Гонококк окраска по леффлеру

Обновлено: 24.04.2024

При заборе соскоба или мазка из уретры специальной щеточкой, зондом берется биоматериал (слизь, отделяемое) для его последующего изучения в микроскоп. Если полученный от пациента материал наносится на предметное стекло без изменений, то такой препарат называют нативным.

Иногда его закрепляют и окрашивают, для этого чаще всего используется окраска по Граму или метиленовый синий. Окрашивание облегчает визуализацию в микроскоп гонококков, трихомонад, лейкоцитов, эпителиальных клеток.

Однако, отделяемое уретры не всегда наносят на стекло. Для диагностики таких ЗППП, как генитальный герпес, хламидиоз, микоплазмоз, такой способ не подходит.

В этом случае материал вносится в пробирку, пробирка закрывается и доставляется в лабораторию для проведения ПЦР. У мужчин с симптомами заболеваний мочеполовых органов обычно выполняют оба вида исследований: и ПЦР, и обычную микроскопию.

1. Показания к забору материала

Показаниями для взятия соскоба и урогенитального мазка из уретры у мужчин являются:

1 Болезненное мочеиспускание.
2 Учащение мочеиспускания.
3 Наличие слизистых, слизисто-гнойных или творожистых выделений (слизь, гной, серозный выпот).
4 Покраснение, отек тканей вокруг уретры и другие симптомы уретрита.
5 Сыпь на головке и крайней плоти полового члена.
6 Отек, покраснение и другие признаки воспаления головки полового члена и крайней плоти (баланит, баланопостит, постит).
7 Отек и другие признаки воспаления яичек и их придатков, семенных пузырьков.
8 Увеличение паховых лимфоузлов.
9 Отсутствие симптомов у мужчины, но наличие вышеперечисленных симптомов ЗППП у полового партнера. Нередко у мужчин ИППП протекают бессимптомно, в то время как женщина имеет ярко-выраженную симптоматику.
10 Ежегодный скрининг и диспансеризация половых инфекций рекомендуются каждому молодому мужчине, имеющему более 1 партнера/год, даже при использовании презервативов.
11 Бесплодие в паре, прерывание беременности на любых сроках у женщины в паре.
12 Подготовка женщины к предстоящей беременности также может быть показанием для диагностики ЗППП у будущего отца.

Нередко у мужчин половые инфекции протекают бессимптомно, но приводят к развитию заболевания у женщины.

Пациенту необходимо понимать, что на точность результата влияет множество условий: правильная подготовка больного к исследованию, техника забора материала и приготовления мазка, сроки и условия транспортировки материала в лабораторию.

2. Подготовка к сдаче анализа

Важно правильно подготовиться к взятию мазка:

Рисунок 1 – Направление на микроскопическое исследование отделяемого из уретры у мужчин

3. Как берется соскоб из уретры?

Процедура приготовления препарата представляет собой нанесение полученного с поверхности слизистой уретры отделяемого на предметное стекло. Для более детального исследования под микроскопом мазок может быть окрашен специальными красителями.

1 Как правило, забор материала для мазка осуществляется в положении стоя, с приспущенным бельем.
2 При помощи салфетки удаляется слизь с наружного отверстия уретры, в отверстие вводится специальная щетка, зонд для соскоба со слизистой.
3 При отсутствии выделений пациента просят помассировать мочеиспускательный канал от основания полового члена до головки.
4 Щеточка вводится вглубь уретры на 2 см. Не стоит выполнять вращающие движения зондом, так как данная манипуляция сопровождается выраженными болевыми ощущениями.
5 Полученный материал наносится на предметные стекла и маркируется.
6 Для выявления подвижных трихомонад готовится нативный препарат: к нанесенному на предметное стекло материалу добавляется физраствор (37°С). Данный метод применим при наличии у мужчины обильных выделений из мочеиспускательного канала.
7 Для последующей микроскопии в лаборатории стекла должны высушиваться на воздухе и маркироваться. При отсроченном исследовании может выполняться фиксация полученного биоматериала на стекле.

Современные лаборатории предлагают проведение комплексного исследования отделяемого из уретры: микроскопия простого мазка в сочетании с бакпосевом и определением ДНК наиболее частых возбудителей половых инфекций при помощи ПЦР.

Возбудители
Chlamydia trachomatis
Mycoplasma hominis
Mycoplasma genitalium
Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum
Neisseria gonorrhoae
Trichomonas vaginalis
Gardnerella vaginalis
Candida albicans
Герпес-вирус человека 1 и 2 типа
Вирусы папилломы человека высокоонкогенные (16,18 и др.) и низкоонкогенные (6,11 и др.)

Таблица 1. Возбудители, определяемые методом ПЦР с использованием тест-систем

4. Болезненность процедуры

Забор отделяемого для микроскопии мазка и ПЦР сопровождается режущими болями в области мочеиспускательного канала. После взятия материала боль проходит в течение нескольких минут. Рези и жжение в уретре могут появляться в начале мочеиспускания в течение нескольких часов после процедуры.

Прием Канефрона, Цистона, Фитолизина или урологических сборов, обильное питье компотов и морсов помогут облегчить неприятные симптомы. Лучше отказаться от пряностей, алкоголя, копченостей на 2-3 дня, тогда продукты метаболизма в выделяемой моче не будут сильно раздражать поврежденную слизистую оболочку уретры.

5. Нормальные результаты

Следует отметить, что наиболее правильную расшифровку полученных результатов мазка на флору может выполнить врач-уролог.

Таблица 2 - Нормальные показатели при микроскопии мазка на флору у мужчин

1 Эпителий. В норме в общем мазке определяется небольшое количество эпителия мочеиспускательного канала (плоский, реже цилиндрический, количество клеток эпителия не более 5-10 в поле зрения). Обнаружение клеток переходного эпителия наблюдается при простатите и воспалении простатической части уретры. Превышение нормальных значений наблюдается при остром и хроническом воспалительном процессе.
2 Уровень лейкоцитов менее 4-5 в поле зрения свидетельствует об отсутствии воспалительного процесса. Повышение уровня лейкоцитов указывает на воспалительный процесс в урогенитальном тракте и требует более глубокого обследования пациента (ПЦР).
3 Слизь. Большое количество слизи в общем мазке (++ или +++) наблюдается при воспалении.
4 Микрофлора. Большая часть микроорганизмов, попадающих на слизистые уретры, удаляется с током мочи. Организмы, которые смогли прикрепиться к эпителию, размножиться в окружающих условиях, являются микрофлорой уретры. Развитие инфекционного процесса сопровождается воспалительным ответом и повышением числа лейкоцитов в мазке. У мужчин на слизистой уретры в норме могут определяться S. epidermidis, Streptococcus spp., Corynebacterium spp. в небольшом количестве. Нормальная микрофлора очень чувствительна к местным и общим изменениям в организме.
5 Трихомонады и гонококки в норме не должны быть обнаружены при микроскопии. Их обнаружение свидетельствует о трихомониазе и гонорее.
6 В норме может определяться малое количество внеклеточных диплококков, уточнение их вида производится с помощью ПЦР.
7 Грибы рода Candida не должны обнаруживаться при микроскопии.
8 Ключевые клетки и гарднереллы в общем мазке визуализируются при гарднереллезе (баквагинозе).

6. Уретрит

Диагноз "уретрит" подтверждается при выявлении 4 и более лейкоцитов в поле зрения микроскопа.

Микроскопия мазка из уретры позволяет диагностировать воспалительный процесс в мочеиспускательном канале, оценить количество и вид эпителиальных клеток, а также определить патогенные микроорганизмы (гонококки и трихомонады).

При наличии патологических изменений и отклонений от нормальных значений мужчине назначаются дополнительные методы лабораторной диагностики (чаще ПЦР, реже бакпосев).

7. Мазок из уретры в диагностике ИППП

7.1. Гонорея

Возбудители гонореи – Neisseria gonorrhoeae (гонококки Нейссера), бобовидные кокки, расположенные попарно, вогнутыми сторонами друг к другу.

Гонококки выявляются при:

Микроскопии окрашенного препарата (окраска по Граму, окраска метиленовым синим). Результат может быть положительным (обнаружены) или отрицательным (не обнаружены).
ПЦР. Результат ПЦР может быть положительным или отрицательным.
Бакпосеве (посев на шоколадный агар). Метод используется для постановки диагноза у детей вне зависимости от результатов микроскопии, при выявлении грамотрицательных диплококков в мазке и отсутствии клинических проявлений.

Гонококковый уретрит подтверждается при следующих результатах:

1 Отсутствие/снижение уровня нормальной микрофлоры.
2 Повышение числа полиморфноядерных, не разрушенных лейкоцитов (более 4-5).
3 Выявление внутриклеточных диплококков (располагаются внутри фагоцитов).
4 Выявление внеклеточных диплококков.

7.2. Трихомониаз

Возбудитель – влагалищная трихомонада, Trichomonas vaginalis, простейшее. Для обнаружения трихомонад необходимо исследовать свежесобранный материал из уретры.

Для подтверждения трихомониаза у мужчин используются:

7.3. Хламидиоз

Хламидии трахоматис плохо видны в обычный микроскоп, поэтому материал, полученный при соскобе из уретры, исследуется методом ПЦР. Информативность и достоверность такого анализа при правильной подготовке (см. выше) очень высоки.

При хламидиозе и хламидийном уретрите возможны следующие результаты:

1 При изучении простого мазка в микроскоп выявляется увеличение количества лейкоцитов (4 и более в поле зрения).
2 Количество эпителиальных клеток может быть увеличено или в пределах нормы.
3 При ПЦР - ДНК хламидий трахоматис обнаружены.

7.4. Генитальный герпес

Исследование на генитальный герпес проводится в условиях специализированной лаборатории. Микроскопия с применением обычных методов окрашивания препаратов не применима ввиду низкой чувствительности и специфичности. Основные методы диагностики – иммунолюминесцентный (РИФ), молекулярно-генетический (ПЦР) методы.

7.5. Папилломавирусная инфекция

В лабораторной диагностике ВПЧ применяют исключительно молекулярно-биологические методы (ПЦР). Микроскопия препаратов, окрашенных по Папаниколау, характеризуется низкой чувствительностью.

Характерные цитологические признаки ВПЧ: наличие койлоцитов (клетки с неоднородными гиперхромными ядрами, перинуклеарно определяется более светлый ободок цитоплазмы), потеря ядер. Описанные морфологические изменения клеток должны быть подтверждены молекулярно-биологическими методами (ПЦР).

8. Неспецифический уретрит

Если у мужчины по результатам микроскопии наблюдается воспалительный процесс, но возбудители ИППП (гонококки, хламидии, микоплазмы, уреаплазмы, трихомонады и др.) не обнаружены, то говорят о неспецифическом уретрите.

В основе развития данной формы уретрита лежат факультативные и анаэробные бактерии (стафилококки, стрептококки, Enterobacteriae), гарднереллы, грибки кандиды.

Диагноз неспецифического уретрита – диагноз исключения, который ставится после отрицательных результатов на половые инфекции как у пациента, так и у его полового партнера - женщины.

1 Более 4-5 лейкоцитов в поле зрения микроскопа (увеличение ×1000), в не менее, чем 5 полях зрения.
2 При хроническом неспецифическом уретрите в мазке на флору определяются преимущественно лимфоциты.

9. Что делать после получения результатов?

Нередко пациенты с симптомами ИППП используют в качестве основного источника информации Рунет, находят платные лаборатории, в которых можно пройти обследование без направления врача.

ГКБ № 14 им. В.Г. Короленко, Москва

Лабораторная диагностика гонореи: проблемы и пути их решения

Журнал: Клиническая дерматология и венерология. 2014;12(4): 10‑17

Сюч Н.И. Лабораторная диагностика гонореи: проблемы и пути их решения. Клиническая дерматология и венерология. 2014;12(4):10‑17.
Siuch NI. Laboratory diagnosis of gonorrhea: problems and solutions. Klinicheskaya Dermatologiya i Venerologiya. 2014;12(4):10‑17. (In Russ.).

ГКБ № 14 им. В.Г. Короленко, Москва

Гонорея - передаваемое половым путем инфекционное заболевание, вызванное гонококком (Neisseria gonorrhoeae). Род Neisseria представлен несколькими видами: N. canis, N. cinerea, N. denitrificans, N. elongate, N. flavescens, N. gonorrhoeae, N. lactamica, N. macacae, N. meningitides, N. mucosa, N. polysaccharea, N. sicca, N. subflava. Из перечисленных видов только два являются патогенными для человека - N. gonorrhoeae и N. meningitides. Другие представители рода относятся к группе условно-патогенных аэробных и факультативных анаэробных микроорганизмов, возбудителей гнойно-септических и оппортунистических заболеваний. Большинство нейссерий являются комменсалами, обитающими в ротоглотке и носоглотке. Neisseria spp. - нормальная микрофлора уретры, полости рта и ротоглотки, а также носа и кожи. В перечень лабораторных исследований при подозрении на гонококковую инфекцию включены микроскопия окрашенных препаратов и культуральное исследование. Непонимание возможностей метода световой микроскопии - причина конфликта между клиницистами и врачами лаборатории. При световой микроскопии препаратов из урогенитального тракта пациентов с подозрением на гонококковую инфекцию исследователь определяет морфологические характеристики возбудителя и его грам-принадлежность, что позволяет ему предположить наличие гонококковой инфекции, но не констатировать ее. Для видовой идентификации N. gonorrhoeae необходимо культуральное исследование.

ГКБ № 14 им. В.Г. Короленко, Москва

Гонорея - передаваемое половым путем инфекционное заболевание, вызванное гонококком (Neisseria gonorrhoeae). По данным ВОЗ [1, 2], ежегодно в мире регистрируют до 200 млн вновь заболевших гонореей. В России после некоторого снижения заболеваемости в 90-е годы ХХ столетия вновь отмечено увеличение количества больных до 102,2 на 100 тыс. населения [3]. Высокие темпы роста заболеваемости гонореей одновременно были отмечены в Эстонии, Болгарии, Чехии и ряде других стран. По данным литературы [4], в 2009 г. заболеваемость в странах, ведущих регистрацию гонореи, составила: в РФ - 48,1 на 100 тыс. населения, в США - 106 на 100 тыс. населения, в странах ЕС - 9,7 (от 27,6 в Великобритании до 1,0 в Греции) на 100 тыс. населения. В США в год официально регистрируют около 300–350 тыс. новых случаев заболевания[5].

Биоматериалом для лабораторного обследования на гонококковую инфекцию является отделяемое из уретры, влагалища, шейки матки, из прямой кишки, глаз, глотки, секрет предстательной железы, моча, кровь. Прием антибиотиков и местные процедуры прекращают за 10 дней до взятия материала на исследование. У женщин рекомендуется брать материал перед менструацией. Перед взятием материала необходимо воздержаться от мочеиспускания в течение 3-4 ч и половых отношений, а также туалета наружных половых органов и спринцевания. Исследуемый материал не должен содержать примесей крови [8] .

Оптимальным с точки зрения клинициста в лабораторной диагностике гонореи является использование простых отборочных тестов. Метод световой микроскопии наиболее удовлетворяет этим требованиям: клиницистов по причине оперативности получения результата, врачей клинической лабораторной диагностики благодаря простоте выполнения, а больных - из-за доступной стоимости. При этом не учитывается низкая чувствительность метода для биоматериала из цервикального канала (фарингиальные и ректальные пробы не используют для микроскопического исследования), а также в случаях ранней диагностики гонореи, бессимптомной инфекции и для некоторых вариантов гонококков.

Для диагностики гонококковой инфекции применяется несколько вариантов окраски препаратов для световой микроскопии: метиленовым синим (обзорный препарат позволяет выявить признаки воспаления и описать морфотипы бактерий) и по методу Грама, для определения грам-принадлежности диплококков. Дополнительно к классическим методам окраски при подозрении на гонококковую инфекцию согласно приказу МЗ СССР №936 от 12.07.85 используют окраску эозином с метиленовым синим (для выявления наряду с диплококками, морфологически сходными с гонококками, трихомонад и эозинофилов), а также бриллиантовым зеленым (для выявления трихомонад).

При световой микроскопии все виды рода Neisseria обладают одинаковыми морфологическими характеристиками: форма клеток - кокки, расположение клеток парами (кроме N. elongate, представленной в виде коротких цепочек, часто диплобацилл). Диплококки, морфологически сходные с гонококками, определяются в виде парных кокков, имеющих форму кофейных зерен, обращенных друг к другу вогнутыми сторонами, негативных при окраске по методу Грама. Диплококки располагаются внутриклеточно (внутри сегментоядерных лейкоцитов), в слизи, на эпителиальных клетках. Внутри лейкоцита - парами, группами, под разными углами друг к другу, а на эпителиальных клетках (внеклеточно) - в большом количестве рядами, перпендикулярно друг к другу внутри ряда (рис. 2). Рисунок 2. Грамотрицательные диплококки, морфологически сходные с гонококками, расположенные внеклеточно (ув. ×1000).

Нередко в представлении врачей клинической лабораторной диагностики существует уверенность в том, что морфологическими признаками гонококковой инфекции является исключительно внутриклеточное расположение грамотрицательных диплококков. Так ли это? По данным литературы [9], для возбудителя гонореи характерно внутриклеточное расположение возбудителей в сегментоядерных лейкоцитах на всех стадиях болезни. В период первых клинических проявлений при наличии скудного слизисто-гнойного отделяемого гонококки обнаруживаются преимущественно на поверхности эпителиальных клеток в виде кокков, реже - тетракокков. В разгар заболевания, при обильном гнойном отделяемом, внутриклеточные диплококки доминируют. По мере снижения остроты процесса число внутриклеточных гонококков уменьшается и увеличивается их количество на поверхности эпителиальных клеток. Частота внутри- и внеклеточно расположенных гонококков зависит от периода заболевания. Характерным для гонореи является незавершенная фагоцитарная реакция, при которой микроорганизмы находят благоприятные условия для внутриклеточной персистенции. Кроме полинуклеаров, в фагоцитозе принимают участие макрофаги, эпителиальные клетки, а также лимфоциты. Последние обладают миграционным циклом и способствуют генерализации инфекции.

Следовательно, при световой микроскопии препаратов урогенитального тракта пациентов с подозрением на гонококковую инфекцию исследователь определяет морфологические характеристики возбудителя и его грам-принадлежность, что позволяет предположить наличие гонококковой инфекции, но не констатировать ее. Только три признака - форма (диплококки в форме кофейного зерна), локализация (преимущественно внутри лейкоцитов и на эпителиальных клетках), грам-принадлежность - позволяют предположить наличие гонококковой инфекции [10].

По данным литературы [11], чувствительность метода микроскопии препаратов отделяемого из уретры мужчин при окраске по Граму колеблется от 50 до 75% при бессимптомной инфекции - до 95% при выраженных проявлениях; у женщин - от 20% для материала из уретры до 37-50% для материала из половых путей. Чувствительность первичной микроскопии повышается до 97,3%, а специфичность - до 99,6 % при использовании комбинации метиленового синего и генцианового фиолетового, но только в отношении материала, полученного от мужчин [12]. Для снижения вероятности ложных результатов рекомендуют проведение повторной микроскопии. Микроскопия не рекомендована для материала из ротоглотки. Также метод имеет низкую чувствительность при исследовании ректальных мазков, полученных от женщин без проявления инфекции.

По данным Федеральной системы внешней оценки качества, за период с 2007 по 2010 г. ложноположительные результаты при выявлении возбудителей гонореи в препаратах отделяемого слизистой оболочки урогенитального тракта методом микроскопии наблюдались в 5,7% случаев, ложноотрицательные - в 0,5%. Причинами ошибок на аналитическом этапе являются неудовлетворительное качество мазков (43,4%), связанное с ошибками при фиксации препаратов, неравномерностью их окраски, наличием толстых участков с непрокрашенными клетками, недо- или переобесцвечиванием, а также нарушение методологии, когда часть лабораторий окрашивает препараты только метиленовым синим, хотя данный вид окрашивания не позволяет провести дифференциацию микроорганизмов по тинкториальным свойствам [13].

Согласно лабораторным критериям диагноза гонореи, принятым Европейским союзом (2002 г.), помимо обнаружения грам-отрицательных внутриклеточных диплококков в мазках из уретры мужчин, для постановки диагноза гонореи необходимо выделить N. gonorrhoeae и выявить антиген или нуклеиновую кислоту N. gonorrhoeae в клинических образцах. Для этого применяют культуральное исследование, включающее выделение и идентификацию гонококков в чистых культурах на специальных средах с обязательным проведением цитохромоксидазного теста, изучением сахаролитических свойств возбудителя, определением бета-лактамазной активности и чувствительности к антибиотикам, а согласно клиническим рекомендациям 2012 г., еще и МБМ. При исследовании выросших культур в мазках, окрашенных по модифицированному способу Грама, в случае правильной окраски в центре скоплений из оранжево-красных микроорганизмов наблюдаются группы кокков или отдельные участки мазков, окрашенные в фиолетовый цвет. Необходимо учитывать морфологию, расположение и окраску гонококков. Они представляют собой, главным образом, не парные, а отдельные кокки, собранные в скопления с более плотным центром и как бы беспорядочно рассыпанные по периферии. Наряду с интенсивно окрашенными в оранжево-красный цвет кокками встречаются бледно окрашенные формы, а также особи неправильных округлых очертаний. Полиморфизм гонококков увеличивается по мере старения культуры. Гонококки не образуют в культуре цепочек и гроздей, что свойственно стрептококкам и стафилококкам.

В процессе роста гонококки вырабатывают фермент - цитохромную оксидазу. Колонии гонококка окрашиваются в розовый, а затем в красный цвет и черный цвет уже через несколько минут после воздействия диметилпарафенилендиамина. Окраска происходит даже в тех случаях, когда колонии гонококка находятся под колониями других микроорганизмов.

Гонококковые колонии всегда оксидазоположительные, но оксидазоположительными могут быть и другие бактерии, вырабатывающие в процессе своей жизнедеятельности цитохромную оксидазу. Поэтому такие колонии микроорганизмов обязательно нужно исследовать при окраске по модифицированному способу Грама.

Ошибками на аналитическом этапе при культуральном исследовании являются: сокращение алгоритма идентификации гонококков до определения оксидазной активности и окраски по Граму, а также ферментация глюкозы до кислоты. Несмотря на то что по ряду причин чувствительность однократного посева может не достигать 40%, в России однократный отрицательный ответ при микроскопии и посеве нередко служит основанием для выдачи окончательного отрицательного ответа.

При культуральной диагностике гонококковой инфекции затруднения возникают на этапе выделения штаммов, слабо ферментирующих глюкозу, а также сахарозоотрицательных штаммов N. subflava, N. meningitidis и глюкозоположительных штаммов N. cinerea. Поскольку непатогенные нейссерии, такие как N. cinerea, N. sicca, N. subflava, N. mucosa, напоминают рост N. gonorrhoeae, использование хромогенных сред не помогает в дифференциальной диагностике. Некоторые штаммы N. gonorrhoeae (они получили название ауксотипов), нуждаются в дополнительных веществах при культивировании на питательных средах. На сегодняшний день их известно около 30. Самым распространенным является ауксотип AHU, так как ему требуется аргинин, гипоксантин и урацил. Этот тип характеризуется высокой чувствительностью к пенициллину и часто бывает причиной бессимптомного инфицирования мужчин [6].

Рекомендуемые для диагностики гонореи молекулярно-биологические методы (КР-2012) также имеют ряд ограничений: полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для детекции ДНК или рРНК нельзя использовать при исследовании материала из зева и прямой кишки, а также для постановки диагноза у детей и контроля лечения; ложноотрицательный результат дают штаммы с продукцией β-лактамаз. Описаны случаи ложноположительного результата при тестировании образцов, содержащих N. subflava [14].

Тест амплификации нуклеиновых кислот (АНК) превосходит по чувствительности ПЦР и характеризуется одинаково высокой чувствительностью (более 96%) как при наличии симптомов, так и при бессимптомном течении инфекции у мужчин и у женщин [15]. Метод АНК используют для поиска возбудителя, в том числе и в моче, преимущественно у мужчин. Кроме того, доказана его эффективность для одновременной детекции гонококков и хламидий. Для исключения ложноотрицательных результатов из-за присутствия в материале ингибиторов амплификации требуется постановка контролей. Положительный результат теста в экстрагенитальном материале при низком уровне заболеваемости гонореей на территории требует подтверждения другим методом.

Анализ результатов культурального исследования отделяемого урогенитального тракта и материала из зева у пациентов Городской клинической больницы №14 им. В.Г. Короленко за 7 лет показал, что из 18 образцов, в которых были выявлены нейссерии, патогенные штаммы N. gonorrhoeae идентифицированы в 10 случаях (локализация: уретра - 5, цервикальный канал - 2, влагалище - 2, зев - 1), N. menengitidis - в 2 случаях (локализация в уретре). Непатогенные виды нейссерий выявлены в 6 случаях: N. mucosa - 1 (уретра), N. perflava - 3 (уретра), N. flava - 1 (влагалище), N. elongate - 1 (уретра). Следовательно, метод световой микроскопии препаратов, окрашенных по Граму, не может быть использован в качестве единственного для диагностики гонореи, поскольку не дает видовой идентификации микроорганизма.

Данных анамнеза, клинической картины и положительных результатов микроскопии достаточно для установления диагноза гонореи только у мужчин с клиническими симптомами уретрита (Рекомендации Европейского союза, 2002). При исследовании биоматериала от женщин, детей, в случаях сексуального насилия, при исследовании материала из ротоглотки, конъюнктивы, прямой кишки необходимо проведение бактериологического исследования для идентификации N. gonorrhoeae.

Лабораторные критерии диагноза гонореи, принятые Европейским союзом (2002), включают обнаружение грамотрицательных внутриклеточных диплококков в мазках из уретры мужчин, выделение N. gonorrhoeae из клинического образца, выявление антигена или нуклеиновой кислоты N. gonorrhoeae. В случае обнаружения грамотрицательных диплококков препараты сохраняют в течение 3 мес.

Поскольку не существует тестов со 100% чувствительностью и специфичностью, для диагностики гонококковой инфекции необходимо проведение комплексного лабораторного обследования пациентов. Учитывая, что большинство лабораторий используют только бактериоскопию, качество диагностики гонореи находится на низком уровне.

Выводы

1. Для массового скрининга на гонорейную инфекцию на сегодняшний день оптимально использование комбинации лабораторных методов: микроскопии материала с окраской по Граму и культурального исследования при условии проведения внутрилабораторного контроля качества.

2. Световая микроскопия позволяет только предположить наличие Neisseria spp. в исследуемом образце, но не позволяет провести видовую идентификацию N. gonorrhoeae.

3. Выявление диплококков, морфологически сходных с гонококками при световой микроскопии, в сочетании с данными анамнеза и клинической картиной позволяет диагностировать гонорею при наличии клинических симптомов уретрита только у мужчин.

4. Видовая идентификация N. gonorrhoeae возможна только при бактериологическом и молекулярно-биологическом исследовании.

ФГБУ "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии";
Медицинский факультет Санкт-Петербургского университета

Санкт-Петербургскогий государственный университет, Санкт-Петербург, Россия

Санкт-Петербургский НИИ фтизиопульмонологии

Информативность различных методов идентификации кислотоустойчивых микобактерий в зависимости от степени активности туберкулезного процесса

Журнал: Архив патологии. 2018;80(3): 40‑45

Окраска карболовым фуксином по Цилю—Нильсену является основным используемым с конца XIX века методом выявления микобактерий туберкулеза в тканях. При этом количество микобактерий часто не соответствует активности инфекционного процесса как по клиническим, так и по морфологическим данным. Цель исследования — выявление морфологических особенностей микобактерий туберкулеза у пациентов с длительно протекающим туберкулезом. Материал и методы. Изучены 24 случая аутопсии верифицированного фиброзно-кавернозного туберкулеза. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином, карболовым фуксином по Цилю—Нильсену, аурамин-родамином (с последующим исследованием с помощью люминесцентного микроскопа), проводили иммуногистохимическое (ИГХ) исследование с сывороткой к РАВ (Protein antigen B). Результаты и обсуждение. Во всех наблюдениях выявлены характерные для прогрессирующего туберкулеза изменения. При окраске по Цилю—Нильсену обнаруживали единичные скопления кислотоустойчивых бактерий (менее чем в 10 полях зрения, общее число не более 1000). При окраске аурамин-родамином число обнаруженных микобактерий оказалось достоверно выше (в 10—50 полях зрения, общее число от 1000 до 10 000), а наибольшим оно было при ИГХ-исследовании (более чем в 50 полях зрения , общиее число более 10 000). При этом локализация микобактерий при всех видах исследования была исключительно внеклеточной. Доля типичных палочек при окраске по Цилю—Нильсену (85—95%, в среднем 88,13±2,14%) значительно больше таковой, выявленной при окраске аурамин-родамином (50—85%, в среднем 64,38±4,24%) , и еще значимо больше, чем при проведении ИГХ-исследования (50—70%, в среднем 57,29±2,78%). Столь же сильно разнятся показатели для атипичных морфологических форм микобактерий, выявляемых при окраске по Цилю—Нильсену в минимальном количестве и обнаруживаемых в большом количестве при флюоресцентном и ИГХ-исследовании. Заключение. Доказана способность микобактерий к морфологическому полиморфизму, а также необходимость уточнения патогенеза туберкулеза.

Санкт-Петербургскогий государственный университет, Санкт-Петербург, Россия

Санкт-Петербургский НИИ фтизиопульмонологии

Морфологические методы выявления микобактерий туберкулеза (МБТ) незаменимы в рутинной практике фтизиатрических, инфекционных и многопрофильных стационаров, дополняя клинические, радиологические, микробиологические и иммунологические подходы. При этом число микобактерий, обычно оцениваемое по количеству кислотоустойчивых палочек при окраске по Цилю—Нильсену (Ziehl—Neelsen), часто не соответствует активности инфекционного процесса как по клиническим, так и морфологическим данным, что, однако, не послужило пока предметом масштабных исследований [1, 2].

Основным, используемым с конца XIX века, методом окрашивания микобактерий является метод Циля—Нильсена с использованием карболового фуксина. Состав красителя и протокол окрашивания варьируют в модификациях разных авторов, но суть метода неизменна: карболовый фуксин задерживается в клеточной стенке микобактерий и сохраняется в ней даже после обработки кислотой, обесцвечивающей все остальные структуры и микроорганизмы.

Альтернативным методом селективного окрашивания МБТ является использование раствора аурамина О и родамина В, предполагающее исследование ткани с применением люминесцентной микроскопии, что ограничивает его широкое использование. Как и карболовый фуксин, аурамин образует комплекс с миколовыми кислотами в составе микобактерий, но, по-видимому, обладает к ним большим сродством, поэтому правильно окрашенные препараты с полноценно обесцвеченным фоном обеспечивают высокую контрастность микобактерий и позволяют обнаруживать их в большем количестве по сравнению с окраской по Цилю—Нильсену [3, 4].

Обсуждается возможность выявления МБТ в тканях при использовании иммуногистохимии (ИГХ) и метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Применительно к ИГХ проблемой является перекрестная чувствительность антител как к микобактериям туберкулезного комплекса, так и к нетуберкулезным микобактериям. Применение метода ПЦР существенно ограничивают значительные технические трудности, связанные с его проведением, а также отсутствие возможности достоверного определения количества возбудителей и их локализации [5—8].

В качестве сыворотки для ИГХ-исследования используются моноклональные антитела к антигену РАВ (Protein antigen B)—гликопротеину с молекулярной массой 38 кДа, обнаруживаемому вне зависимости от состояния клеточной стенки микобактерий [9].

Неоднородность результатов даже при правильно выполненной классической окраске по Цилю—Нильсену может рассматриваться как повод для изучения свойств возбудителя.

Одним из важных факторов, влияющих на взаимодействие МБТ с макроорганизмом, является иммуносупрессия прежде всего при ВИЧ-инфекции, в результате чего морфологическая картина туберкулеза в большинстве случаев становится нетипичной за счет меньшей выраженности гранулематозной реакции и большей альтерации, при этом число обнаруживаемых кислотоустойчивых палочек, как правило, больше [10]. Тем не менее и у пациентов без иммуносупрессии регулярно встречается ситуация, при которой ожидаемая с учетом клинических данных морфологическая картина далека от классических представлений о строении туберкулезной гранулемы, локализации и форме кислотоустойчивых микобактерий [11—14].

Слабое окрашивание карболовым фуксином или полное отсутствие такового, зачастую безосновательно трактуемое как технологический дефект, в действительности может быть связано с изменением самого возбудителя, предполагающим полную или частичную утрату микобактериями клеточной стенки (возможно, по типу образования L-форм), чей химический состав и пространственная структура определяют их тинкториальные свойства. Трансформация в L-формы является универсальным свойством многих видов бактерий, обеспечивающих адаптацию в неблагоприятных условиях [15]. В случае с МБТ в качестве неблагоприятных условий можно рассматривать как иммунный ответ, так и специфическую терапию. Показано, что потеря клеточной стенки может быть одним из факторов формирования лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам [16, 17].

Кроме непостоянства тинкториальных свойств микобактерий, также требует изучения феномен, при котором обнаруживаются атипичные формы возбудителя: кокковидные, булавовидные, ветвящиеся и прочие, отличные от классических палочек Коха [18].

Образование подобных форм может происходить как в процессе изменения структуры клеточной стенки, так и в результате изменения жизненного цикла причем и при ускорении размножения, и при его угнетении с преобладанием старых форм. В любом случае атипичная морфология микобактерий требует сопоставления с клиническими проявлениями заболевания и эффективностью терапии [19—22].

Материал и методы

Изучены 24 случая аутопсии клинически, рентгенологически и микробиологически верифицированного фиброзно-кавернозного туберкулеза легких. Большинство пациентов мужчины, средний возраст 49,67±5,77 года. У большей части пациентов зафиксирована широкая лекарственная устойчивость (ШЛУ) МБТ — 14 случаев либо множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) МБТ — 5 случаев (невосприимчивость заболевания соответственно к четырем или двум противотуберкулезным препаратам первой линии), при этом ни в одном случае не выявлено сочетания туберкулеза с ВИЧ. Во всех наблюдениях имело место длительное течение заболевания и продолжительное лечение в профильных стационарах (см. таблицу). Характеристика исследованных умерших Примечание. М — мужчины, Ж — женщины.

Непосредственной причиной смерти большинства пациентов стала интоксикация вследствие прогрессирования инфекционного процесса, также были зафиксированы случаи смерти от легочного кровотечения, тромбоэмболии легочной артерии и сердечно-легочной недостаточности. На вскрытии диагноз фиброзно-кавернозного туберкулеза во всех случаях подтвержден.

Кусочки легких для гистологического исследования фиксировали в 10% нейтральном формалине с последующей проводкой в спиртах и заливкой в парафин по общепринятым методикам. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, карболовым фуксином по Цилю—Нильсену, аурамин-родамином (с последующим исследованием с помощью люминесцентного микроскопа), также проводили ИГХ-исследование с использованием моноклональных антител к антигену РАВ.

Исследование включало оценку выраженности морфологических изменений в области каверн и активности туберкулезного процесса по классификации Б.М. Ариэля [23], подсчет количества микобактерий при увеличении в 400 раз и количества полей зрения, в которых они визуализируются, определение соотношения между различными морфологическими формами возбудителя (палочковидными, кокковидными и прочими), а также их локализация (внутриклеточно, внеклеточно либо в виде адгезированных на поверхности фагоцитов).

После оценки процентного соотношения различных морфологических форм микобактерий подсчитывали среднее значение для каждой формы, затем вычисляли абсолютную погрешность с доверительной вероятностью p=0,95. Значимость различий между методами исследования оценивали путем вычисления t-критерия Стьюдента и сравнения с критическими значениями.

Результаты

При окраске гематоксилином и эозином во всех наблюдениях выявлены характерные для туберкулеза изменения, соответствующие прогрессированию инфекционного процесса (активность IV—V степени по классификации Б.М. Ариэля): крупные каверны с широкой фиброзной капсулой в стенках каверн и в окружающей легочной ткани, определялись гранулемы и более крупные очаги отсева, представленные округлыми эозинофильными фокусами казеозного некроза с мелкими фрагментами клеточного детрита различного размера, окруженными клеточным валом, представленным лимфоцитами, плазмоцитами и в большей степени макрофагами с эпителиоидно-клеточной трансформацией и тенденцией к слиянию с формированием единичных гигантских многоядерных клеток Лангерганса типичного строения с примесью единичных нейтрофильных гранулоцитов. В других полях зрения отмечали утолщение межальвеолярных перегородок за счет фиброза, дистелектазы, очаговый антракоз, умеренный интерстициальный и альвеолярный отек, паретическое полнокровие сосудов, очаговые диапедезные кровоизлияния. Бронхи малого и среднего размера характеризовались лимфоцитарной инфильтрацией, склерозом, гипертрофией мышечного слоя, очаговой атрофией мерцательного эпителия (рис. 1, 2). Рис. 2. Стенка каверны у пациента с фиброзно-кавернозным туберкулезом. Окраска гематоксилином и эозином, ×100. Рис. 1. Типичная картина туберкулезного воспаления. Окраска гематоксилином и эозином, ×100.

При окраске карболовым фуксином по Цилю—Нильсену в патологических очагах обнаруживали единичные скопления внеклеточно расположенных кислотоустойчивых бактерий в среднем менее чем в 10 полях зрения общим числом не более 1000 (рис. 3, 4). Рис. 3. Типичные кислотоустойчивые внеклеточно расположенные палочки. Окраска по Цилю—Нильсену, ×400. Рис. 4. Очаговая тенденция к формированию одиночных скоплений палочек. Окраска по Цилю—Нильсену, ×1000. Подавляющее большинство (85—95%, в среднем 88,13±2,14%) возбудителей имело палочковидную форму, также встречались кокковидные формы (5—13%, в среднем 9,33±1,17%), на прочие морфологические формы вместе взятые приходилось менее 3% наблюдаемых микобактерий .

При окраске аурамин-родамином и последующем исследовании в люминесцентном микроскопе обнаруживали очаговые скопления внеклеточно расположенных микобактерий в 10—50 полях зрения общим числом от 1000 до 10 000, преимущественно палочковидных (50—85%, в среднем 64,38±4,24%), а также кокковидных (10—45%, в среднем 27,29±3,84%), гранул (2—10%, в среднем 6±1,09%), булавовидных (1—5%, в среднем 1,96±0,6%) и ветвящихся (до 1%) форм микобактерий (рис. 5, 6). Рис. 6. Палочковидные и атипичные формы микобактерий. Окраска аурамин-родамином. Люминесцентная микроскопия, ×1000. Рис. 5. Внеклеточно расположенные одиночные микобактерии и их скопления. Окраска аурамин-родамином. Люминесцентная микроскопия, ×400.

При ИГХ-исследовании (рис. 7, 8) Рис. 7. Множественные внеклеточные скопления микобактерий. ИГХ-исследование, ×400. Рис. 8. Атипичные морфологические формы микобактерий. ИГХ-исследование, ×1000. обнаруживали множественные скопления внеклеточно расположенных микобактерий более чем в 50 полях зрения общим числом более 10 000, характеризовавшихся большим разнообразием форм: на палочки приходилось 50—70% (в среднем 57,29±2,78%), на кокковидные — 20—39% (в среднем 28,71±2,31%), на гранулы — 5—13% (в среднем 9,04±1,04%), на булавовидные — 1—7% (в среднем 3,71±0,64%) и на ветвящиеся — 1—3% (в среднем 1,25±0,47%).

Обобщая полученные данные, можно сказать, что доля типичных палочек, выявленных посредством классической окраски по Цилю—Нильсену, значимо больше таковой (t=10,4; p≤0,05), выявленной при окраске аурамин-родамином, и еще более значимо (t=18,2; p≤0,05), чем при проведении ИГХ-исследования. Столь же сильно разнятся показатели для атипичных морфологических форм микобактерий, выявленных при окраске по Цилю—Нильсену в минимальном количестве и обнаруженных в большом количестве при флюоресцентном и ИГХ-исследовании.

Несмотря на типичную картину активного туберкулезного поражения с большим объемом казеозных масс, окраска по Цилю—Нильсену не выявила многочисленных кислотоустойчивых бактерий, подтвердив встречаемый в практике феномен. Принципиально важным при этом является выбор для исследования именно пациентов с фиброзно-кавернозным туберкулезом, чей анамнез предполагал длительное волнообразное течение заболевания и продолжительную терапию, корректировавшуюся в ходе лечения, с учетом ее неэффективности вследствие устойчивости микобактерий к противотуберкулезным препаратам.

Такие случаи можно считать самыми сложными для классического бактериоскопического выявления МБТ ввиду предшествовавшего длительного процесса адаптации возбудителя, что сопровождалось периодами активации и угнетения размножения, а также изменением структуры клеточной стенки с сохранением вирулентности. Именно особенности жизненного цикла могут объяснить присутствие в большом количестве атипичных форм микобактерий, наиболее убедительно выявленных при ИГХ-исследовании.

Важно отметить отсутствие во всех наблюдениях (как при окраске по Цилю—Нильсену, так и при флюоресцентном исследовании) внутриклеточной локализации возбудителя. Микобактерии отсутствовали как в эпителиоидных клетках, макрофагах и в гигантских клетках Лангерганса, так и в нейтрофильных гранулоцитах. Наиболее информативным следует считать ИГХ-исследование, так как, если следовать теории, что явление дормантности возбудителя сопровождается полной или частичной потерей им клеточной стенки для последующей внутриклеточной персистенции, то отсутствие окрашивания внутриклеточно расположенных микобактерий карболовым фуксином по Цилю—Нильсену можно объяснить именно структурными изменениями клеточной стенки. Однако ИГХ-исследование не зависит от состояния и компонентов клеточной стенки, следовательно, обеспечивает выявление микобактерий, находящихся на любом этапе жизненного цикла, в том числе с изменением своих тинкториальных свойств.

В ходе ИГХ-исследования, как и в случае с окраской по Цилю—Нильсену и аурамин-родамином, не выявлено достоверных признаков присутствия возбудителя внутри фагоцитов, что идет вразрез с традиционными взглядами на локализацию микобактерий в туберкулезном очаге, сформированными на основе экспериментальных моделей заболевания у грызунов [24, 25]. В ряде наблюдений зафиксирована адгезия единичных микобактерий на поверхности макрофагов и нейтрофильных гранулоцитов. Не исключено, что подобное расположение способно симулировать внутриклеточную локализацию.

Необходимо отметить, что в обследованной группе у пациентов имелась определенная гетерогенность, связанная с возрастом, варьировавшим в пределах от 31 года до 84 лет, и длительностью заболевания (от 2 до 33 лет), однако морфологическая картина туберкулеза и характеристика микобактерий практически идентичны у всех пациентов вне зависимости от возраста и давности заболевания.

Принципиальным моментом также явилось расположение в ряде случаев скоплений МБТ по периферии очагов казеозного некроза на границе с прилегающим к зоне некроза валом эпителиоидных клеток и фиброзной стенкой каверны. Данная локализация микобактерий может натолкнуть на мысль о формировании ими биопленок, что может быть одним из объяснений возникновения лекарственной устойчивости, хотя этот вопрос и требует специального изучения.

Выводы

1. Проведенное исследование подтвердило, что микобактерии туберкулеза могут выявляться в тканях с помощью различных методов и иметь разную морфологию, при этом наличие даже небольшого числа кислотоустойчивых бактерий при окраске по Цилю—Нильсену является важным диагностическим признаком, но их отсутствие не свидетельствует об отсутствии туберкулеза.

2. При использовании всех бактериоскопических методов на светооптическом уровне на нашем материале внутриклеточных форм возбудителя не обнаружено.

3. Наибольшая доля атипичных морфологических форм микобактерий обнаруживается при флюоресцентном (35,62%) и ИГХ- исследованиях (42,71%), что демонстрирует их более высокую чувствительность, в то время как при окраске по Цилю—Нильсену атипичные микобактерии выявляются в сравнительно небольшом количестве (11,87%).

4. Микробиологическая сущность и клиническое значение морфологического полиморфизма микобактерий требуют дальнейшего изучения. Более того, можно утверждать, что в уточнении нуждается и патогенез туберкулеза.

Концепция и дизайн исследования — В.А.Ц., М.М.А.

Сбор и обработка материала — А.Н.О., М.М.А.

Статистическая обработка — М.М.А.

Написание текста — В.А.Ц., М.М.А.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Гонококки (Neisseria gonorrhoeae) - это абсолютно патогенные грам-отрицательные (Грам -) диплококки (бактерии округлой формы, расположенные попарно), являющиеся причиной гонореи у мужчин и женщин, бленнореи у новорожденных.

Инфекция относится к группе заболеваний, передаваемых преимущественно половым путем (STDS), и сопровождается развитием воспалительного процесса в органах мочеполовой системы, прямой кишки и ротоглотки (при анальных и оральных половых контактах), конъюнктивы (у новорожденных).

Рассмотрим подробнее микробиологию и методы выявления возбудителя в различных субстратах, а также классификацию и профилактику гонореи.

1. Характеристика Neisseria gonorrhoeae

Гонококки (Neisseria gonorrhoeae) - это бактерии округлой, бобовидной формы, размерами 1,25-1,0x0,7-0,8 мкм. Они почти неподвижны, не образуют споры. Хорошо окрашиваются красителями.

При окраске по Граму имеют красновато-розовый цвет (см. рисунок 1, белыми стрелками отмечены нейссерии). При окраске метиленовым синим - голубовато-синий цвет; бриллиантовой зеленью - зеленоватый цвет.

Рисунок 1 - Гонококки в мазке, окрашенном по Граму. Источник иллюстрации - Dr. Dovinova P.

Бактерии имеют своеобразное строение:

1 Их клеточная стенка устроена сложно, имеет многослойную структуру (6 слоев) и большое количество антигенов. В составе ее имеются липополисахарид (ЛПС, LOS), фосфолипиды и белки.
2 Бактерии имеют фимбрии, которые позволяют гонококкам прикрепляться к клеткам эпителия после попадания в организм хозяина. Эти фимбрии меньше и тоньше, чем жгутики, состоят из белков. На основании типов и факта наличия фимбрий нейссерии делятся на 4 группы: T1, T2, T3, T4.
3 Они могут менять свою форму в зависимости от воздействия условий окружающей среды (например, антибактериальной терапии): палочкообразную, L-форму и др.

Для жизнедеятельности эти микроорганизмам необходим кислород. Гонококки неустойчивы во внешней среде, погибают при высыхании, под воздействием антисептиков, яркого света и УФ-облучения. Этим и обусловлена относительная редкость бытового инфицирования.

Именно поэтому мазок, взятый у пациента из уретры или половых путей для окрашивания и микроскопии, должен быть доставлен в лабораторию как можно скорее.

2. Культуральные свойства

Neisseria gonorrhoeae достаточно капризны, растут только на специализированных жидких и твердых питательных средах с добавлением белков плазмы крови:

1 Оптимальные условия для выращивания культуры - 37 градусов Цельсия, кислотность среды 7,2-7,6. То есть оптимальная температура среды для выращивания культуры примерно равна температуре тела человека.
2 Используемые среды для культивирования: ГНК-агар (Оболенск), гонококковая среда – СВГ (институт Пастера), аргинин-агар (Микроген), среда Левенталя, зарубежные - Oxoid, Gibco, BRL, MacConkey, шоколадный агар, обогащенный углекислым газом и др.
3 На твердой питательной среде образуют мелкие беловатые, серо-беловатые или бесцветные прозрачные округлые колонии (капли росы). Размер колоний 0,5-2,0 мм.
4 В жидкой питательной среде образуют пленку, которая оседает на дно.
5 Гонококки могут расщеплять глюкозу с образованием кислоты, другие сахара расщеплять не могут; не расщепляют белки, не вызывают гемолиз, не образуют аммиак, сероводород, индол. Пробы на оксидазу всегда положительные.

Рисунок 2 - ГНК-агар (Оболенск). Для просмотра кликните по иллюстрации

3. Антигенные свойства и иммунитет

Антигенная структура этих нейссерий сложна и крайне вариабельна:

1 Пили.
2 Белки наружной мембраны.
3 Липополисахарид (ЛПС).

Врожденный иммунитет отсутствует. Приобретенный иммунитет слабый, человек может повторно заражаться гонореей после ранее перенесенного заболевания. Повторное инфицирование возможно благодаря высокой изменчивости бактерий, они способны значительно менять свои антигенные свойства под влиянием защитных сил организма и медицинских препаратов.

Хронизация инфекции может обусловлена следующими факторами:

1 Изменчивость антигенной структуры;
2 Механизмы ухода от факторов защиты макроорганизма;
3 Устойчивость к антибактериальным препаратам.

Патогенность гонококков обусловлена их антигенами, ферментативной активностью и некоторыми другими факторами. Рассмотрим подробнее.

1 IgA1-протеазы, способные расщеплять IgA.
2 ЛПС (LOS), выполняющий функцию эндотоксина. Провоцирует развитие бурной воспалительной реакции в ответ на внедрение инфекционного агента. Кроме того, в штаммах, которые вызывают системную инфекцию, LOS связывает сиаловую кислоту из сыворотки, образуя микрокапсулу сиалилированного LOS, которая позволяет бактериям противостоять иммунитету макроорганизма.
3 Пили, обеспечивающие адгезию и заражение клеток эпителия мочеполовых органов. После непосредственного прикрепления к эпителиоцитам бактерии вступают во вторую стадию - связывания, опосредованную белком наружной мембраны P.II (также известным, как Opa).
4 Белок наружной мембраны P.II (Opa) необходим для тесного связывания и проникновения бактерий в эпителиальную клетку. Эти же белки связываются с LOS соседней бактерии, в результате чего на поверхности эпителия образуются биопленки.
5 Наружный мембранный порин P.I (Por) ингибирует способность фагоцитов убивать захваченные бактерии.
6 Пориновые каналы (porA, porB) в наружной мембране играют ключевую роль в вирулентности. Гонококковые штаммы с porA могут обладать собственной устойчивостью к специфическим антителам и повышенной способностью проникать в эпителиальные клетки.
7 Гонококки способны образовывать на внешней мембране два рецептора трансферрина (Tbp1 и Tbp2) и один рецептор лактоферрина (Lbp), которые стимулируются в условиях с низким содержанием железа и способны непосредственно экстрагировать железо из трансферрина и лактоферрина. Эти белки могут также выделять железо из гема и гемоглобина.
8 Некоторые приобретенные плазмиды и генетические мутации усиливают вирулентность патогенов. Бета-лактамаза типа ПЭМ-1 (пенициллиназа) влияет на связывание пенициллина и обусловливает устойчивость гонококков к пенициллину.
9 TetM защищает рибосомы и придает устойчивость к тетрациклину. Изменения в генах gyrA и parC приводят к устойчивости к фторхинолонам и снижению проницаемости клеток для антибактериальных препаратов.

4. Пути передачи инфекции

Основной путь передачи инфекции среди взрослого населения - половой. Незащищенные генитальные, анальные и оральные контакты способствуют попаданию инфекционных агентов на слизистую оболочку мочеполовой системы, прямой кишки и ротоглотки.

Риск передачи N. gonorrhoeae от инфицированной женщины в уретру ее партнера-мужчины составляет приблизительно 20% на один эпизод вагинального полового акта, риск инфицирования повышается до 60-80% после 4 или более сексуальных контактов.

Напротив, риск передачи инфекции от мужчины к женщине при однократном половом акте составляет примерно 50-70%, при этом имеется мало свидетельств повышения степени риска инфицирования при многократных контактах.

У детей возможно заражение при:

1 Половых контактах, в том числе и принудительных;
2 При прохождении ребенка по родовым путям матери;
3 При использовании общих предметов личной гигиены вместе со взрослыми (полотенца, мочалки, совместное купание в ванной, подмывание ребенка инфицированными родителями).

Бытовой путь передачи заболевания встречается нечасто, при обращении врач сначала исключит половой путь инфицирования (осмотр у гинеколога делают даже маленьким девочкам, если у последних обнаружена инфекция).

Таким образом, к факторам риска патологии можно отнести:

1 Лиц, практикующих незащищенные сексуальные контакты (традиционные и нетрадиционные);
2 Лиц, имеющих несколько половых партнеров;
3 Лиц с низким социально-экономическим статусом;
4 Лиц, перенесших ранее ЗППП;
5 Лиц, злоупотребляющих наркотическими веществами, работников секс-индустрии;
6 Лиц, рано начавших половую жизнь;
7 Детей и других членов семьи инфицированного.

После попадания на эпителий мочеполовой системы бактерии уже через 24-48 часов попадают в межклеточное пространство. В среднем, инкубационный период гонореи у мужчин и женщин (гонококкового уретрита и вульвовагинита) составляет 1-14 дней, он значительно укорачивается при микст-инфекциях (например, сочетание с урогенитальным хламидиозом и трихомониазом), сопутствующей патологии мочеполовой системы.

Удлинение инкубационного периода возможно при применении антисептиков, спринцеваний, вагинальных свечей, приеме антибактериальных препаратов. Всегда следует помнить о возможности бессимптомного носительства!

5. Эпидемиология

6. Какие заболевания вызывает Neisseria gonorrhoeae?

В зависимости от локализации инфекции Neisseria gonorrhoeae может стать причиной следующих заболеваний:

1 Гонококковый уретрит и цистит (уретрит чаще у мужчин, цистит у женщин).
2 Острый и хронический вульвовагинит, цервицит, эндометрит, сальпингоофорит, бартолинит у женщин.
3 Баланопостит у мужчин (редкая форма).
4 Специфический простатит, орхит, эпидидимит у мужчин.
5 Конъюнктивит (бленнорея) у новорожденных, специфическое поражение сосудистой оболочки глаза.
6 Специфические артриты, бурситы, синовиты и теносиновиты.
7 Проктит и парапроктит (инфицирование при анальных контактах).
8 Фарингит и тонзиллит (инфицирование при оральных контактах).
9 Осложнения и генерализация инфекции: абсцедирование, пельпиоперитонит, перитонит, менингит, менингоэнцефалит, эндокардит, пневмония, сепсис (гонококкемия) и др.

По течению инфекция может быть:

1 Острой;
2 Хронической;
3 Бессимптомное носительство. Именно эта группа пациентов наиболее опасна в эпидемиологическом плане.

7. Лабораторные методы диагностики

Для установления факта инфицирования используются несколько видов лабораторной диагностики:

1 Простая бактериоскопия (другие названия - микроскопическое исследование мазка из уретры и половых путей, мазок на микрофлору и GN, мазок на гонорею и др.).
2 Бактериологическое исследование (посев материала на питательную среду и определение чувствительности полученной культуры к антибактериальным препаратам).
3 ПЦР-диагностика (PCR), ДНК-зонд (ДНК-гибридизация).
4 Лигазная цепная реакция (LCR, ЛЦР).
5 Амплификация РНК (NASBA).
6 Серологические тесты. Эти тесты включают реакцию латексной агглютинации, ELISA, иммунопреципитацию и РСК. Из-за их более низкой чувствительности и специфичности, особенно в популяциях с низкой распространенностью заболевания, эти анализы обычно не используются для диагностики гонореи, но они могут использоваться в качестве дополнения к другим лабораторным тестам.

В качестве материала для исследования могут выступать:

1 Мазки из уретры, заднего свода влагалища и цервикального канала.
2 Отделяемое из прямой кишки.
3 Соскобы и мазки-отпечатки с конъюнктивы глаза.
4 Кровь и спинномозговая жидкость при осложненной генерализованной инфекции.
5 Пунктат из суставной полости (при специфических артритах).

7.1. Микроскопия мазков и соскобов

Это простой, рутинный и высокоинформативный метод диагностики гонореи, особенно связанной с поражением мочеполовой системы (острые уретриты, вульвовагиниты, цервициты). Информативность и чувствительность простой микроскопии варьирует от 80 до 100%. Наиболее низкая чувствительность наблюдается при использовании данного метода в диагностике гонококкового фарингита, проктита.

Суть данного метода сводится к обнаружению гонококков Нейссера в препарате, изготовленном путем нанесения мазка (соскоба) на предметное стекло, с последующим высушиванием и окрашиванием (метиленовым синим или по Граму). При обнаружении нейссерий результат записывается как положительный, при их отсутствии в препарате - отрицательный.

Как правильно берется мазок на гонорею у женщин, читайте здесь (перейдите по внутренней ссылке). Перед сдачей мазка из уретры мужчинам необходимо соблюсти следующие правила:

1 Не мочиться за 2 часа до взятия материала, чтобы струя мочи не смыла имеющиеся в уретре выделения.
2 Проконтролировать, чтобы Вам не назначались никакие антибактериальные препараты в течение последних 3-4 недель.
3 Проконтролировать, чтобы Вами не использовались никакие местные антисептики в течение последних 10 дней.
4 В течение 2 суток до забора материала отказаться от половых контактов (любых).

На рисунке ниже в препарате, полученном при окрашивании по Граму мазка из уретры, можно видеть нейссерий.

Рисунок 3 - Гонококки (Neisseria gonorrhoeae) в мазке из уретры у мужчин. Источник иллюстрации - Gonorrhea. Janet M. Torpy, MD; Cassio Lynm, MA; Robert M. Golub, MD.

7.2. Культуральный метод диагностики

Культуральный метод диагностики (другие названия - бактериологическое исследование, посев на питательную среду и т. д.) используется реже, чем простая микроскопия. Это обусловлено длительностью выращивания культуры из полученного от пациента материала.

Чувствительность культурального метода при симптоматическим уретрите у мужчин оценивается 95-100%, чувствительность того же метода при эндоцервикальной локализации инфекции - 80-90%.

Когда используется данный метод?

1 Потребность оценить чувствительность гонококков к антибактериальным препаратам (хроническая инфекция, генерализация инфекции).
2 Отсутствие эффекта от проводимой медикаментозной терапии.
3 Редкая локализация инфекции.

Основные питательные среды, используемые для получения культуры мы рассмотрели выше. Результат может быть отрицательным (нет роста культуры) и положительным (есть рост). Как выглядит культура нейссерий, можно увидеть на рисунке 2.

7.3. Молекулярно-биологические методы

В полученном от пациента материале можно обнаружить ДНК нейссерий. Методы, позволяющие это сделать, полимеразно-цепная реакция (ПЦР), ДНК-гибридизация, лигазная цепная реакция.

Аналогичный метод, позволяющий обнаружить РНК патогенов в исследуемом субстрате, называется амплификацией РНК (NASBA). Оба этих метода лабораторной диагностики относятся к высокоточным и высокочувствительным.

Результат этих проб может быть положительным (обнаружены РНК и ДНК) и отрицательным (в материале нет РНК и ДНК возбудителя). Не имеет смысла подсчитывать количество гонококков Нейссера в субстрате, так как любой положительный результат требует медикаментозной терапии.

Данные методы могут быть применимы к любому материалу для исследования (мазок из уретры, влагалища и цервикального канала, соскоб, пунктат, кровь и так далее), могут назначаться при любой локализации возбудителя.

8. Гонококки и их чувствительность к антибактериальным препаратам

Гонококки Нейссера чувствительны ко многим группам антибиотиков:

1 Цефалоспорины (цефтриаксон, цефиксим);
2 Макролиды (азитромицин);
3 Тетрациклины (доксициклин);
4 Аминоциклитолы (спектиномицин);
5 Фторхинолоны.

Согласно клиническим рекомендациям РФ, CDC и ВОЗ для лечения гонореи наиболее эффективными являются следующие препараты из вышеописанных групп:

1 Цефтриаксон (Торговые названия - Роцефин, Лендацин, Аразан, Цефсон и др.);
2 Цефиксим (Торговые названия - Панцеф, Супракс и др.);
3 Азитромицин (Торговые названия - Сумамед, Азитрокс, Хемомицин, Зитролид и др.);
4 Доксициклин (Юнидокс Солютаб);
5 Спектиномицин (Кирин).

Режимы дозирования и схемы лечения зависят от возраста пациента, сопутствующих заболеваний, формы и степени тяжести инфекции, поэтому здесь их рассматривать не будем. Подробнее с ними можно ознакомиться в соответствующих разделах.

С конца 1940-х годов наблюдается рост антибиотикорезистентных штаммов. Наибольшую обеспокоенность представляет высокий процент случаев, обусловленных нейссериями, продуцирующими пенициллиназу.

Устойчивость к фторхинолонам быстро увеличивается в течение последнего десятилетия на большинстве континентов и в Соединенных Штатах. CDC сообщила о резистентности к фторхинолонам в 6,8% изолятов 2004 года, 9,4% изолятов 2005 года и 13,3% изолятов 2006 года (Medscape).

Динамика чувствительности гонококков на территории РФ непрерывно изучается и нашими учеными. Последние несколько лет отмечается значительное снижение их чувствительности к азитромицину, ампициллину, доксициклину, тетрациклину, ципрофлоксацину, эритромицину, цефуроксиму [3-4, 8].

Пока еще сохраняется эффективность цефриаксона, цефиксима, спектиномицина, поэтому эти препараты могут быть использованы для лечения гонореи у взрослых и детей. Эти препараты и фигурируют в большинстве клинических рекомендаций.

9. Профилактика заражения

Профилактика гонореи проводится на общественном и индивидуальном уровнях. Общественные меры профилактики должны включать:

Читайте также: