Гост 52816 кишечная палочка

Обновлено: 28.03.2024

Текст ГОСТ Р 52816-2007 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)

ГОСТ Р 52816-2007

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)

Food products. Methods for detection and quantity determination of coliformes

____________________________________________________________________
Текст Сравнения ГОСТ Р 52816-2007с ГОСТ 31747-2012 см. по ссылке.
- .
____________________________________________________________________

ОКС 07.100.30
ОКСТУ 9109

Дата введения 2009-01-01

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 года N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения"

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Государственным научным учреждением "Всероссийский научно-исследовательский институт консервной и овощесушильной промышленности" (ГНУ ВНИИКОП) на основе аутентичных переводов стандартов, указанных в пункте 4

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 93 "Продукты переработки фруктов, овощей и грибов"

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 27 декабря 2007 г. N 443-ст

4 Настоящий стандарт является модифицированным по отношению к международным стандартам*:
________________
* Доступ к международным и зарубежным документам можно получить, перейдя по ссылке - .

- ИСО 4831:2006 "Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод для выявления и подсчета количества колиформ. Метод наиболее вероятного числа" (ISO 4831:2006 "Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal mеthod for the detection and enumeration of coliforms - Most probable number technique", MOD);

- ИСО 4832:2006 "Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод подсчета колиформ. Метод подсчета колоний" (ISO 4832:2006 "Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal mеthod for the enumeration of coliforms - Colony-count technique", MOD) в части пищевых продуктов.

При этом дополнительные положения и требования, включенные в текст стандарта для учета потребностей национальной экономики Российской Федерации и особенностей российской национальной стандартизации, выделены в тексте стандарта курсивом*.
_______________
* В бумажном оригинале обозначения и номера стандартов и нормативных документов в разделе "Предисловие" и таблице В.1 приложения В приводятся обычным шрифтом, остальные по тексту документа выделены курсивом. - .

Сопоставление структуры настоящего стандарта со структурой указанных международных стандартов приведено в дополнительном приложении Б.

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие с ГОСТ Р 1.5-2004* (подраздел 3.5).
________________
* На территории Российской Федерации в части разд.8 и приложений Ж, И, К действует ГОСТ Р 1.7-2008.

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать сведения о соответствии ссылочных международных стандартов национальным стандартам Российской Федерации, использованным в настоящем стандарте в качестве нормативных ссылок, указанные в приложении В

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

1 Область применения

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты, кроме молока и молочных продуктов, и устанавливает метод выявления в определенной навеске пищевого продукта колиформных бактерий и три метода определения их количества: метод наиболее вероятного числа (НВЧ) и методы посева в или на агаризованные селективно-диагностические среды.

Метод определения НВЧ колиформных бактерий предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта менее 150 или в 1 см жидкого продукта менее 15 клеток колиформных бактерий.

Метод определения количества колиформных бактерий посевом в агаризованные селективно-диагностические среды предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта более 150 или в 1 см жидкого продукта более 15 колониеобразующих единиц (КОЕ) колиформных бактерий.

Метод определения количества колиформных бактерий посевом на агаризованные селективно-диагностические среды предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта более 1500 или в 1 см жидкого продукта более 150 КОЕ колиформных бактерий.

Допускается использование хромогенных сред для предварительного выявления количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий) в масложировой продукции.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 10444.1-84 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе


ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов

ГОСТ 29184-91 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий семейства Enterobacteriaceae

ГОСТ 30425-97 Консервы. Метод определения промышленной стерильности

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 колиформные бактерии: Бактерии, которые при температуре 37 °С ферментируют лактозу с образованием газа по методам, приведенным в настоящем стандарте.

3.2 выявление колиформных бактерий: Определение присутствия или отсутствия колиформных бактерий в определенной массе или объеме продукта в соответствии с настоящим стандартом.

3.3 определение количества колиформных бактерий:

3.3.1 Количество бактерий, содержащееся в 1 см или 1 г продукта, определенное путем посева продукта и (или) его разведений в или на агаризованную селективно-диагностическую среду, подсчете после инкубирования при температуре 37 °С типичных и атипичных колоний и определении возможности бактерий из этих колоний ферментировать лактозу с образованием газа по методам, приведенным в настоящем стандарте.

При необходимости, подтверждают по биохимическим признакам принадлежность выделенных колоний к колиформным бактериям.

3.3.2 Количество бактерий, содержащееся в 1 см или 1 г продукта, определенное по методу НВЧ, указанному в настоящем стандарте.

4 Метод выявления колиформных бактерий и определение количества по методу НВЧ

Сущность методов

Методы выявления и определения НВЧ колиформных бактерий основаны на высеве определенного количества продукта и (или) разведений навески продукта в жидкую селективную среду с лактозой, инкубировании посевов, учете положительных пробирок, пересеве культуральной жидкости в жидкую селективную среду для учета газообразования или пересева, при необходимости, культуральной жидкости на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды для подтверждения по биохимическим и культуральным признакам роста принадлежности выделенных колоний к колиформным бактериям.

4.1 Метод выявления колиформных бактерий

4.1.1 Пробирку с селективной обогатительной средой инокулируют продуктом или разведением навески продукта и инкубируют при температуре 37 °С 24 или 48 ч.

4.1.2 Пробирку с подтверждающей средой инокулируют из пробирки, полученной по 4.1.1, где отмечено образование газа и/или помутнение и инкубируют при температуре 37 °С 24 или 48 ч.

4.1.3 Присутствие колиформных бактерий считается подтвержденным, в случае если отмечено помутнение и образование газа после осмотра пробирки, полученной по 4.1.2.

4.2 Метод НВЧ - определение количества колиформных бактерий

4.2.1 Три пробирки с жидкой селективной обогатительной средой двойной концентрации инокулируют определенным количеством продукта, если исходный продукт жидкий, или определенным количеством исходной суспензии в случае другого продукта.

4.2.2 Три пробирки с жидкой селективной обогатительной средой нормальной концентрации инокулируют определенным количеством продукта и/или разведением продукта, если исходный продукт жидкий, или определенным количеством исходной суспензии и/или разведением в случае другого продукта.

4.2.3 Посевы в пробирках, содержащие обогатительную среду двойной концентрации, инкубируют при температуре 37 °С 24 ч. Посевы в пробирках со средой нормальной концентрации, инкубируют 24 или 48 ч, после этого в этих пробирках отмечают наличие газа и/или помутнения, мешающего выявлению образования газа.

4.2.4 Пробирки с подтверждающей средой инокулируют культурами из пробирок с обогатительной селективной средой двойной концентрации и культурами из пробирок с обогатительной селективной средой нормальной концентрации, в которых отмечено образование газа и/или помутнение.

Посевы в пробирках с подтверждающей средой инкубируют при температуре 37 °С 24 или 48 ч, после этого в пробирках отмечают образование газа.

4.2.5 Наиболее вероятное число колиформных бактерий в 1 см или 1 г пробы продукта (НВЧ) рассчитывают исходя из числа пробирок с подтверждающей средой (4.2.4), показавших образование газа. Для определения наиболее вероятного числа пользуются таблицей ГОСТ 26670.

5 Методы определения количества колиформных бактерий - подсчет колоний

Сущность методов

Методы определения количества колиформных бактерий посевом в или на агаризованные селективно-диагностические среды основаны на высеве определенного количества продукта и/или его разведений в или на агаризованную селективно-диагностическую среду с лактозой, инкубировании посевов, подсчете типичных и атипичных колоний, пересеве типичных и атипичных колоний в жидкую селективную среду с лактозой для определения газообразования, подтверждения, при необходимости, по биохимическим признакам принадлежности выделенных колоний к колиформным бактериям.

5.1 Метод посева в агаризованную селективно-диагностическую среду

5.1.1 Для определения количества колиформных бактерий по 1 см продукта, если продукт жидкий, или по 1 см исходного разведения в случае другого продукта вносят в две стерильные чашки Петри.

Другую пару чашек используют для других количеств - исходной суспензии и/или десятикратных разведений продукта.

Чашки с внесенным в них продуктом или его разведением заливают агаризованной питательной средой.

Посевы в чашках инкубируют при температуре 37 °С в течение 24 ч.

5.1.2 Типичные и атипичные колонии подсчитывают и определяют у бактерий из типичных и атипичных колоний возможность ферментации лактозы.

5.1.3 Число колоний на 1 см или на 1 г продукта рассчитывают по ГОСТ 26670 исходя из числа подтвержденных типичных и атипичных колоний, выросших на чашках.

5.2 Метод посева на агаризованную селективно-диагностическую среду

5.2.1 На подсушенную поверхность агаризованной селективно-диагностической среды в двух чашках Петри наносят 0,1-0,2 см продукта, если продукт жидкий, или исходной суспензии в случае другого продукта.

Другую пару чашек используют для других количеств - исходной суспензии или десятикратных разведений продукта.

Внесенный в чашки продукт или его разведения распределяют по поверхности агаризованной питательной среды стерильным шпателем.

Посевы в чашках инкубируют при температуре 37 °С в течение 24 ч.

5.2.2 Типичные и атипичные колонии подсчитывают и определяют у бактерий из этих колоний возможность ферментации лактозы.

5.2.3 Число колоний на 1 см или на 1 г продукта рассчитывают по ГОСТ 26670 исходя из числа подтвержденных типичных и атипичных колоний, выросших на чашках.

6 Питательные среды и реактивы

Химические вещества, используемые для приготовления питательных сред и реактивов, должны быть аналитического качества.

6.1 Селективная обогатительная среда (лаурил сульфат триптозный бульон)

6.1.1 Состав среды приведен в таблице 1.

а)
Среда двойной концентрации

б)
Среда нормальной концентрации

Ферментативный перевар молока и животных протеинов, г

Лактоза (СНО·НО), г

Двузамещенный фосфорнокислый калий (KНРО), г

Однозамещенный фосфорнокислый калий (KНРО), г

Натрий хлористый, г

Натрий лаурил сульфат, г

6.1.2 Приготовление

При нагревании растворяют компоненты или дегидратированную готовую среду в воде. Устанавливают рН так, чтобы после стерилизации он составлял (6,8±0,2) при температуре 25 °С.

Разливают среду по 10 см в пробирки размером приблизительно 16х160 мм, содержащие пробирки Дархама (поплавки), в случае использования среды нормальной концентрации, и в пробирки размером приблизительно 20х200 мм, не содержащие пробирки Дархама (поплавки), в случае использования среды двойной концентрации.

Стерилизуют среду в автоклаве при температуре (121±1)°С в течение 15 мин. Пробирки Дархама (поплавки) после стерилизации не должны содержать пузырьков воздуха.

6.2 Бриллиантовый зеленый лактозный желчный бульон

ферментативный перевар казеина

(или 2,66 см раствора, приготовленного по 6.2.3, в случае приготовления среды из отдельных компонентов);

6.2.2 Приготовление

При нагревании растворяют компоненты или дегидратированную готовую среду в воде. Устанавливают рН так, чтобы после стерилизации он составлял (7,2±0,2) при температуре 25 °С. Разливают и стерилизуют среду по 6.1.2.

6.2.3 Раствор бриллиантового зеленого

бриллиантовый зеленый

100 см.

6.2.3.2 Приготовление

Бриллиантовый зеленый переносят в фарфоровую ступку и постепенно растворяют в дистиллированной воде. Раствор переливают в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят водой до метки.

Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)

Food products. Methods for detection and quantity determination of coliformes

____________________________________________________________________
Текст Сравнения ГОСТ 31747-2012 с ГОСТ Р 52816-2007 см. по ссылке.
- Примечание изготовителя базы данных.
____________________________________________________________________

Дата введения 2013-07-01

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Государственным научным учреждением "Всероссийский научно-исследовательский институт консервной и овощесушильной промышленности" (ГНУ "ВНИИКОП") на основе аутентичных переводов на русский язык международных стандартов, указанных в пункте 4

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственном советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 1 октября 2012 г. N 51)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Минэкономики Республики Армения

Госстандарт Республики Беларусь

4 Настоящий стандарт модифицирован по отношению к международным стандартам:

- ISO 4831:2006* "Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection and enumeration of coliforms - Most probable number technique", (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод для выявления и подсчета количества колиформ. Метод наиболее вероятного числа);

* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым в тексте, можно получить, обратившись в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

- ISO 4832:2006 "Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the enumeration of coliforms - Colony-count technique", (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод подсчета колиформ. Метод подсчета колоний) в части пищевых продуктов.

При этом дополнительные положения и требования, включенные в текст стандарта для учета потребностей национальной экономики указанных выше государств и особенностей межгосударственной стандартизации, выделены в тексте стандарта курсивом*.

* В бумажном оригинале обозначения и номера стандартов и нормативных документов в разделе "Предисловие" приводятся обычным шрифтом, остальные по тексту документа выделены курсивом. - Примечание изготовителя базы данных.

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие с ГОСТ 1.5 (пункт 3.6).

Сравнение структуры настоящего стандарта со структурой указанных международных стандартов приведено в дополнительном приложении ДА.

Степень соответствия - модифицированная (MOD).

Стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 52816-2007

5 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2012 г. N 1771-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 31747-2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2013 г.

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты, кроме молока и молочных продуктов, и устанавливает метод выявления в определенной навеске пищевого продукта колиформных бактерий и три метода определения их количества: метод наиболее вероятного числа (НВЧ) и методы посева в или на агаризованные селективно-диагностические среды.

Метод определения НВЧ колиформных бактерий предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта менее 150 или в 1 см жидкого продукта менее 15 клеток колиформных бактерий.

Метод определения количества колиформных бактерий посевом в агаризованные селективно-диагностические среды предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта более 150 или в 1 см жидкого продукта более 15 колониеобразующих единиц (КОЕ) колиформных бактерий.

Метод определения количества колиформных бактерий посевом на агаризованные селективно-диагностические среды предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта более 1500 или в 1 см жидкого продукта более 150 КОЕ колиформных бактерий.

Допускается использование хромогенных сред для предварительного выявления количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий) в масложировой продукции.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 10444.1-84 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе

ГОСТ 24104-2001* Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов

ГОСТ 29184-91 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий семейства Enterobacteriaceae

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному справочному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 колиформные бактерии: Бактерии, которые при температуре 37 °С ферментируют лактозу с образованием газа по методам, приведенным в настоящем стандарте.

3.2 выявление колиформных бактерий: Определение присутствия или отсутствия колиформных бактерий в определенной массе или объеме продукта в соответствии с настоящим стандартом

3.3 определение количества колиформных бактерий:

3.3.1 Количество бактерий, содержащееся в 1 см или 1 грамме продукта, определенное путем посева продукта и (или) его разведений в или на агаризованную селективно-диагностическую среду, подсчете после инкубирования при температуре 37 °С типичных и атипичных колоний и определении возможности бактерий из этих колоний ферментировать лактозу с образованием газа по методам, приведенным в настоящем стандарте.

При необходимости, подтверждают по биохимическим признакам принадлежности выделенных колоний к колиформным бактериям.

3.3.2 Количество бактерий, содержащееся в 1 см или 1 грамме продукта, определенное по методу НВЧ, указанному в настоящем стандарте.

4 Метод выявления колиформных бактерий и определения количества по методу НВЧ

Методы выявления и определения НВЧ колиформных бактерий основаны на высеве определенного количества продукта и (или) разведений навески продукта в жидкую селективную среду с лактозой, инкубировании посевов, учете положительных пробирок, пересеве культуральной жидкости в жидкую селективную среду для учета газообразования или пересева, при необходимости, культуральной жидкости на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды для подтверждения по биохимическим и культуральным признакам роста принадлежности выделенных колоний к колиформным бактериям.

4.1 Метод выявления колиформных бактерий

4.1.1 Пробирку с селективной обогатительной средой инокулируют продуктом или разведением навески продукта и инкубируют при температуре 37 °С 24 или 48 ч.

4.1.2 Пробирку с подтверждающей средой инокулируют из пробирки, полученной по 4.1.1, где отмечено образование газа и/или помутнение и инкубируют при температуре 37 °С 24 или 48 ч.

4.1.3 Присутствие колиформных бактерий считается подтвержденным, в случае если отмечено помутнение и образование газа после осмотра пробирки, полученной по 4.1.2.

4.2 Метод НВЧ - определение количества колиформных бактерий

4.2.1 Три пробирки с жидкой обогатительной средой двойной концентрации инокулируют определенным количеством продукта, если исходный продукт жидкий, или определенным количеством исходной суспензии в случае другого продукта.

4.2.2 Три пробирки с жидкой обогатительной средой нормальной концентрации инокулируют определенным количеством продукта и/или разведением продукта, если исходный продукт жидкий, или определенным количеством исходной суспензии и/или разведением в случае другого продукта.

4.2.3 Посевы в пробирках, содержащие обогатительную среду двойной концентрации, инкубируют при температуре 37 °С 24 ч. Посевы в пробирках со средой нормальной концентрации, инкубируют 24 или 48 ч, после этого в этих пробирках отмечают наличие газа и/или помутнения, мешающего выявлению образования газа.

4.2.4 Пробирки с подтверждающей средой инокулируют культурами из пробирок с обогатительной селективной средой двойной концентрации и культурами из пробирок с обогатительной селективной средой нормальной концентрации, в которых отмечено образование газа и/или помутнение.

Посевы в пробирках с подтверждающей средой инкубируют при температуре 37 °С 24 или 48 ч, после этого в пробирках отмечают образование газа.

4.2.5 Наиболее вероятное число колиформных бактерий в 1 см или 1 г пробы продукта (НВЧ) рассчитывают исходя из числа пробирок с подтверждающей средой (4.2.4), показавших образование газа. Для определения наиболее вероятного числа пользуются таблицей ГОСТ 26670.

Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli

Food-stuffs. Methods for detection and determination of Escherichia coli

Дата введения 2002-07-01

1 РАЗРАБОТАН Всероссийским научно-исследовательским институтом консервной и овощесушильной промышленности (ВНИИКОП) и МТК 93 "Продукты переработки плодов и овощей"

ВНЕСЕН Госстандартом России

2 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол N 19 от 24 мая 2001 г.)

За принятие проголосовали:

Наименование национального органа по стандартизации

Госстандарт Республики Беларусь

Госстандарт Республики Казахстан

3 Постановлением Государственного комитета Российской Федерации по стандартизации и метрологии от 27 июля 2001 г. N 297-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 30726-2001 введен в действие в качестве государственного стандарта Российской Федерации с 1 июля 2002 г.

4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

5 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Апрель 2010 г.

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод выявления в определенной навеске пищевого продукта бактерий вида Escherichia coli (E.coli) и три метода определения их количества: метод наиболее вероятного числа (НВЧ) и методы посева в или на агаризованные селективно-диагностические среды.

Выбор метода определения количества E.coli зависит от предполагаемой обсемененности продукта бактериями семейства Enterobacteriaceae и осуществляется в соответствии с требованиями ГОСТ 30518*.

* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 52816-2007.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 10444.1-84 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе

ГОСТ 24104-88* Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия

ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов

ГОСТ 29184-91 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий семейства Enterobacteriaceae

ГОСТ 30425-97 Консервы. Метод определения промышленной стерильности

ГОСТ 30519-97/Р 50480-93* Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella

* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002).

3 Сущность методов

Методы выявления и определения НВЧ E.coli основаны на высеве определенного количества продукта и (или) разведений навески продукта в жидкую селективную среду с лактозой, инкубировании посевов, учете положительных колб (пробирок), пересеве культуральной жидкости на поверхности агаризованной селективно-диагностической среды для дальнейшего подтверждения по биохимическим и культуральным признакам роста принадлежности выделенных колоний E.coli.

Методы определения количества E.coli посевом в или на агаризованные селективно-диагностические среды основаны на высеве определенного количества продукта или его разведений в или на агаризованную селективно-диагностическую среду, инкубировании посевов, подсчете типичных для E.coli колоний, подтверждении по биохимическим и культуральным признакам роста принадлежности выделенных колоний к E.coli.

4 Отбор и подготовка проб

Отбор и подготовка проб - по ГОСТ 26668, ГОСТ 26669.

5 Аппаратура, материалы, реактивы (в т.ч. индикаторы)

Для проведения анализа применяют аппаратуру, материалы и реактивы по ГОСТ 10444.1 со следующими дополнениями:

весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания до 1 кг и допустимой погрешностью ±10 мг (для взвешивания продукта) и весы с наибольшим пределом взвешивания 200 г, 2-го класса точности (для взвешивания реактивов);

микроскоп биологический с приспособлением для фазово-контрастного микроскопирования, обеспечивающий увеличение 900-1000;

поплавки (трубки Дархема);

стекла предметные по ГОСТ 9284;

желчь говяжью сухую или натуральную;

натрий-аммоний фосфорнокислый двузамещенный;

6 Подготовка к анализу

6.1 Приготовление растворов и реактивов

6.1.1 Реактив Кларка: 0,1 г метилового красного растворяют в 300 см этилового спирта и добавляют 200 см дистиллированной воды. Реактив хранят в посуде из темного стекла не более 1 мес при температуре (4±2) °С.

6.1.2 Реактивы Ковача и Эрлиха готовят по ГОСТ 30519.

6.1.3 Спиртовой раствор -нафтола по ГОСТ 30519.

6.1.4 Приготовление индикаторных бумажек для обнаружения индола: 3-5 г парадиметиламинобензальдегида, 10 см концентрированной фосфорной кислоты и 50 см этилового спирта тщательно перемешивают в фарфоровой ступке. В полученном растворе смачивают полоски фильтровальной бумаги, высушивают и нарезают узкими полосками шириной около 1 см. Цвет полученных бумажек - желтый. Индикаторные бумажки хранят не более 1 мес в темном месте.

6.1.5 Раствор гидроокиси калия массовой концентрации 400 г/дм: 40 г гидроокиси калия переносят в мерную колбу вместимостью 100 см и растворяют в дистиллированной воде. Раствор доводят до метки.

6.1.6 Реактивы и растворы для окраски по Граму готовят по ГОСТ 10444.1.

6.2 Приготовление питательных сред

6.2.1 Бульон лактозный с бриллиантовым зеленым и желчью готовят по ГОСТ 30518.

6.2.2 Бульон Мак-Конки готовят по ГОСТ 30518.

6.2.3 Бульон глюкозо-фосфатный, сухой промышленного производства.

6.2.4 Бульон мясо-пептонный с триптофаном: 0,05 г L-триптофана растворяют в 100 см мясо-пептонного бульона, приготовленного по ГОСТ 10444.1, разливают в пробирки по 6-7 см и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 20 мин.

6.2.5 Бульон Хоттингера готовят по ГОСТ 10444.1.

6.2.6 Среду Кесслер готовят по ГОСТ 30518.

6.2.7 Среда Кларка: в 1 дм дистиллированной воды при нагревании растворяют 5,0 г пептона, 5,0 г глюкозы, 5,0 г фосфорнокислого двузамещенного калия, охлаждают до 45-55 °С и устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25 °С (7,2±0,1). Среду разливают по 5-6 см в пробирки и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 15 мин или дробным методом - текучим паром по 30 мин три дня подряд.

6.2.8 Среда (типа Клиглера) для первичной дифференциации энтеробактерий, сухая промышленного производства.

Текст ГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli


ВНЕСЕН Еосстандартом России

2 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол № 19 от 24 мая 2001 г.)

За принятие проголосовали:

Наименование национального органа по стандартизации

Госстандарт Республики Беларусь

Госстандарт Республики Казахстан

3 Постановлением Еосударственного комитета Российской Федерации по стандартизации и метрологии от 27 июля 2001 г. № 297-ст межгосударственный стандарт РОСТ 30726—2001 введен в действие в качестве государственного стандарта Российской Федерации с 1 июля 2002 г.

4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

5 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Апрель 2010 г.

© ИПК Издательство стандартов, 2001 © СТАНДАРТИНФОРМ, 2010

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания на территории Российской Федерации без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli

Food-stuffs. Methods for detection and determination of Escherichia coli

Дата введения 2002—07—01

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод выявления в определенной навеске пищевого продукта бактерий вида Escherichia coli (E.coli) и три метода определения их количества: метод наиболее вероятного числа (НВЧ) и методы посева в или на агари-зованные селективно-диагностические среды.

Выбор метода определения количества E.coli зависит от предполагаемой обсемененности продукта бактериями семейства Enterobacteriaceae и осуществляется в соответствии с требованиями ЕОСТ 30518*.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ЕОСТ 9284—75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 10444.1—84 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе

ГОСТ 24104—88** Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия

ГОСТ 26668—85 Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26669—85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26670—91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов

ГОСТ 29184—91 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий семейства Enterobacteriaceae

ЕОСТ 30425—97 Консервы. Метод определения промышленной стерильности

ГОСТ 30518—97/ГОСТ Р 50474—93 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)

ГОСТ 30519—97/Р 50480—93*** Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella

3 Сущность методов

Методы выявления и определения НВЧ Е.СоИ основаны на высеве определенного количества продукта и (или) разведений навески продукта в жидкую селективную среду с лактозой, инкубировании посевов, учете положительных колб (пробирок), пересеве культуральной жидкости на поверх-

* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 52816—2007.

*** На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 52814—2007 (ИСО 6579:2002).

ность агаризованной селективно-диагностической среды для дальнейшего подтверждения по биохимическим и культуральным признакам роста принадлежности выделенных колоний к E.coli.

Методы определения количества E.coli посевом в или на агаризованные селективно-диагностические среды основаны на высеве определенного количества продукта или его разведений в или на агаризованную селективно-диагностическую среду, инкубировании посевов, подсчете типичных для E.coli колоний, подтверждении по биохимическим и культуральным признакам роста принадлежности выделенных колоний к E.coli.

4 Отбор и подготовка проб

Отбор и подготовка проб — по ЕОСТ 26668, ЕОСТ 26669.

5 Аппаратура, материалы, реактивы (в т. ч. индикаторы)

Для проведения анализа применяют аппаратуру, материалы и реактивы по ЕОСТ 10444.1 со следующими дополнениями:

весы лабораторные общего назначения по ЕОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания до 1 кг и допустимой погрешностью ±10 мг (для взвешивания продукта) и весы с наибольшим пределом взвешивания 200 г, 2-го класса точности (для взвешивания реактивов);

микроскоп биологический с приспособлением для фазово-контрастного микроскопирования, обеспечивающий увеличение 900—1000 х ; петлю бактериологическую; поплавки (трубки Дархема); стекла предметные по ГОСТ 9284;

термостаты с диапазоном рабочих температур 28—55 °С, позволяющие поддерживать заданную температуру с допустимой погрешностью ± 1 °С; бриллиантовый зеленый; генцианвиолет;

желчь говяжью сухую или натуральную; магний сернокислый; метиловый красный; метиловый фиолетовый;

натрий-аммоний фосфорнокислый двузамещенный; сорбит;

феноловый красный; целлобиоза.

6 Подготовка к анализу

6.1 Приготовление растворов и реактивов

6.1.1 Реактив Кларка: 0,1 г метилового красного растворяют в 300 см 3 этилового спирта и добавляют 200 см 3 дистиллированной воды. Реактив хранят в посуде из темного стекла не более 1 мес при температуре (4+2) °С.

6.1.2 Реактивы Ковача и Эрлиха готовят по ГОСТ 30519.

6.1.3 Спиртовой раствор а-нафтола готовят по ГОСТ 30519.

6.1.4 Приготовление индикаторных бумажек для обнаружения индола: 3—5 г парадиметиламино-бензальдегида, 10 см 3 концентрированной фосфорной кислоты и 50 см 3 этилового спирта тщательно перемешивают в фарфоровой ступке. В полученном растворе смачивают полоски фильтровальной бумаги, высушивают и нарезают узкими полосками шириной около 1 см. Цвет полученных бумажек — желтый. Индикаторные бумажки хранят не более 1 мес в темном месте.

6.1.5 Раствор гидроокиси калия массовой концентрации 400 г/дм 3 : 40 г гидроокиси калия переносят в мерную колбу вместимостью 100 см 3 и растворяют в дистиллированной воде. Раствор доводят до метки.

6.1.6 Реактивы и растворы для окраски по Граму готовят по ГОСТ 10444.1.

6.2 Приготовление питательных сред

6.2.1 Бульон лактозный с бриллиантовым зеленым и желчью готовят по ГОСТ 30518.

6.2.2 Бульон Мак-Конки готовят по ГОСТ 30518.

6.2.3 Бульон глюкозо-фосфатный, сухой промышленного производства.

6.2.4 Бульон мясо-пептонный с триптофаном: 0,05 г L-триптофана растворяют в 100 см 3 мясо-пептонного бульона, приготовленного по ГОСТ 10444.1, разливают в пробирки по 6—7 см 3 и стерилизуют при температуре (121+1) °С в течение 20 мин.

6.2.5 Бульон Хоттингера готовят по ГОСТ 10444.1.

6.2.6 Среду Кесслер готовят по ГОСТ 30518.

6.2.7 Среда Кларка: в 1 дм 3 дистиллированной воды при нагревании растворяют 5,0 г пептона,

5,0 г глюкозы, 5,0 г фосфорнокислого двузамещенного калия, охлаждают до 45—55 °С и устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25 °С (7,2+0,1). Среду разливают по 5—6 см 3 в пробирки и стерилизуют при температуре (121+1) °С в течение 15 мин или дробным методом — текучим паром по 30 мин три дня подряд.

6.2.8 Среда (типа Кл игл ера) для первичной дифференциации энтеробактерий, сухая промышленного производства.

6.2.9 Среда Козера: в 1 дм 3 дистиллированной воды при нагревании растворяют 1,5 г фосфорнокислого двузамещенного натрия-аммония, 1,0 г фосфорнокислого однозамещенного калия, 0,2 г сернокислого магния и 2,5 г лимоннокислого натрия, охлаждают до 45—55 °С и устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял (7,2+0,1) при 25 °С. Среду стерилизуют при температуре (121+1) °С в течение 15 мин.

После стерилизации к 1 дм 3 среды добавляют 10 см 3 спиртового раствора бромтимолового синего массовой концентрации 5 г/дм 3 , затем среду разливают по 6—7 см 3 в стерильные пробирки. Приготовленная среда имеет оливково-зеленый цвет.

6.2.10 Среда Симмонса: к среде Козера перед стерилизацией добавляют 18—20 г агара. Среду после стерилизации и добавления раствора бромтимолового синего разливают по 6—7 см 3 в стерильные пробирки или в чашки Петри. Среду в пробирках скашивают.

Цитратный агар Симмонса выпускается промышленностью в сухом виде.

6.2.11 Среды с углеводами (среды Гисса) готовят по ГОСТ 10444.1 или используют для приготовления сухие среды промышленного производства.

Допускается сухую среду Гисса с углеводами готовить на основе сухого питательного агара: к 7,3 г сухого питательного агара прибавляют 3,65 г соответствующего углевода (глюкозы, лактозы, целлобиозы или сорбита), 0,38 г натрия фосфорнокислого двузамещенного, 3,65 г натрия хлористого, 0,02 г бромкрезолового пурпурового. Смесь тщательно перемешивают в фарфоровой ступке и хранят герметично закрытой в темном месте. Полученные 15 г порошка рассчитаны на приготовление 1 дм 3 среды. При приготовлении среды порошок тщательно размешивают в дистиллированной воде, кипятят 1—2 мин, не допуская пригорания, фильтруют, разливают по 5—6 см 3 в пробирки и стерилизуют при температуре (110+1) °С в течение 20 мин или дробным методом — текучим паром по 30 мин три дня подряд. Приготовленная среда имеет фиолетовый цвет.

6.2.12 Среда Эндо, сухая промышленного производства.

6.2.13 Трехсахарный агар готовят по ГОСТ 30519.

6.2.14 Среды из сухих препаратов промышленного производства готовят по прописям, указанным на этикетках.

6.2.15 Тест-системы для биохимической идентификации промышленного производства.

7 Проведение анализа

7.1 Посевы для определения количества E.coli в 1 г (см 3 ) продукта и выявления E.coli в определенной навеске продукта проводят по ЕОСТ 30518.

Посевы на агаризованной и жидких средах инкубируют при температуре (36+1) °С в течение 24—48 ч. Чашки Петри инкубируют дном вверх. Посевы просматривают через (24+3) ч, отмечают положительные посевы в жидких средах, а окончательный учет проводят через (48+3) ч.

Положительными считают посевы в жидкие среды, в которых имеет место рост микроорганизмов, проявляющийся в помутнении среды, образовании газа, подкислении среды (то есть изменении цвета среды).

7.2 Для подтверждения принадлежности микроорганизмов, выросших в жидких средах, к E.coli делают пересевы по ГОСТ 26670 на поверхность среды Эндо, приготовленной по 6.2.12.

Посевы инкубируют при температуре (36+1) °С в течение (24+3) ч.

7.3 Посевы на агаризованной среде по 7.1 и 7.2 просматривают после инкубирования и отмечают рост характерных для E.coli колоний.

На среде Эндо E.coli образуют колонии от бледно-розового до темно-красного цвета часто с металлическим блеском.

Для дальнейшего подтверждения принадлежности выросших колоний к E.coli отбирают по три колонии каждого типа.

Из отобранных колоний приготавливают мазки, окрашивают их по Ераму по ЕОСТ 30425. Параллельно в каждой отобранной колонии у бактерий по ЕОСТ 29184 определяют отсутствие оксидазы.

Оксидазоотрицательные бактерии пересевают на поверхность мясо-пептонного агара или среды, приготовленной из сухого питательного агара. Посевы инкубируют до появления видимого роста при температуре (36+1) °С.

7.4 У оксидазоотрицательных грамотрицательных культур (палочки размером 1, Н1,5 х 2^6 мкм), выросших в пересевах по 7.3, определяют возможность образования индола, ацетоина, сероводорода, утилизации цитрата, интенсивность ферментации углеводов с образованием кислоты, ферментацию сорбита, глюкозы и лактозы.

7.4.1 Определение образования индола

Культуру высевают в пробирку с бульоном Хоттингера, приготовленным по 6.2.5, или мясо-пептонным бульоном с триптофаном, приготовленным по 6.2.4. Под пробку в пробирку помещают полоску индикаторной бумажки, приготовленной по 6.1.4. Посевы инкубируют при температуре (36+1) °С в течение 24 ч. Если за время инкубирования посевов в среде накапливается индол, то желтый цвет индикаторной бумажки меняется на цвет от сиренево-розового до интенсивного малинового.

Образование индола можно определить с помощью реактивов Эрлиха и Ковача, приготовленных по 6.1.2. Для этого к 5 см 3 24-часовой культуры добавляют 1 см 3 одного из реактивов. Образование красного слоя на поверхности культуральной жидкости указывает на положительную реакцию.

Е.соИ образует индол.

7.4.2 Определение образования ацетоина (реакция Фогес-Проскауэра)

Культуру высевают в пробирки со средой Кларка, приготовленной по 6.2.7. Посевы инкубируют при температуре (36+1) °С в течение 48 ч.

После инкубирования посевов к 1 см 3 отобранной культуральной жидкости прибавляют 0,6 см 3 раствора а-нафтола, приготовленного по 6.1.3, и 0,2 см 3 раствора гидроокиси калия, приготовленного по 6.1.5. После прибавления каждого реактива пробирку встряхивают. Появление розового окрашивания через 15—60 мин указывает на положительную реакцию.

Е.соИ не образует ацетоин.

7.4.3 Определение утилизации цитрата

Культуру высевают в пробирки со средой Козера, приготовленной по 6.2.9, или на поверхность среды Симмонса, приготовленной по 6.2.10. Посевы инкубируют при температуре (36+1) °С в течение 24—48 ч. Изменение оливково-зеленого цвета сред на васильковый, синий указывает на положительную реакцию.

Е.соИ не утилизирует цитрат.

7.4.4 Определение интенсивности ферментации углеводов с образованием кислоты (реакция с метил-рот)

Культуру высевают в пробирки с глюкозо-фосфатным бульоном или средой Кларка или используют посевы после отбора 1 см 3 культуральной жидкости по 7.4.2. Посевы инкубируют при температуре (36+1) °С в течение 48 ч. К 5 см 3 культуральной жидкости прибавляют 5—10 капель реактива Кларка, приготовленного по 6.1.1. Появление через 1 мин красного цвета культуральной жидкости указывает на ферментацию углеводов до pH ниже 5,0.

Е.соИ интенсивно ферментирует углеводы (реакция с метил-рот положительная).

7.4.5 Определение ферментации сорбита, глюкозы и лактозы

Культуру высевают в среды Еисса с сорбитом или глюкозой, или лактозой приготовленные по 6.2.11. Посевы инкубируют при температуре (36+1) °С в течение 24 ч, а на среде Еисса с лактозой при температуре (44+1) °С в течение 24 ч.

E.coli ферментирует глюкозу, лактозу и сорбит.

При ферментации глюкозы образуется газ. Ферментацию глюкозы можно учитывать в засеянных косяках трехсахарного агара или среды Кл игл ера по изменению цвета столбика среды и образованию в нем газа.

Ферментацию лактозы учитывают по изменению цвета скошенной поверхности среды Кл игл ера.

Ферментацию сорбита учитывают по изменению цвета среды.

У культур типичных для E.coli по всем изученным признакам, но не ферментирующим сорбит, изучают возможность ферментации целлобиозы на среде, приготовленной по 6.2.11, при температуре (36+1) °С в течение 24 ч. E.coli не ферментирует целлобиозу, цвет среды не меняется.

7.4.6 Определение образования сероводорода

Образование сероводорода учитывают в посевах на среду Кл игл ера или трехсахарный агар после инкубирования посевов при температуре (36+1) °С в течение 24 ч. Почернение в столбике среды указывает на образование сероводорода.

E.coli не образует сероводород.

7.4.7 Для биохимической идентификации выявленных бактерий допускается использование тест-систем промышленного производства.

8 Обработка результатов анализа

8.1 Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

8.2 К бактериям E.coli относят оксидазоотрицательные не образующие спор грамотрицательные палочки, обладающие способностью ферментации лактозы при температуре (44+1) °С, ферментирующие глюкозу и сорбит, дающие положительную реакцию с метил-рот, образующие индол, необразующие ацетоин и не утилизирующие цитрат. Бактерии не ферментирующие сорбит и целлобиозу, но по другим биохимическим признакам давшие типичные для E.coli реакции, относят к сорбитотрицатель-ным штаммам E.coli. Основные дифференцирующие признаки видов рода Escherichia приведены в приложении А.

8.3 Посевы навески продукта в жидкие среды считают положительными, если при последующем пересеве и подтверждении характерных колоний хотя бы в одной колонии будут обнаружены Е.соИ.

8.4 НВЧ E.coli в 1 г (см 3 ) продукта определяют по количеству положительных колб (пробирок) по ЕОСТ 26670.

8.6 Результаты определения количества Е.соИ и выявления их в определенной навеске продукта записывают по ЕОСТ 26670.

Читайте также: