Гост лабораторная диагностика бруцеллеза животных
Обновлено: 12.05.2024
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА
Animals. Laboratory Diagnostics of Brucellosis. Bacteriological methods
Дата введения 2017-01-01
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГБУ "ВГНКИ")
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт)
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 12 ноября 2015 г. N 82-П)
За принятие проголосовали:
Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97
Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Минэкономики Республики Армения
Госстандарт Республики Беларусь
Госстандарт Республики Казахстан
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 24 ноября 2015 г. N 1949-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 33675-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2017 г.
5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
ВНЕСЕНА поправка, опубликованная в ИУС N 3, 2022 год, введенная в действие с 12.10.2021
Поправка внесена изготовителем базы данных
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на все виды млекопитающих животных и устанавливает бактериологические методы лабораторной диагностики бруцеллеза.
1 Данные методы применимы ко всем представителям рода Brucella.
2 Бактерии рода Brucella относятся ко II группе патогенности.
Настоящий стандарт также устанавливает общие требования к проведению молекулярно-генетических методов диагностики бруцеллеза (ПЦР).
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 3-88 Перчатки хирургические резиновые. Технические условия
ГОСТ 12.0.004-90 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения
ГОСТ 12.4.011-89 Система стандартов безопасности труда. Средства защиты работающих. Общие требования и классификация
ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия
ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания
ГОСТ 975-88 Глюкоза кристаллическая гидратная. Технические условия
ГОСТ 2222-95 Метанол технический. Технические условия
ГОСТ 4159-79 Йод кристаллический. Технические условия
ГОСТ 4232-74 Калий йодистый. Технические условия
ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия
ГОСТ 4919.1-77 Реактивы и особо чистые вещества. Методы приготовления растворов индикаторов
ГОСТ 5962-2013 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия
ГОСТ 6259-75 Реактивы. Глицерин. Технические условия
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ ISO 7864-2011 Иглы инъекционные однократного применения стерильные
ГОСТ ISO 7886-1-2011 Шприцы инъекционные однократного применения стерильные. Часть 1. Шприцы для ручного использования
ГОСТ 8074-82 Микроскопы инструментальные. Типы, основные параметры и размеры. Технические требования
ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия
ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия
ГОСТ 9656-75 Реактивы. Кислота борная. Технические условия
ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
ГОСТ 13739-78 Масло иммерсионное для микроскопии. Технические требования. Методы испытаний
ГОСТ 13805-76 Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей. Технические условия
ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 16280-2002 Агар пищевой. Технические условия
ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий
ГОСТ 17206-96 Агар микробиологический. Технические условия
ГОСТ 18704-78 Кислота борная. Технические условия
ГОСТ 21241-89 Пинцеты медицинские. Общие технические условия
ГОСТ 22967-90 Шприцы медицинские инъекционные многократного применения. Общие технические требования и методы испытаний
ГОСТ 22280-76 Натрий лимоннокислый 5,5-водный. Технические условия
ГОСТ 23519-93 Фенол синтетический технический. Технические условия
ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 29230-91 (ИСО 835-4-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 4. Пипетки выдувные
ГОСТ 32275-2013 Перчатки медицинские анатомические одноразовые. Технические требования
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Термины, определения и сокращения
3.1 В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:
3.1.1 бруцеллез: Инфекционное заболевание животных и человека, вызываемое бактериями рода Brucella семейства Brucellaceae порядка Rhizobiales класса -Proteocteria.
3.1.2 антиген бруцеллезный: Поверхностные или цитоплазматические полисахаридно-белковые структуры бруцелл, на которые животными вырабатываются специфические антитела.
3.1.3 реакция агглютинации: Метод выявления специфических агглютинирующих антител в сыворотке крови животных.
3.1.4 биовар: Внутривидовая систематическая категория для обозначения штамма или совокупности штаммов бактерий со сходными ферментативными или антигенными свойствами, отличающимися от других вариантов этого вида.
3.1.5 антитела бруцеллезные (иммуноглобулины, ИГ, lg): Особый класс гликопротеинов в сыворотке крови и тканевой жидкости животных в виде растворимых молекул, присутствующих на поверхности В-лимфоцитов в виде мембраносвязанных рецепторов и обладающих способностью избирательно связываться с антигенами конкретных бруцелл, обусловленной предварительным взаимодействием иммунной системы организма с возбудителем.
3.1.6 полимеразная цепная реакция (ПЦР): Молекулярно-генетический метод увеличения малых концентраций определенных фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).
3.1.7 стандарт мутности: Взвесь частиц стекла Pyrex в запаянной стеклянной пробирке, соответствующая 10 (5) международным единицам мутности.
Примечание - Стандарт мутности используют для визуального определения оптической концентрации бактериальных взвесей.
3.1.8 сыворотки монорецепторные A и M: Антивидовые бруцеллезные сыворотки крови кроликов к рецепторам культур Brucella abortus и Brucella melitensis.
Примечание - Монорецепторные сыворотки A и M используют для дифференциации культур бруцелл в пробирочной реакции агглютинации.
3.1.9 сыворотка S-бруцеллезная: Сыворотка крови кроликов, содержащая S-бруцеллезные антитела.
Примечание - S-бруцеллезную сыворотку используют для идентификации культур бруцелл в пластинчатой реакции агглютинации.
3.1.10 сыворотка R-бруцеллезная: Сыворотка крови кроликов, содержащая R-бруцеллезные антитела.
Примечание - R-бруцеллезную сыворотку используют для идентификации культур бруцелл в пластинчатой реакции агглютинации.
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА
Animals. Laboratory diagnostics of brucellosis. Allergy method
Дата введения 2020-07-01
Предисловие
Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГБУ "ВГНКИ")
2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 454 "Охрана жизни и здоровья животных и ветеринарно-санитарная безопасность продуктов животного происхождения и кормов"
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 сентября 2019 г. N 122-П)
За принятие проголосовали:
Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97
Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Минэкономики Республики Армения
Госстандарт Республики Беларусь
Госстандарт Республики Казахстан
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 октября 2019 г. N 1032-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34579-2019 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2020 г.
Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.
В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге "Межгосударственные стандарты"
ВНЕСЕНА поправка, опубликованная в ИУС N 3, 2022 год, введенная в действие с 12.10.2021
Поправка внесена изготовителем базы данных
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на крупный рогатый и мелкий рогатый скот, северных оленей, свиней и устанавливает аллергический метод лабораторной диагностики бруцеллеза.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ 3 Перчатки хирургические резиновые. Технические условия
ГОСТ 12.0.004 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения
ГОСТ 12.1.008 Система стандартов безопасности труда. Биологическая безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.4.011 Система стандартов безопасности труда. Средства защиты работающих. Общие требования и классификация
ГОСТ 5962 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия
ГОСТ 6709 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 9656 Реактивы. Кислота борная. Технические условия
ГОСТ 18704 Кислота борная. Технические условия
ГОСТ 21241 Пинцеты медицинские. Общие технические требования и методы испытаний
ГОСТ 22967 Шприцы медицинские инъекционные многократного применения. Общие технические требования и методы испытаний
ГОСТ 25134 Бруцеллин ВИЭВ. Технические условия
ГОСТ 25377 Иглы инъекционные многократного применения. Технические условия
ГОСТ 32275 Перчатки медицинские анатомические одноразовые. Технические требования
ГОСТ ИСО 7864 Иглы инъекционные однократного применения стерильные
ГОСТ ИСО 7886-1* Шприцы инъекционные однократного применения стерильные. Часть 1. Шприцы для ручного использования
* Вероятно, ошибка оригинала. Следует читать: ГОСТ ISO 7886-1. - Примечание изготовителя базы данных.
ГОСТ ИСО/МЭК 17025 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий
3 Термины и определения
В настоящем стандарте применены термины с соответствующими определениями:
бруцеллез: Инфекционное заболевание животных и человека, вызываемое бактериями рода Brucella семейства Brucellaceae порядка Rhizobiates класса -Proteocteria.
бруцеллин ВИЭВ: Аллерген, представляющий собой стерильную жидкость, содержащую специфические вещества белковой и липополисахаридной природы, извлеченные из бруцелл.
3.3 реакция гиперчувствительности замедленного типа: Иммунопатологическая реакция, основанная на взаимодействии Т-лимфоцитов, активированных в результате сенсибилизации организма человека или животного, с гомологичным антигеном.
4 Условия выполнения исследований и требования безопасности
4.1 Условия выполнения исследований
4.1.1 Требования к персоналу - по ГОСТ ИСО/МЭК 17025.
4.1.2 К проведению исследований допускаются квалифицированные сотрудники, владеющие методом аллергической диагностики.
4.2 Требования безопасности
4.2.1 Общие требования безопасности при проведении работ с биологическими объектами должны соответствовать ГОСТ 12.1.008.
4.2.2 Средства защиты работающих должны соответствовать требованиям ГОСТ 12.4.011.
4.2.3 Обучение персонала безопасности труда - в соответствии с ГОСТ 12.0.004.
4.2.4 Обеззараживание биологического материала, а также использованных индивидуальных средств защиты, инструментов и т.д. проводят путем кипячения в течение 30 мин или автоклавирования в течение 1 ч при давлении 0,20 МПа и температуре (132±2)°С.
5 Материалы, реактивы, животные
Спирт этиловый по ГОСТ 5962.
Кислота борная по ГОСТ 9656 или ГОСТ 18704, 3%-ный раствор.
Бруцеллин ВИЭВ по ГОСТ 25134.
Бруцеллоовин по нормативному документу государства, принявшего стандарт.
Иглы инъекционные по ГОСТ ISO 7864.
Иглы инъекционные по ГОСТ 25377.
Перчатки анатомические медицинские одноразовые по ГОСТ 32275.
Перчатки хирургические резиновые по ГОСТ 3.
Пинцеты медицинские по ГОСТ 21241.
Шприцы медицинские инъекционные многократного применения по ГОСТ 22967.
Шприцы медицинские инъекционные однократного применения по ГОСТ ISO 7886-1.
Инъекторы безыгольные для внутрикожного введения.
Животные, не вакцинированные против бруцеллеза.
Допускается применение других реактивов и материалов по качеству не ниже указанных.
6 Аллергический метод диагностики бруцеллеза у животных, больных бруцеллезом и инфекционным эпидидимитом
6.1 Сущность метода
Метод аллергической диагностики основан на выявлении у больных бруцеллезом животных реакции гиперчувствительности замедленного типа к специфическому аллергену.
6.2 Подготовка к исследованию
Аллергический метод применяют для исследования на бруцеллез крупного и мелкого рогатого скота, северных оленей и свиней с четырехмесячного возраста, не вакцинированных против бруцеллеза, а также для выявления инфекционного эпидидимита баранов (инфекционной болезни овец, вызываемой Brucella ovis).
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА
Animals. Laboratory Diagnostics of Brucellosis. Bacteriological methods
Дата введения 2017-01-01
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГБУ "ВГНКИ")
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт)
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 12 ноября 2015 г. N 82-П)
За принятие проголосовали:
Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97
Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Минэкономики Республики Армения
Госстандарт Республики Беларусь
Госстандарт Республики Казахстан
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 24 ноября 2015 г. N 1949-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 33675-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2017 г.
5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
ВНЕСЕНА поправка, опубликованная в ИУС N 3, 2022 год, введенная в действие с 12.10.2021
Поправка внесена изготовителем базы данных
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на все виды млекопитающих животных и устанавливает бактериологические методы лабораторной диагностики бруцеллеза.
1 Данные методы применимы ко всем представителям рода Brucella.
2 Бактерии рода Brucella относятся ко II группе патогенности.
Настоящий стандарт также устанавливает общие требования к проведению молекулярно-генетических методов диагностики бруцеллеза (ПЦР).
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 3-88 Перчатки хирургические резиновые. Технические условия
ГОСТ 12.0.004-90 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения
ГОСТ 12.4.011-89 Система стандартов безопасности труда. Средства защиты работающих. Общие требования и классификация
ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия
ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания
ГОСТ 975-88 Глюкоза кристаллическая гидратная. Технические условия
ГОСТ 2222-95 Метанол технический. Технические условия
ГОСТ 4159-79 Йод кристаллический. Технические условия
ГОСТ 4232-74 Калий йодистый. Технические условия
ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия
ГОСТ 4919.1-77 Реактивы и особо чистые вещества. Методы приготовления растворов индикаторов
ГОСТ 5962-2013 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия
ГОСТ 6259-75 Реактивы. Глицерин. Технические условия
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ ISO 7864-2011 Иглы инъекционные однократного применения стерильные
ГОСТ ISO 7886-1-2011 Шприцы инъекционные однократного применения стерильные. Часть 1. Шприцы для ручного использования
ГОСТ 8074-82 Микроскопы инструментальные. Типы, основные параметры и размеры. Технические требования
ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия
ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия
ГОСТ 9656-75 Реактивы. Кислота борная. Технические условия
ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
ГОСТ 13739-78 Масло иммерсионное для микроскопии. Технические требования. Методы испытаний
ГОСТ 13805-76 Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей. Технические условия
ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 16280-2002 Агар пищевой. Технические условия
ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий
ГОСТ 17206-96 Агар микробиологический. Технические условия
ГОСТ 18704-78 Кислота борная. Технические условия
ГОСТ 21241-89 Пинцеты медицинские. Общие технические условия
ГОСТ 22967-90 Шприцы медицинские инъекционные многократного применения. Общие технические требования и методы испытаний
ГОСТ 22280-76 Натрий лимоннокислый 5,5-водный. Технические условия
ГОСТ 23519-93 Фенол синтетический технический. Технические условия
ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 29230-91 (ИСО 835-4-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 4. Пипетки выдувные
ГОСТ 32275-2013 Перчатки медицинские анатомические одноразовые. Технические требования
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Термины, определения и сокращения
3.1 В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:
3.1.1 бруцеллез: Инфекционное заболевание животных и человека, вызываемое бактериями рода Brucella семейства Brucellaceae порядка Rhizobiales класса -Proteocteria.
3.1.2 антиген бруцеллезный: Поверхностные или цитоплазматические полисахаридно-белковые структуры бруцелл, на которые животными вырабатываются специфические антитела.
3.1.3 реакция агглютинации: Метод выявления специфических агглютинирующих антител в сыворотке крови животных.
3.1.4 биовар: Внутривидовая систематическая категория для обозначения штамма или совокупности штаммов бактерий со сходными ферментативными или антигенными свойствами, отличающимися от других вариантов этого вида.
3.1.5 антитела бруцеллезные (иммуноглобулины, ИГ, lg): Особый класс гликопротеинов в сыворотке крови и тканевой жидкости животных в виде растворимых молекул, присутствующих на поверхности В-лимфоцитов в виде мембраносвязанных рецепторов и обладающих способностью избирательно связываться с антигенами конкретных бруцелл, обусловленной предварительным взаимодействием иммунной системы организма с возбудителем.
3.1.6 полимеразная цепная реакция (ПЦР): Молекулярно-генетический метод увеличения малых концентраций определенных фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).
3.1.7 стандарт мутности: Взвесь частиц стекла Pyrex в запаянной стеклянной пробирке, соответствующая 10 (5) международным единицам мутности.
Примечание - Стандарт мутности используют для визуального определения оптической концентрации бактериальных взвесей.
3.1.8 сыворотки монорецепторные A и M: Антивидовые бруцеллезные сыворотки крови кроликов к рецепторам культур Brucella abortus и Brucella melitensis.
Примечание - Монорецепторные сыворотки A и M используют для дифференциации культур бруцелл в пробирочной реакции агглютинации.
3.1.9 сыворотка S-бруцеллезная: Сыворотка крови кроликов, содержащая S-бруцеллезные антитела.
Примечание - S-бруцеллезную сыворотку используют для идентификации культур бруцелл в пластинчатой реакции агглютинации.
3.1.10 сыворотка R-бруцеллезная: Сыворотка крови кроликов, содержащая R-бруцеллезные антитела.
Примечание - R-бруцеллезную сыворотку используют для идентификации культур бруцелл в пластинчатой реакции агглютинации.
Цель занятий. Ознакомить студентов со свойствами возбудителей и лабораторной диагностикой бруцеллеза и туляремии, а также биопрепаратами.
Оборудование и материалы. Единый бруцеллезный антиген, антиген для кольцевой реакции с молоком, роз-бенгал антиген, позитивная бруцеллезная сыворотка, негативная сыворотка, физиологический раствор, содержащий 0,5 % фенола, серологические пробирки, штативы, мерные пипетки, красители для окраски по Граму, Козловскому (Стампу), пробы молока.
Бруцеллез. Это хроническая инфекционная болезнь, проявляющаяся абортами, задержанием последа, эндометритами и расстройством воспроизводительной функции животных. Восприимчивы многие виды сельскохозяйственных животных и человек.
Возбудитель — бактерии рода Brucella: В. melitensis (три биовара) — основной хозяин овцы и козы; В. abortus (девять биоваров) — основной хозяин крупный рогатый скот; В. suis (четыре биовара) — основной хозяин свиньи, а также северные олени и зайцы; В. ovis— основной хозяин овцы; В. neotomae — основной хозяин древесные крысы; В. canis — основной хозяин собаки.
Лабораторная диагностика бруцеллеза основана на результатах бактериологических и серологических исследований.
Бактериологическое исследование в основном применяют при первичной постановке диагноза на бруцеллез в ранее благополучных хозяйствах.
Материал для исследования. В лабораторию направляют пробы крови (сыворотки) для серологических исследований, абортированный плод с плодными оболочками, околоплодную жидкость, истечения из родовых путей или желудок плода, кусочки печени, селезенки, пробы молока (последние порции). При убое животных берут паренхиматозные органы, лимфатические узлы, пораженные суставы, у самцов — семенники. Объектом исследования могут быть молочные продукты (брынза, сыр, масло и др.), объекты внешней среды.
Микроскопия препаратов из исходного материала. Мазки из материала окрашивают по Граму и одним из специальных методов (по Козловскому, Стампу и др.). Бруцеллы — грамотрицательные короткие палочковидные или кокковидные бактерии размером 0,5. 1,5 мкм, без жгутиков, спор не образуют, формируют микрокапсулу. В окрашенном препарате располагаются одиночно, реже парами, короткими цепочками.
Окраска по методу Козловского: препарат окрашивают 2%-м водным раствором сафранина 2 мин, промывают водой, докрашивают 1%-м водным раствором малахитовой зелени 1 мин, промывают водой. Микроскопическая картина: бруцеллы красные, остальные бактерии зеленые.
Окраска по методу Стампа: фиксированный на пламени мазок окрашивают фуксином Пфейффера 10 мин, промывают водой, обрабатывают 0,5%-м водным раствором уксусной кислоты 30 с, затем препарат промывают водой и докрашивают 1%-м водным раствором метиленового синего 20. 30 с. Микроскопическая картина: бруцеллы красные, другие бактерии синие.
Выделение и идентификация культуры возбудителя. Бруцеллы — аэробы, микроаэрофилы, температурный оптимум 37. 38 °С, рН 6,8. 7,2. Материал засевают на специальные питательные среды: мясо-пептонный агар и бульон, печеночно-глюкозо-глицериновый агар и бульон, картофельный агар, эритрит-агар, сывороточ-но-декстрозный агар и др. Печеночные среды включают в себя отвар печени. Картофельный агар готовят на отваре картофеля, глюкозу и глицерин добавляют в среды соответственно в количестве 1 % и 2. 3 %. Эритрит-агар содержит вещество (эритрит), стимулирующее рост бруцелл. В состав сывороточно-декстрозно-го агара помимо обычной питательной основы входит 10 % сыворотки крови и 1 % декстрозы.
Некоторые виды бруцелл растут при повышенном содержании в атмосфере оксида углерода (IV) (В. abortus, В. ovis). Так как неизвестно, каким видом бруцелл заражен исследуемый материал, половину посевов инкубируют в обычной атмосфере, другую — в атмосфере, содержащей 10. 15% оксида углерода (IV).
Посевы культивируют в течение ЗО сут, периодически просматривая. Рост бруцелл чаще появляется на 7. 10-е сутки, иногда позже.
На плотных средах возбудитель формирует мелкие, прозрачные, круглые, с ровными краями, гладкой поверхностью, с голубоватым оттенком колонии (S-форма), возможно появление шероховатых колоний (R-форма) (рис. 99, 100). По мере старения колонии мутнеют и за счет пигментообразования могут темнеть. На жидких питательных средах рост бруцелл проявляется равномерным помутнением среды, образованием голубоватого пристеночного кольца, позднее формируется небольшой осадок.
У выросших культур изучают морфологию и тинкториальные свойства клеток в мазках, окрашенных по методам Грама, Козловского.
Культуру идентифицируют серологически в РА на стекле с позитивной бруцеллезной сывороткой, разведенной в соотношении 1:50. Виды В. melitensis, В. abortus, В. suis антигенно родственны, поэтому их клетки агглютинируют в стандартной бруцеллезной сыворотке. Для идентификации В. ovis кроликов иммунизируют выделенной культурой и затем кроличью сыворотку исследуют в РДСК со стандартным овисным антигеном (В. ovis) — должна быть четкая положительная реакция, если это культура В. ovis.
Рис. 100. Бруцеллы в чистой культуре
Для определения видовой принадлежности у выделенных культур бруцелл изучают потребность в оксиде углерода (IV), образование сероводорода, способность к росту на питательных средах с тионином и фуксином, чувствительность к бруцеллезным бактериофагам, ферментацию аминокислот, углеводов, а также агглютинабильность с моноспецифическими сыворотками против отдельных клеточных антигенов бруцелл (А, М, R). Некоторые из дифференцирующих характеристик приведены в таблице 30.
Биопроба. Это эффективный метод обнаружения бруцелл в исследуемом материале, особенно загрязненном. Морских свинок перед заражением исследуют в РА, в опыт берут животных, в сыворотке которых не обнаружены антитела к возбудителю. Тканевый материал в виде суспензии (1 : 10) в объеме 1 мл вводят подкожно. О результате биопробы судят по данным исследования сыворотки крови на 15, 25 и 40-й день после заражения (животные не погибают). Появление антител в титре 1 : 10 и более оценивают как положительный результат. Реагирующих животных убивают и подвергают бактериологическому исследованию.
Серологическая диагностика: при массовых диагностических исследованиях ставят пробирочную РА, роз-бенгал пробу (РА на стекле), РСК, РДСК, кольцевую реакцию с молоком (КР).
Пробирочная РА. Реакцию ставят в объеме 1 мл. Сыворотки крови крупного рогатого скота, лошадей, собак, пушных зверей, верблюдов разводят физиологическим раствором, содержащим 0,5 % фенола; сыворотки крови овец коз, буйволов разводят 5%-м, а сыворотки оленей — 10%-м фенолизированным физиологическим раствором. Сыворотки крови крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов исследуют в разведениях от 1 : 50 до 1 :400; овец, коз, свиней, буйволов, оленей, собак — в разведениях 1 : 25 и более; пушных зверей — 1 : 10 и более. При массовых исследованиях сыворотки крови исследуют в двух первых разведениях. После приготовления разведений сыворотки в объеме 0,5 мл в каждую пробу добавляют 0,5 мл разведенного до концентрации клеток 5*10 8 /мл единого бруцеллезного антигена (при этом разведения удваиваются), компоненты перемешивают встряхиванием, штатив с пробирками помещают в термостат при 37. 38 ºС на 18. 20 ч, затем оставляют на несколько часов при комнатной температуре. Результат учитывают по общепринятой системе (см. тему 15). В качестве контролей параллельно исследуют заведомо положительную и отрицательную сыворотки.
В разных странах для пробирочной РА готовят антигены, различающиеся по агглютинабильности, что делает несопоставимыми титры, полученные при исследованиях. Поэтому рекомендовано выражать результат пробирочной РА в международных единицах (ME). Для этого предложена международная стандартная бруцеллезная сыворотка, по отношению к которой и определяют активность национальных антигенов. Активность этой сыворотки установлена в 1000 ME. Например, с каким-то национальным антигеном международная сыворотка в пробирочной РА показывает титр 1 : 500, значит, если с этим антигеном какая-либо другая сыворотка дает титр РА 1 : 500, то она содержит 1000 МЕ, если вторая исследуемая сыворотка показывает титр 1 :400, то ее активность в международных единицах составит 1000 • 400/500 = 800 ME и т.д. В каждой стране разработана национальная бруцеллезная стандартная сыворотка, соответствующая по активности международной. По указанным критериям положительные титры РА на бруцеллез для крупного рогатого скота составляют 100 ME (50 ME — сомнительный результат), для овец, коз, буйволов, оленей и собак — 50 ME (25 ME — сомнительный результат).
Роз-бенгал проба (РБП). В отличие от пробирочной РА данная серологическая реакция является качественной. С ее помощью в сжатые сроки исследуют большое количество животных. Сыворотки, давшие положительную РБП, дополнительно исследуют в пробирочной РА и РСК. Техника постановки РБП изложена в теме 15. В РБП исследуют неразведенную сыворотку крови, влияние нормальных антител на специфичность реакции нивелируется использованием антигена с кислыми значениями рН, при которых нормальные антитела с низкой авидностью не реагируют с антигеном, что обеспечивает достаточно высокую специфичность РБП.
РСК. Реакцию ставят в объеме 1 мл. Предварительно инакти-вированные в течение 30 мин сыворотки крови (лошадей при 56. 58 °С, крупного рогатого скота при 60. 62 °С, свиней при 60. 62°С, овец и коз при 58. 60°С) исследуют в разведении 1:5. 1:10. Положительным результатом РСК (РДСК) считают задержку гемолиза на два креста и более в разведении сыворотки крови 1:5.
Кольцевая реакция с молоком (КР). Метод применяют для ориентировочной проверки благополучных по бруцеллезу молочных стад и для контроля молока на рынке.
В бактериологическую пробирку наливают 2 мл исследуемого молока, добавляют 0,1мл антигена — клетки бруцелл, окрашенные гематоксилином. Пробирки встряхивают и помещают в водяную баню при 37. 38 ºС на 45. 50 мин, после чего учитывают результат. Положительный результат — верхняя часть столбика молока (сливки) синего цвета, остальное молоко белое или слегка синеватое. Отрицательный результат — слой сливок белый, молоко равномерно окрашено в синий цвет. Сомнительный результат — сливки слабо окрашены в синий цвет, молоко синего цвета.
Аллергическая диагностика не принадлежит к лабораторным методам; ее применяют непосредственно в хозяйствах. При бруцеллезе развивается состояние гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), которое может сопровождаться синтезом антител, улавливаемых в серологических реакциях, но иногда ГЗТ отмечают при отрицательных показаниях серологических тестов. Для обнаружения ГЗТ у животных используют диагностический аллерген — бруцеллин (см. тему 20).
Биопрепараты. Вакцина из штамма В. abortus № 19. Это наиболее изученная вакцина. Вакцинный штамм выращивают на плотных питательных средах. Устанавливают концентрацию микробных клеток 8 • 10 10 /мл, лиофильно высушивают. Готовый препарат контролируют на чистоту роста, диссоциацию, безвредность на морских свинках и белых мышах, одновременно у морских свинок проверяют наличие серологического ответа на введение вакцины. Иммуногенность препарата контролируют на морских свинках.
Живая сухая вакцина против бруцеллеза из слабоагглютино-генного штамма № 82 отличается от вакцины из штамма № 19 слабым серологическим ответом с быстрым снижением уровня гуморальных антител, что позволяет при помощи серологических реакций дифференцировать вакцинированных животных.
Единый бруцеллезный антиген для РА, РСК и РДСК получают следующим образом: культуру вакцинного штамма № 19 выращивают на плотной питательной среде, бактериальную массу инактивируют, проверяют на чистоту и стерильность путем микроскопии и высевом на питательные среды. Контролируют на специфичность с физиологическим раствором и негативной сывороткой. Активность проверяют в РА и РСК с национальной стандартной бруцеллезной агглютинирующей сывороткой.
Антиген для кольцевой реакции с молоком. Микробную массу культуры В. abortus (штамм № 19) готовят, как для единого бруцеллезного антигена, инактивируют, устанавливают необходимую концентрацию микробных клеток, протравливают сульфатом железа, окрашивают в синий цвет гематоксилином, контролируют на стерильность, специфичность и активность (см. тему 20).
Роз-бенгал антиген представляет собой суспензию бруцелл в буферном растворе (рН 3,6), инактивированных нагреванием и фенолом, окрашенных бенгальским розовым в малиново-розовый цвет. Антиген контролируют на стерильность, чистоту, рН. Специфичность проверяют с физиологическим раствором и негативными сыворотками, активность — методом титрования с национальной стандартной сывороткой.
Флуоресцирующую бруцеллезную сыворотку готовят из позитивной бруцеллезной сыворотки, глобулины которой метят флуоресцеинизотиоцианатом.
Позитивную бруцеллезную сыворотку получают гипериммунизацией животных-продуцентов. Используют для контроля при постановке серологических реакций (РА, РСК и др.), а также серологической идентификации бруцелл.
Диагностический аллерген-бруцеллин представляет собой стерильную, прозрачную, желтоватого цвета жидкость, содержащую продукты жизнедеятельности бруцелл и вещества, извлеченные из них. Бактериальную массу выращивают (штамм В. abortus В-1) на агаровой среде, прогревают при 105. 110 °С 1ч, центрифугируют, надосадочную жидкость стерилизуют фильтрованием, бактериальную массу ресуспендируют в физиологическом растворе. Процедуру нагревания, центрифугирования и стерилизации повторяют, после чего оба фильтрата объединяют. Полученный препарат контролируют, как описано ранее (см. тему 20).
Туляремия. Острая инфекционная болезнь. У сельскохозяйственных животных обычно протекает в септической форме. Характеризуется увеличением лимфатических узлов, симптомами поражения нервной системы, у крупного рогатого скота может проявляться маститами, у лошадей — абортами. Из сельскохозяйственных животных к возбудителю туляремии наиболее чувствительны поросята, ягнята, из диких животных — грызуны. Восприимчив человек.
Возбудитель туляремии — бактерия Francisella tularensis (принадлежит к роду Francisella). Подразделяют на два биовара: F. tularensis sb. tularensis и F. tularensis sb. palaearctica. Для вида F. novicida характерна незначительная вирулентность.
Лабораторная диагностика туляремии основана на результатах бактериологического исследования.
Бактериологическое исследование включает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале методом световой микроскопии, выделение чистой культуры методом биопробы и посевом на питательные среды; идентификацию возбудителя по культурально-морфологическим, ферментативным, серологическим свойствам.
Материал для исследования. Для прижизненной диагностики в лабораторию направляют мочу, фекалии, абортированный плод; для посмертной — печень, почки, селезенку, увеличенные лимфатические узлы; трупы мелких животных, грызунов — целиком. При необходимости материал консервируют глицерином.
Микроскопия препаратов из исходного материала. Мазки-отпечатки окрашивают по Граму и Романовскому—Гимзе. F. tularensis-— мелкая [(0,3. 0,7) х (0,2. 0,4) мкм] грамотрицательная палочковидная бактерия, преимущественно в форме кокко-бактерии. Красители воспринимает плохо, без жгутиков, спор не образует, но формирует капсулу (рис. 101). Из-за мелких размеров возбудителя его микроскопическое обнаружение затруднительно.
Выделение и идентификация культуры возбудителя. Возбудитель туляремии — строгий аэроб, не растет на общепринятых средах, температурный оптимум Зб. 37°С, рН 6,7. 7,4. Исследуемый материал высевают на среду Френсиса, кровяную среду Емельяновой или желточную Мак-Коя (см. тему 7).
Среда Френсиса: к МПА (рН 7,3) добавляют 0,1 % цистина, 1 % глюкозы, кипятят несколько минут, охлаждают до 50 ºС, добавляют 10 % дефибринированной стерильной крови кролика.
Среда Емельяновой: в рыбно-дрожжевой агар вносят 0,1 % цистина, 1 % глюкозы, агар охлаждают до 45 °С и добавляют 10 % стерильной дефибринированной крови.
Посевы культивируют 24. 48 ч. Возбудитель формирует мелкие, круглые, выпуклые, с ровными краями, гладкой блестящей поверхностью, беловатые колонии (рис. 102). Из подозрительных колоний готовят мазки, окрашивают, микроско-пируют. В препаратах из культуры в отличие от препаратов из нативного материала клетки возбудителя в основном не кокковидной, а палочковидной формы.
Рис. 102. Колонии F. tularensis (х7)
У культур с типичными для F. tularensis культурально-морфо-логическими признаками исследуют ферментативные свойства (табл. 31).
Выделенную культуру дополнительно идентифицируют с ту-ляремийной иммунной сывороткой в серологических реакциях (РА, ИФА, РП, РИГА).
ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ
Приготовить и окрасить по методу Грама (Козловского) мазки из инактивированных клеток бруцелл, F. tularensis. Описать культуральные и морфологические свойства возбудителей.
Исследовать в пробирочной РА и роз-бенгал-тесте сыворотки крови от здоровых и больных бруцеллезом животных (крупный рогатый скот).
Освоить технику постановки и учета результатов кольцевой реакции с молоком.
Ознакомиться с биопрепаратами для специфической профилактики и диагностики бруцеллеза.
1. Какой материал направляют в лабораторию для бактериологического исследования на бруцеллез и туляремию?
2. В чем состоит бактериологическое исследование на бруцеллез и туляремию?
Читайте также: