pylori в различных регионах РФ носит, скорее всего, не случайный характер.

Частота встречаемости и корреляция в vacA s1, cagA, babA и iceA1 в биопсиях и изолятах H.pylori

Высокоспецифичный тест, выявляющий факт инфицирования H. pylori.

Метод Вестерн-блота для определения антител к H. Pylori, в отличие от обычного ИФА, даёт дифференцированные сведения о наличии антител к целому спектру антигенов возбудителя. Это достигается электрофоретическим разделением белков экстракта H. Pylori. В результате выявляется порядка 15 антигенов (полный антиген), что значительно повышает информативность исследования.

Использующиеся в анализе антигены разделяют на три категории:

  • 1 категория - перекрёстнореагирующие и неопределённые антигены;
  • 2 категория - уреаза В (антиген с м.в. 66 кДа);
  • 3 категория - видоспецифичные и высокоспецифичные антигены.

Данная диагностическая система прямо отличает специфические антигены от неспецифических. Поэтому вестерн-блот метод гарантирует высокую специфичность исследования.

Клинические изоляты H. Pylori можно разделить на 2 типа. Штаммы H. pylori I типа могут экспрессировать специфический вакуолизирующий цитотоксин (VacA) и цитотоксин-ассоциированный белок (CagA). Штаммы, не способные синтезировать этот белок, относят к типу II. Инфекции, вызванные агентом I типа, оказываются более патогенными, клинические симптомы включают гастрит и образование язв, возможны отдалённые последствия в виде злокачественной лимфомы и аденокарциномы желудка. Указанные белки входят в состав специфических антигенов, используемых для тестирования антител к H. Pylori методом иммуноблота, что также даёт дополнительную информацию для специалистов.

Состав используемых для выявления антител к H. Pylori специфических антигенов:

АНТИГЕНСПЕЦИФИЧНОСТЬ
CagA p120белок, ассоциированный с цитотоксином А, высокоспецифичен
VacA p95вакуолизирующий цитотоксин А, высокоспецифичен
p75неспецифичен
FSH p57белок жгутиковых, неспецифичен, обуславливает перекрёстную реактивность с другими бактериями, содержащими уреазу
Ure B p66тяжёлая субъединица уреазы, обуславливает перекрёстную реактивность с другими бактериями, содержащими уреазу
гомолог HSP p57гомолог белка теплового шока, неспецифичен
флагеллин p54неспецифичен, обуславливает перекрёстную реактивность с другими бактериями, содержащими флагеллин
p50неспецифичен
p41неспецифичен
p33предположительно специфичен
CMP p30Белок наружной мембраны, видоспецифичен
UreA p29лёгкая субъединица уреазы, высокоспецифичен
p26высокоспецифичен
CMP p19белок наружной мембраны, видоспецифичен
p17предположительно специфичен

Антитела класса IgG появляются в крови вслед за IgM антителами (которые впоследствии исчезают через несколько недель после первого контакта с возбудителем инфекции). Инфекция H. Pylori обычно не проходит сама по себе, патологический агент может присутствовать в течение всей жизни человека. IgG выявляются в сыворотке крови многие годы, являясь индикатором инфицирования. Отсутствие специфических IgG позволяет с высокой степенью достоверности отвергнуть диагноз H. pylori-ассоциированного гастрита или язвы, хотя их присутствие не является абсолютным доказательством данного заболевания.

Специальная подготовка не требуется. Рекомендуется взятие крови не ранее чем через 4 часа после последнего приема пищи. С общими рекомендациями для подготовки к исследованиям можно ознакомиться здесь >>.

Высокоспецифичный тест диагностики и мониторирования H. pyloi - ассоциированного гастрита и язвенной болезни желудка и 12-перстной кишки.

Метод Вестерн-блота для определения антител к H. Pylori, в отличие от обычного ИФА, даёт дифференцированные сведения о наличии антител к целому спектру антигенов возбудителя. Это достигается электрофоретическим разделением белков экстракта H. Pylori. В результате выявляется порядка 15 антигенов (полный антиген), что значительно повышает информативность исследования.

Использующиеся в анализе антигены разделяют на три категории:

  • 1 категория - перекрёстнореагирующие и неопределённые антигены;
  • 2 категория - уреаза В (антиген с м.в. 66 кДа);
  • 3 категория - видоспецифичные и высокоспецифичные антигены.

Данная диагностическая система прямо отличает специфические антигены от неспецифических. Поэтому вестерн-блот метод гарантирует высокую специфичность исследования.

Клинические изоляты H. Pylori можно разделить на 2 типа. Штаммы H. pylori I типа могут экспрессировать специфический вакуолизирующий цитотоксин (VacA) и цитотоксин-ассоциированный белок (CagA). Штаммы, не способные синтезировать этот белок, относят к типу II. Инфекции, вызванные агентом I типа, оказываются более патогенными, клинические симптомы включают гастрит и образование язв, возможны отдалённые последствия в виде злокачественной лимфомы и аденокарциномы желудка. Указанные белки входят в состав специфических антигенов, используемых для тестирования антител к H. Pylori методом иммуноблота, что также даёт дополнительную информацию для специалистов.

Состав используемых для выявления антител к H. Pylori специфических антигенов:

АНТИГЕНСПЕЦИФИЧНОСТЬ
CagA p120белок, ассоциированный с цитотоксином А, высокоспецифичен
VacA p95вакуолизирующий цитотоксин А, высокоспецифичен
p75неспецифичен
FSH p57белок жгутиковых, неспецифичен, обуславливает перекрёстную реактивность с другими бактериями, содержащими уреазу
Ure B p66тяжёлая субъединица уреазы, обуславливает перекрёстную реактивность с другими бактериями, содержащими уреазу
гомолог HSP p57гомолог белка теплового шока, неспецифичен
флагеллин p54неспецифичен, обуславливает перекрёстную реактивность с другими бактериями, содержащими флагеллин
p50неспецифичен
p41неспецифичен
p33предположительно специфичен
CMP p30Белок наружной мембраны, видоспецифичен
UreA p29лёгкая субъединица уреазы, высокоспецифичен
p26высокоспецифичен
CMP p19белок наружной мембраны, видоспецифичен
p17предположительно специфичен

Антитела класса IgA появляются спустя некоторое время после контакта с H. Pylori. Этот тип антител (секреторные антитела), характерен больше для слизистых оболочек, где они образуются локально и обеспечивают местную защиту. IgA не всегда обнаруживаются в крови. Положительные результаты по IgA к H. Pylori хорошо коррелируют с активностью гастрита, считается, что повышенный титр IgA может выполнять роль маркёра хронической инфекции.

Специальная подготовка не требуется. Рекомендуется взятие крови не ранее чем через 4 часа после последнего приема пищи. С общими рекомендациями для подготовки к исследованиям можно ознакомиться здесь >>.

Антитела класса IgG появляются в крови вслед за IgM антителами (которые впоследствии исчезают через несколько недель после первого контакта с возбудителем инфекции). Инфекция H. Pylori обычно не проходит сама по себе, патологический агент может присутствовать в течение всей жизни человека. IgG выявляются в сыворотке крови многие годы, являясь индикатором инфицирования.Отсутствие специфических IgG позволяет с высокой степенью достоверности отвергнуть диагноз ассоциированного гастрита или язвы, хотя их присутствие не является абсолютным доказательством данного заболевания. Определение специфичности IgG антител к различным антигенам Helicobacter pylori методом иммуноблота является хорошим инструментом для выявления штаммов с высокой патогенностью, что важно для оценки прогноза заболевания и решения вопроса о необходимости назначения лечения. .Все изоляты Helicobacter pylori можно разделить на два типа спиралевидные (инфекционная форма) – I тип и кокковидная (долгоживущая форма) – тип II. Штаммы Helicobacter pylori I типа могут экспрессировать вакуолизирующий цитотоксин (VacA) и цитотоксин-ассоциированный белок (CagA). Штаммы II типа такой способностью не обладают. Антигены VacA и CagA обуславливают цитотоксичность штамма бактерии, поэтому именно штаммы I типа обладают более высокой патогенностью и вызывают гастриты с образованием язв и отдалённые последствия в виде злокачественных лимфом и аденокарцином. Вот почему помимо количественного определения антител класса IgG важно выяснить и их специфичность в отношении антигенов VacA и CagA. При обнаружении антител с такой специфичностью делается вывод о высокой патогенности персистирующего у пациента штамма Helicobacter pylori. Откладывание начала терапии в такой ситуации считается нецелесообразным независимо от клинических данных, результатов Гастропанели и гастроскопии. Возможность такого исследования даёт только технология иммуноблотинга..

Подозрение на H. pylori ассоциированный гастрит или язву (диспепсия, боли в верхней части живота).

Мониторинг течения и терапии заболевания

html:Специальная подготовка не требуется.

Забор крови для исследования производят не ранее чем через 2 часа после приема пищи.

Перед исследованием (за 1 час) желательно исключить факторы, влияющие на результаты лабораторного исследования: физическое и эмоциональное напряжение, курение.

Рекомендуется за 1-2 дня до предполагаемого исследования не употреблять жирную пищу и алкоголь.

При приеме лекарственных препаратов следует проконсультироваться с врачом по поводу целесообразности проведения исследования на фоне приема препаратов или возможности отмены приема препарата. Длительность отмены препарата определена периодом выведения препарата из крови (в среднем, рекомендуют выждать 4-5 периодов полувыведения препарата, указанного в аннотации).

Если отменить прием лекарств нельзя, необходимо проинформировать об этом лабораторию.

Детей до 5 лет перед забором крови обязательно поить кипяченой водой (порциями, до 150-200 ml, на протяжении 30 минут)

Внимание!

Метод Вестернблота для определения антител к H. Pylori, в отличие от обычного ИФА, даёт дифференцированные сведения о наличии антител к целому спектру антигенов возбудителя. Это достигается электрофоретическим разделением белков экстракта H. Pylori. В результате выявляетсяо прядка 15 антигенов (полный антиген), что значительно повышает информативность исследования Данная диагностическая система прямо отличает специфические антигены от неспецифических.Поэтому вестернблот метод гарантирует высокую специфичность исследования Антитела класса IgA появляются спустя некоторое время после контакта с H. Pylori. Этот тип антител (секреторные антитела), характерен больше для слизистых оболочек, где они образуются локально и обеспечивают местную защиту. IgA не всегда обнаруживаются в крови. Положительные результаты по IgA к H. Pylori хорошо коррелируют с активностью гастрита, считается, что повышенный титр IgA может выполнять роль маркёра хронической инфекции.

Подозрение на H. pylori ассоциированный гастрит или язву (диспепсия, боли в верхней части живота).

Мониторинг течения и терапии заболевания

html:Специальная подготовка не требуется.

Забор крови для исследования производят не ранее чем через 2 часа после приема пищи.

Перед исследованием (за 1 час) желательно исключить факторы, влияющие на результаты лабораторного исследования: физическое и эмоциональное напряжение, курение.

Рекомендуется за 1-2 дня до предполагаемого исследования не употреблять жирную пищу и алкоголь.

При приеме лекарственных препаратов следует проконсультироваться с врачом по поводу целесообразности проведения исследования на фоне приема препаратов или возможности отмены приема препарата. Длительность отмены препарата определена периодом выведения препарата из крови (в среднем, рекомендуют выждать 4-5 периодов полувыведения препарата, указанного в аннотации).

Если отменить прием лекарств нельзя, необходимо проинформировать об этом лабораторию.

Детей до 5 лет перед забором крови обязательно поить кипяченой водой (порциями, до 150-200 ml, на протяжении 30 минут)

Внимание!

Читайте также: