Гост 26075-2013 животные методы лабораторной диагностики бешенства

Обновлено: 11.05.2024

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГБУ "ВГНКИ")

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии Российской Федерации

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 27 июня 2013 г. N 57-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Минэкономики Республики Армения

Госстандарт Республики Беларусь

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30 сентября 2013 г. N 1127-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 26075-2013 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2015 года

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

Методы лабораторной диагностики бешенства

Animals. Methods of Laboratory Diagnostic of Rabies

Дата введения 2015-01-01

Сведения о стандарте

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии Российской Федерации

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Минэкономики Республики Армения

Госстандарт Республики Беларусь

ВНЕСЕНА поправка, опубликованная в ИУС N 12, 2021 год

Поправка внесена изготовителем базы данных

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на все виды млекопитающих животных и устанавливает следующие методы лабораторной диагностики бешенства:

- метод флуоресцирующих антител (МФА);

- метод выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или невриномы Гассерова узла крысы - НГУК-1);

- биопроба на белых мышах;

- метод иммуноферментного анализа (ИФА);

- реакция диффузионной преципитации (РДП).

1 Данные методы применимы ко всем представителям рода Lyssavirus.

2 Уличный вирус бешенства относится к микроорганизмам 2 класса патогенности (представляет смертельную опасность для человека и животных).

3 При необходимости генотипирования вируса бешенства с помощью готовых тест-систем применяют метод обратно транскриптазной полимеразной цепной реакции (от-ПЦР).

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ 12.0.004-90 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.4.011-89 Система стандартов безопасности труда. Средства защиты работающих. Общие требования и классификация

ГОСТ 17.0.0.01-76 Система стандартов в области охраны природы и улучшения использования природных ресурсов. Основные положения

ГОСТ 177-88 Водорода перекись. Технические условия

ГОСТ 2603-79 Реактивы. Ацетон. Технические условия

ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия.

ГОСТ 8074-82 Микроскопы инструментальные. Типы, основные параметры и размеры. Технические требования.

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 13739-78 Масло иммерсионное для микроскопии. Технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 21241-89 Пинцеты медицинские. Общие технические условия.

ГОСТ 22967-90 Шприцы медицинские инъекционные многократного применения. Общие технические требования и методы испытаний

ГОСТ 24861-91 (ИСО 7886-84) Шприцы инъекционные однократного применения

ГОСТ 25046-81 (ИСО 7864-81) Иглы инъекционные однократного применения. Основные размеры. Технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 29230-91 (ИСО 835-4-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 4. Пипетки выдувные

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины, определения и сокращения

3.1 В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1.1 бешенство: Инфекционное заболевание человека и животных, вызываемое представителями семейства Rhabdoviridae рода Lyssavirus (рабдовирус), и приводящее к летальному исходу в 100% случаев.

3.1.2 вирус бешенства: Возбудитель инфекционного заболевания человека и животных.

3.1.3 антиген вируса бешенства: Поверхностные белковые структуры вируса бешенства, на которые вырабатываются антитела.

3.1.2* метод флуоресцирующих антител (МФА): Метод выявления антигена вируса бешенства меченными флуоресцеинизотиоцианатом антирабическими антителами, с образованием характерных светящихся комплексов-включений, обнаруживаемых в поле зрения люминесцентного микроскопа.

* Нумерация соответствует оригиналу. - Примечание изготовителя базы данных.

3.1.3 метод выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или невриномы Гассерова узла крысы - НГУК-1): Метод выделения антигена вируса бешенства, основанный на размножении вируса в культуре клеток и его идентификации методом флуоресцирующих антител.

3.1.3* биопроба: Метод выделения вируса бешенства на белых мышах путем введения им суспензии патологического материала с последующей идентификацией вируса методом флуоресцирующих антител.

* Нумерация соответствует оригиналу. - Примечание изготовителя базы данных.

3.1.4 метод иммуноферментного анализа (ИФА): Метод выявления антигена вируса бешенства, основанный на его специфическом взаимодействии с антирабическим антителом, иммобилизованном на твердом носителе, с последующим выявлением связавшегося антигена с помощью второго меченного ферментом антитела путем окрашивания продукта реакции хромогеном.

3.1.5 реакция диффузионной преципитации (РДП): Метод выявления вируса бешенства, основанный на способности антител и вирусного антигена бешенства диффундировать в агаровом геле и при специфическом взаимодействии образовывать комплекс "антиген-антитело", наблюдаемый невооруженным глазом в виде линии преципитации.

3.1.6 метод обратно транскриптазной полимеразной цепной реакции (от-ПЦР): Метод выявления генома вируса бешенства путем перевода специфической последовательности РНК вируса в ДНК с последующим многократным копированием полученной ДНК и обнаружением продуктов реакции, осуществляемый in vitro.

Текст ГОСТ 26075-84 Животные сельскохозяйственные. Методы лабораторной диагностики бешенства

ЖИВОТНЫЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ

МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ БЕШЕНСТВА

ГОСТ 26075—84 (СТ СЭВ 3452-81)

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО СТАНДАРТАМ

РАЗРАБОТАН Министерством сельского хозяйства СССР ИСПОЛНИТЕЛИ

Б. И. Антонов, Л. П. Каменева

ВНЕСЕН Министерством сельского хозяйства СССР

Зам. начальника Главного управления ветеринарии П. П. Рахманин

УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государств венного комитета СССР по стандартам от 9 января 1984 г. № 48

УДК 636:576.8.07:006.354 Группа С79

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

ЖИВОТНЫЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ Методы лабораторной диагностики бешенства

Methods of laboratory diagnostics of rabies

Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 9 января 1984 г. № 48 срок действия установлен

с 01.07.84 до 01.07.89

Несоблюдение стандарта преследуется по закону

Настоящий стандарт распространяется на все виды животных и устанавливает методы лабораторной диагностики заболевания бешенством, вызываемого рабдовирусом.

Стандарт применяют при диагностике заболевания животных в лабораториях ветеринарных научно-исследовательских учреждений, республиканских и областных ветеринарных лабораториях

Стандарт полностью соответствует СТ СЭВ 3452—81.

1. МЕТОД ОТБОРА ПРОБ

1.1. Для проведения исследований на бешенство в лабораторию направляют свежие трупы мелких животных целикам, от крупных животных — головной мозг.

Для постановки биопробы допускается использовать пробы мозга, консервированные в 30—50%-ном растворе глицерина,

1.2. Отобранный для исследования патологический материал упаковывают во влагонепроницаемую тару и в металлических контейнерах доставляют в лабораторию.

1.3. Патологический материал сопровождают документом, содержащим следующие данные:

наименование и адрес отправителя;

анамнестические и клинико-эпизоотологические данные.

Издание официальное Перепечатка воспрещена

2. МЕТОД ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ

2.1. Аппаратура, материалы, реактивы и растворы

Термостат с температурой нагрева 37°С.

Стекла предметные по ГОСТ 9284—75.

Пробирки бактериологические по ГОСТ 25336—82.

Чашки Петри по ГОСТ 25336—82.

Пипетки мерные по ГОСТ 20292—74.

Набор инструментов для вскрытия черепной полости и извлечения головного мозга животных.

Пинцеты по ГОСТ 21241—77.

Горелка газовая или спиртовая.

Ацетон по ГОСТ 2603—7Э.

Диагностический иммуноглобулин флуоресцирующий антирабический (ДАФИ).

Масло нефлуоресцирующее иммерсионное по ГОСТ 13739—78.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709—72.

Раствор фосфатный буферный, pH 7,4.

2.2. Подготовка к исследованию

2.2.1. Из каждого отдела головного мозга (аммонова рога, мозжечка, коры больших полушарий и продолговатого мозга) готовят по два препарата — мазка-отпечатка.

2.2.2. Препараты высушивают на воздухе и фиксируют в охлажденном ацетоне при плюс 4 или минус 12°С в течение 4—12 ч. Затем препараты извлекают из ацетона, высушивают на воздухе 10—15 мин и помещают их во влажную камеру (чашки Петри с увлажненным дном).

2.2.3. Диагностический антирабический флуоресцирующий иммуноглобулин (ДАФИ) в рабочем разведении наносят равномерно на всю поверхность препарата при помощи пипетки (примерно-0,1 см 3 на один препарат) ₍ закрывают камеру с препаратами, помешают в термостат и выдерживают 30 мин при 37°С. Затем предметные стекла с препаратом троекратно промывают, погружая их каждый раз на 10 мин в сосуд, наполненный фосфатным

буфером pH 7,4, промывают дистиллированной водой и высушивают на воздухе.

На окрашенные препараты наносят иммерсионное нефлуоресцирующее масло.

2.3. Проведение исследования

2*3.1. Подготовленные препараты просматривают под люминесцентным микроскопом с иммерсионной системой.

2.4. Обработка результатов

2.4.1. При положительных результатах исследования в препаратах, содержащих антиген вируса бешенства, обнаруживают разной величины и формы ярко светящиеся желто-зеленым цветом гранулы в нейронах и вне клеток. Размер их колеблется от едва заметных в виде песчинок образований до 15—20 мм*

Не пораженная вирусом бешенства мозговая нервная ткань светится тусклым серовато-желтым или зеленоватым цветом.

3. МЕТОД ПОДАВЛЕНИЯ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ

3.1. Аппаратура, материалы, реактивы и растворы

3.1.1- Аппаратура, материалы, реактивы и растворы, указанные в п. 2.1, и дополнительно:

иммуноглобулин 5%-ный антирабический нефлуоресцирующий моноспецифический;

раствор физиологический нейтральный.

3.2. Подготовка к исследованию

3.2.1. На фиксированные препараты, приготовленные из исследуемых участков головного мозга, наносят пипеткой 5%-ный антирабический нефлуоресцирующий моноспецифический иммуноглобулин, выдерживают их в течение 30 мин во влажной камере в термостате при 37°С. Затем препараты промывают двукратно нейтральным физиологическим раствором и окрашивают антирабическим флуоресцирующим иммуноглобулином (ДАФИ) по п. 2.2.3.

3.3. Проведение исследования

3.3.1. Препараты просматривают под люминесцентным микроскопом с иммерсионной системой.

3.4. Обработка результатов

3.4.1. В препаратах, содержащих антиген вируса бешенства, предварительно обработанных нефлуоресцирующим и затем флуо

ресцирующим иммуноглобулином, свечения не должно быть, а в препаратах, ранее обработанных только флуоресцирующим’ иммуноглобулином наблюдают специфическое свечение.

4. МЕТОД РЕАКЦИИ ПРЕЦИПИТАЦИИ

Этим методом допускается исследовать несвежий патологический материал, контаминированный бактериальный микрофлорой*

4.1. Аппаратура, материалы и реактивы Гермостат.

Осветитель для бактериологических работ.

Пипетки мерные и пастеровские по ГОСТ 20292—74.

Чашкр Петри по ГОСТ 25336—82.

Трубка металлическая тонкостенная диаметром 4—5 мм.

Перо писчее ученическое.

Натрий хлористый по ГОСТ 4233—77.

Метиловый оранжевый, 1%-ный раствоор в 50%-ном этиловом спирте по ГОСТ 5962—67.

Диагностический иммуноглобулин антирабический.

Антиген отрицательный контрольный.

Антиген положительный контрольный.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709—72.

Гель агаровый биофабричного изготовления или приготовленный по рецептуре:

1%-ный раствор метилового оранжевого в 50%-ном этиловом спирте —10 см 3 ,

мертиолят —0,01 г,

вода дистиллированная — 1000 см 3 .

Агаровый гель с pH 7,2—7,4 разливают в стерильную посуду, автоклавируют при 0,5 атм в течение 30 мин, хранят в холодильнике при 4°С.

42. Проведение исследования

4.2.1. Реакцию преципитации (РП) ставят на обезжиренных предметных стеклах, на которые предварительно наносят каплю расплавленного агара, пипеткой равномерно распределяя ее по стеклу, и делают тонкий мазок. На застывший слой агара наливают сверху 2,5 см 3 агарового геля толщиной приблизительно 2 мм.

После застывания агара делают в нем лунки металлической тонкостенной трубочкой диаметром 4—5,6 мм согласно трафарету. Агаровые столбики осторожно извлекают ученическим пером, не допуская отслаивания от стекла тонкого слоя агарового геля.

В РП исследуют от крупных животных (лошадей, крупного рогатого скота, собак, лисиц и др.) следующие части головного мозга—кору полушарий левой и правой сторон, аммоновы рога— левый и правый, мозжечок и продолговатый мозг. У мелких животных РП ставят с какими-либо тремя отделами мозга. От мышей исследуют весь головной мозг, который растирают в ступке или в самой черепной коробке в массу пастообразной консистенции.

Бешенство - особо опасная болезнь теплокровных животных, характеризующаяся тяжелым поражением центральной нервной системы, атипичным поведением, агрессивностью, параличами, ведущая к летальному исходу. Обычно протекает в буйной форме (у большинства животных) или в тихой (не характерно для крупного рогатого скота). Является зооантропонозом, представляя огромную опасность для человека.

Полученные данные свидетельствуют о резком усугублении эпизоотической ситуации по бешенству, что заставляет обратить специалистов ветеринарной медицины усиленное внимание на данную проблему.

Наиболее действенным методом контроля бешенства среди животных является своевременная иммунопрофилактика и диагностика.

Возбудителем заболевания является вирус бешенства Rabies lyssavirus.

Family/ Семейство – Rhabdoviridae;

Genus/ Род – Lyssavirus;

Species/ Вид - Rabies lyssavirus.

Методы лабораторной диагностики бешенства стандартизированы. Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30-09-2013 г. № 1127-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 26075-2013 введен в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2015 г.

Настоящий стандарт распространяется на все виды млекопитающих животных и устанавливает следующие методы лабораторной диагностики бешенства: метод флуоресцирующих антител (МФА); метод выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или невриномы Гассерова узла крысы - НГУК-1); биопроба на белых мышах; метод иммуноферментного анализа (ИФА); реакция диффузионной преципитации (РДП).

Для диагностики используются:

1. Метод флуоресцирующих антител. Выявление антигена вируса бешенства меченными флуоресцеинизотиоцианатом антирабическими антителами, с образованием характерных светящихся комплексов-включений, обнаруживаемых в поле зрения люминесцентного микроскопа.

2. Метод выделения вируса в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131. Основан на размножении вируса в культуре клеток и его идентификации методом флуоресцирующих антител.

Суспензированый пат. материал вносят в культуру клеток, оставляя лунки для контроля. Положительный контроль - суспензия мозга мыши со штаммом вируса бешенства CVS, отрицательный - суспензия мозга клинически здоровой мыши. Далее инкубируют во влажном CO₂ инкубаторе с содержанием 5 CO₂% при 37±1°С в течении 42-28ч. Высушивают, фиксируют в холодном ацетоне в течении 30 мин, вновь высушивают. Далее с добавлением ФАГ в рабочем разведении, помещают во влажную чашку Петри и инкубируют при 37±1°С в течении 30 мин. По окончании трехкратно промывают, погружая на 10 мин в сосуд с ФБР, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают. Наносят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматривают в люминесцентном микроскопе. Антиген вируса бешенства выявляется в цитоплазме культуры клеток в виде ярких зеленых гранул различной формы с четкими краями.

3. Метод биопробы. Выделение вируса бешенства на белых мышах путем введения им суспензии патологического материала с последующей идентификацией вируса методом флуоресцирующих антител.

Наиболее пригодными для заражения являются мыши-сосунки. Для постановки биопробы используют 15-20 животных. Заражение проводят под наркозом путем интрацеребрального введения 0,03 мл суспензии исследуемого материала. При наличии в исследуемом материале вируса бешенства у мышей возникает тремор мышц, параличи. В большинстве случаев животные погибают в течение пяти дней. Наличие вируса бешенства в зараженных и погибших мышах необходимо подтвердить с помощью прямой реакции иммунофлуоресценции или обнаружения телец Бабеша-Негри. Идентификацию обнаруженного вируса бешенства проводят также с помощью реакции нейтрализации на белых мышах.

4. Метод иммуноферментного анализа. (ELISA) Основан на специфическом взаимодействии вирусного антигена с антирабическим антителом, иммобилизованном на твердом носителе, с последующим выявлением связавшегося антигена с помощью второго, меченного ферментом, антитела, путем окрашивания продукта реакции хромогеном.

Готовые разведения антирабической сыворотки вносят в приготовленные лунки в агаровом геле. Чашки Петри помещают в термостат при 37±1°С на 48 часов. Реакцию считают положительной при появлении одной или 2-3 линий преципитации любой интенсивности между лунками, содержащими суспензию мозга и антирабический гамма-глобулин. Отрицательный результат подтверждается другими методами.

Принимая во внимание высокую опасность болезни, обусловленную полной летальностью, специалисту ветеринарной медицины нужно знать, что окончательный диагноз может быть поставлен только методами лабораторной диагностики. Поэтому трудно переоценить значимость вышеперечисленных методов для практической ветеринарной медицины.

Библиографический список

Гулюкин, А.М. Значимость современных методов лабораторной диагностики и идентификации возбудителя бешенства для иммунологического мониторинга данного зооноза [Текст] / А.М. Гулюкин // М.:Вопросы вирусологии № 3, 2014 г. - с. 5-10.

Методы лабораторной диагностики бешенства. [Текст] : ГОСТ 26075-2013 - Введ. 2015-01-01. - М.: Госстандарт России, 2013. - 19с.

Читайте также: