Гост методы определения кишечной палочки

Обновлено: 22.04.2024

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод выявления в определенной навеске пищевого продукта бактерий вида Excherichia coli (E.coli) и три метода определения их количества: метод наиболее вероятного числа (НВЧ) и методы посева в или на агаризованные селективно-диагностические среды.

Выбор метода определения количества E.coli зависит от предполагаемой обсемененности продукта бактериями семейства Enterobacteriaceae и осуществляется в соответствии с требованиями ГОСТ 30518.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 10444.1-84 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе

ГОСТ 24104-88 Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия

ГАРАНТ:

ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов

ГОСТ 29184-91 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий семейства Enterobacteriaceae

ГОСТ 30425-97 Консервы. Метод определения промышленной стерильности

ГАРАНТ:

См. ГОСТ 31747-2012 "Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)", утвержденный приказом Росстандарта от 29 ноября 2012 г. N 1771-ст

ГОСТ 30519-97/Р 50480-93 Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella

ГАРАНТ:

См. ГОСТ 31659-2012 (ISO 6579:2002) "Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella", утвержденный приказом Росстандарта от 9 ноября 2012 г. N 715-ст

3 Сущность методов

Методы выявления и определения НВЧ E.Coli основаны на высеве определенного количества продукта и (или) разведений навески продукта в жидкую селективную среду с лактозой, инкубировании посевов, учете положительных колб (пробирок), пересеве культуральной жидкости на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды для дальнейшего подтверждения по биохимическим и культуральным признакам роста принадлежности выделенных колоний к E.coli.

Методы определения количества E.coli посевом в или на агаризованные селективно-диагностические среды основаны на высеве определенного количества продукта или его разведений в или на агаризованную селективно-диагностическую среду, инкубировании посевов, подсчете типичных для E.coli колоний, подтверждении по биохимическим и культуральным признакам роста принадлежности выделенных колоний к E.coli.

4 Отбор и подготовка проб

Отбор и подготовка проб - по ГОСТ 26668, ГОСТ 26669.

5 Аппаратура, материалы, реактивы (в т.ч. индикаторы)

Для проведения анализа применяют аппаратуру, материалы и реактивы по ГОСТ 10444.1 со следующими дополнениями:

весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания до 1 кг и допустимой погрешностью мг (для взвешивания продукта) и весы с наибольшим пределом взвешивания 200 г, 2-го класса точности (для взвешивания реактивов);

микроскоп биологический с приспособлением для фазово-контрастного микроскопирования, обеспечивающий увеличение ;

поплавки (трубки Дархема);

стекла предметные по ГОСТ 9284;

желчь говяжью сухую или натуральную;

натрий-аммоний фосфорнокислый двузамещенный;

6 Подготовка к анализу

6.1 Приготовление растворов реактивов

6.1.1 Реактив Кларка: 0,1 г метилового красного растворяют в 300 этилового спирта и добавляют 200 дистиллированной воды. Реактив хранят в посуде из темного стекла не более 1 мес при температуре ()°С.

6.1.2 Реактивы Ковача и Эрлиха готовят по ГОСТ 30519.

6.1.3 Спиртовой раствор готовят по ГОСТ 30519.

6.1.4 Приготовление индикаторных бумажек для обнаружения индола: 3-5 г парадиметиламинобензальдегида, 10 концентрированной фосфорной кислоты и 50 этилового спирта тщательно перемешивают в фарфоровой ступке. В полученном растворе смачивают полоски фильтровальной бумаги, высушивают и нарезают узкими полосками шириной около 1 см. Цвет полученных бумажек - желтый. Индикаторные бумажки хранят не более 1 мес в темном месте.

6.1.5 Раствор гидроокиси калия массовой концентрации 400 : 40 г гидроокиси калия переносят в мерную колбу вместимостью 100 и растворяют в дистиллированной воде. Раствор доводят до метки.

6.1.6 Реактивы и растворы для окраски по Граму готовят по ГОСТ 10444.1.

6.2 Приготовление питательных сред

6.2.1 Бульон лактозный с бриллиантовым зеленым и желчью готовят по ГОСТ 30518.

6.2.2 Бульон Мак-Конки готовят по ГОСТ 30518.

6.2.3 Бульон глюкозо-фосфатный, сухой промышленного производства.

6.2.4 Бульон мясо-пептонный с триптофаном: 0,05 г L-триптофана растворяют в 100 мясо-пептонного бульона, приготовленного по ГОСТ 10444.1, разливают в пробирки по 6-7 и стерилизуют при температуре ()°С в течение 20 мин.

6.2.5 Бульон Хоттингера готовят по ГОСТ 10444.1.

6.2.6 Среду Кесслер готовят по ГОСТ 30518.

6.2.7 Среда Кларка: в 1 дистиллированной воды при нагревании растворяют 5,0 г пептона, 5,0 г глюкозы, 5,0 г фосфорнокислого двузамещенного калия, охлаждают до 45-55°С и устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25°С (). Среду разливают по 5-6 в пробирки и стерилизуют при температуре ()°С в течение 15 мин или дробным методом - текучим паром по 30 мин три дня подряд.

6.2.8 Среда (типа Клиглера) для первичной дифференциации энтеробактерий, сухая промышленного производства.

6.2.9 Среда Козера: в 1 дистиллированной воды при нагревании растворяют 1,5 г фосфорнокислого двузамещенного натрия-аммония, 1,0 г фосфорнокислого однозамещенного калия, 0,2 г сернокислого магния и 2,5 г лимоннокислого натрия, охлаждают до 45-55°С и устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации он составлял () при 25°С. Среду стерилизуют при температуре ()°С в течение 15 мин.

После стерилизации к 1 среды добавляют 10 спиртового раствора бромтимолового синего массовой концентрации 5 , затем среду разливают по 6-7 в стерильные пробирки. Приготовленная среда имеет оливково-зеленый цвет.

Цитратный агар Симмонса выпускается промышленностью в сухом виде.

6.2.11 Среды с углеводами (среды Гисса) готовят по ГОСТ 10444.1 или используют для приготовления сухие среды промышленного производства.

Допускается сухую среду Гисса с углеводами готовить на основе сухого питательного агара: к 7,3 г сухого питательного агара прибавляют 3,65 г соответствующего углевода (глюкозы, лактозы, целлобиозы или сорбита), 0,38 г натрия фосфорнокислого двузамещенного, 3,65 г натрия хлористого, 0,02 г бромкрезолового пурпурового. Смесь тщательно перемешивают в фарфоровой ступке и хранят герметично закрытой в темном месте. Полученные 15 г порошка рассчитаны на приготовление 1 среды. При приготовлении среды порошок тщательно размешивают в дистиллированной воде, кипятят 1-2 мин, не допуская пригорания, фильтруют, разливают по 5-6 в пробирки и стерилизуют при температуре ()°С в течение 20 мин или дробным методом - текучим паром по 30 мин три дня подряд. Приготовленная среда имеет фиолетовый цвет.

6.2.12 Среда Эндо, сухая промышленного производства.

6.2.13 Трехсахарный агар готовят по ГОСТ 30519.

6.2.14 Среды из сухих препаратов промышленного производства готовят по прописям, указанным на этикетках.

6.2.15 Тест-системы для биохимической идентификации промышленного производства.

7 Проведение анализа

7.1 Посевы для определения количества E.coli в 1 г () продукта и выявления E.coli в определенной навеске продукта проводят по ГОСТ 30518.

Посевы на агаризованной и жидких средах инкубируют при температуре ()°С в течение 24-48 ч. Чашки Петри инкубируют дном вверх. Посевы просматривают через () ч, отмечают положительные посевы в жидких средах, а окончательный учет проводят через () ч.

Положительными считают посевы в жидкие среды, в которых имеет место рост микроорганизмов, проявляющийся в помутнении среды, образовании газа, подкислении среды (то есть изменении цвета среды).

7.2 Для подтверждения принадлежности микроорганизмов, выросших в жидких средах, к E.coli делают пересевы по ГОСТ 26670 на поверхность среды Эндо, приготовленной по 6.2.12.

Посевы инкубируют при температуре ()°С в течение () ч.

7.3 Посевы на агаризованной среде по 7.1 и 7.2 просматривают после инкубирования и отмечают рост характерных для E.coli колоний.

На среде Эндо E.coli образует колонии от бледно-розового до темно-красного цвета часто с металлическим блеском.

Для дальнейшего подтверждения принадлежности выросших колоний к E.coli отбирают по три колонии каждого типа.

Из отобранных колоний приготавливают мазки, окрашивают их по Граму по ГОСТ 30425. Параллельно в каждой отобранной колонии у бактерий по ГОСТ 29184 определяют отсутствие оксидазы.

Оксидазоотрицательные бактерии пересевают на поверхность мясо-пептонного агара или среды, приготовленной из сухого питательного агара. Посевы инкубируют до появления видимого роста при температуре ()°С.

7.4 У оксидазоотрицательных грамотрицательных культур (палочки размером мкм), выросших в пересевах по 7.3, определяют возможность образования индола, ацетоина, сероводорода, утилизации цитрата, интенсивность ферментации углеводов с образованием кислоты, ферментацию сорбита, глюкозы и лактозы.

7.4.1 Определение образования индола

Культуру высевают в пробирку с бульоном Хотшнгера, приготовленным по 6.2.5, или мясо-пептонным бульоном с триптофаном, приготовленным по 6.2.4. Под пробку в пробирку помещают полоску индикаторной бумажки, приготовленной по 6.1.4. Посевы инкубируют при температуре ()°С в течение 24 ч. Если за время инкубирования посевов в среде накапливается индол, то желтый цвет индикаторной бумажки меняется на цвет от сиренево-розового до интенсивного малинового.

Образование индола можно определить с помощью реактивов Эрлиха и Ковача, приготовленных по 6.1.2. Для этого к 5 24-часовой культуры добавляют 1 одного из реактивов. Образование красного слоя на поверхности культуральной жидкости указывает на положительную реакцию.

E.coli образует индол.

7.4.2 Определение образования ацетоина (реакция Фогес-Проскауэра)

Культуру высевают в пробирки со средой Кларка, приготовленной по 6.2.7. Посевы инкубируют при температуре (36_1) °С в течение 48 ч.

После инкубирования посевов к 1 отобранной культуральной жидкости прибавляют 0,6 раствора , приготовленного по 6.1.3, и 0,2 раствора гидроокиси калия, приготовленного по 6.1.5. После прибавления каждого реактива пробирку встряхивают. Появление розового окрашивания через 15 - 60 мин указывает на положительную реакцию.

E.coli не образует ацетоин.

7.4.3 Определение утилизации цитрата

Культуру высевают в пробирки со средой Козера, приготовленной по 6.2.9, или на поверхность среды Симмонса, приготовленной по 6.2.10. Посевы инкубируют при температуре ()°С в течение 24 - 48 ч. Изменение оливково-зеленого цвета сред на васильковый, синий указывает на положительную реакцию.

E.coli не утилизирует цитрат.

7.4.4 Определение интенсивности ферментации углеводов с образованием кислоты (реакция с метил-рот)

Культуру высевают в пробирки с глюкозо-фосфатным бульоном или средой Кларка или используют посевы после отбора 1 культуральной жидкости по 7.4.2. Посевы инкубируют при температуре ()°С в течение 48 ч. К 5 культуральной жидкости прибавляют 5-10 капель реактива Кларка, приготовленного по 6.1.1. Появление через 1 мин красного цвета культуральной жидкости указывает на ферментацию углеводов до рН ниже 5,0.

E.coli интенсивно ферментирует углеводы (реакция с метил-рот положительная).

7.4.5 Определение ферментации сорбита, глюкозы и лактозы

Культуру высевают в среды Гисса с сорбитом или глюкозой, или лактозой приготовленные по 6.2.11. Посевы инкубируют при температуре ()°С в течение 24 ч, а на среде Гисса с лактозой при температуре ()°С в течение 24 ч.

E.coli ферментирует глюкозу, лактозу и сорбит.

При ферментации глюкозы образуется газ. Ферментацию глюкозы можно учитывать в засеянных косяках трехсахарного агара или среды Клиглера по изменению цвета столбика среды и образованию в нем газа.

Ферментацию лактозы учитывают по изменению цвета скошенной поверхности среды Клиглера.

Ферментацию сорбита учитывают по изменению цвета среды.

У культур типичных для E.coli по всем изученным признакам, но не ферментирующим сорбит, изучают возможность ферментации целлобиозы на среде, приготовленной по 6.2.11, при температуре ()°С в течение 24 ч. E.coli не ферментирует целлобиозу, цвет среды не меняется.

7.4.6 Определение образования сероводорода

Образование сероводорода учитывают в посевах на среду Клиглера или трехсахарный агар после инкубирования посевов при температуре ()°С в течение 24 ч. Почернение в столбике среды указывает на образование сероводорода.

E.coli не образует сероводород.

7.4.7 Для биохимической идентификации выявленных бактерий допускается использование тест-систем промышленного производства.

8 Обработка результатов анализа

8.1 Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

8.2 К бактериям E.coli относят оксидазоотрицательные не образующие спор грамотрицательные палочки, обладающие способностью ферментации лактозы при температуре ()°С, ферментирующие глюкозу и сорбит, дающие положительную реакцию с метил-рот, образующие индол, не образующие ацетоин и не утилизирующие цитрат. Бактерии, не ферментирующие сорбит и целлобиозу, но по другим биохимическим признакам давшие типичные для E.coli реакции, относят к сорбитотрицательным штаммам E.coli. Основные дифференцирующие признаки видов рода Escherichia приведены в приложении А.

8.3 Посевы навески продукта в жидкие среды считают положительными, если при последующем пересеве и подтверждении характерных колоний хотя бы в одной колонии будут обнаружены E.coli.

8.4 НВЧ E.coli в 1 г () продукта определяют по количеству положительных колб (пробирок) по ГОСТ 26670.

8.5 Если при подтверждении характерных колоний (при определении количества E.coli посевом "в" или "на" агаризованные среды) в 66% случаев, то есть не менее чем в 2 из 3 колоний, подтвержден рост E.coli, то считают, что все характерные колонии, выросшие на чашке Петри (см. 7.3), принадлежат к E.coli. В остальных случаях количество E.coli определяют, исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных колоний, взятых для подтверждения.

Пересчет количества E.coli, определенного посевом в (или "на") агаризованные среды, на 1 г () продукта проводят по ГОСТ 26670.

8.6 Результаты определения количества E.coli и выявления их в определенной навеске продукта записывают по ГОСТ 26670.

Откройте актуальную версию документа прямо сейчас или получите полный доступ к системе ГАРАНТ на 3 дня бесплатно!

Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.

Межгосударственный стандарт ГОСТ 30726-2001 "Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli" (введен в действие постановлением Государственного комитета Российской Федерации по стандартизации и метрологии от 27 июля 2001 г. N 297-ст)

Текст ГОСТа (государственный стандарт) приводится по официальному изданию Госстандарта России, ИПК Издательство стандартов, 2001 г.

1 Разработан Всероссийским научно-исследовательским институтом консервной и овощесушильной промышленности (ВНИИКОП) и МТК 93 "Продукты переработки плодов и овощей"

Внесен Госстандартом России

2 Принят Межгосударственным Советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол N 19 от 24 мая 2001 г.)

Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)

Food products. Methods for detection and quantity determination of coliformes

____________________________________________________________________
Текст Сравнения ГОСТ 31747-2012 с ГОСТ Р 52816-2007 см. по ссылке.
- Примечание изготовителя базы данных.
____________________________________________________________________

Дата введения 2013-07-01

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Государственным научным учреждением "Всероссийский научно-исследовательский институт консервной и овощесушильной промышленности" (ГНУ "ВНИИКОП") на основе аутентичных переводов на русский язык международных стандартов, указанных в пункте 4

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственном советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 1 октября 2012 г. N 51)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Минэкономики Республики Армения

Госстандарт Республики Беларусь

4 Настоящий стандарт модифицирован по отношению к международным стандартам:

- ISO 4831:2006* "Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection and enumeration of coliforms - Most probable number technique", (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод для выявления и подсчета количества колиформ. Метод наиболее вероятного числа);

* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым в тексте, можно получить, обратившись в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

- ISO 4832:2006 "Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the enumeration of coliforms - Colony-count technique", (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод подсчета колиформ. Метод подсчета колоний) в части пищевых продуктов.

При этом дополнительные положения и требования, включенные в текст стандарта для учета потребностей национальной экономики указанных выше государств и особенностей межгосударственной стандартизации, выделены в тексте стандарта курсивом*.

* В бумажном оригинале обозначения и номера стандартов и нормативных документов в разделе "Предисловие" приводятся обычным шрифтом, остальные по тексту документа выделены курсивом. - Примечание изготовителя базы данных.

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие с ГОСТ 1.5 (пункт 3.6).

Сравнение структуры настоящего стандарта со структурой указанных международных стандартов приведено в дополнительном приложении ДА.

Степень соответствия - модифицированная (MOD).

Стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 52816-2007

5 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2012 г. N 1771-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 31747-2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2013 г.

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты, кроме молока и молочных продуктов, и устанавливает метод выявления в определенной навеске пищевого продукта колиформных бактерий и три метода определения их количества: метод наиболее вероятного числа (НВЧ) и методы посева в или на агаризованные селективно-диагностические среды.

Метод определения НВЧ колиформных бактерий предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта менее 150 или в 1 см жидкого продукта менее 15 клеток колиформных бактерий.

Метод определения количества колиформных бактерий посевом в агаризованные селективно-диагностические среды предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта более 150 или в 1 см жидкого продукта более 15 колониеобразующих единиц (КОЕ) колиформных бактерий.

Метод определения количества колиформных бактерий посевом на агаризованные селективно-диагностические среды предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта более 1500 или в 1 см жидкого продукта более 150 КОЕ колиформных бактерий.

Допускается использование хромогенных сред для предварительного выявления количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий) в масложировой продукции.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 24104-2001* Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов

ГОСТ 29184-91 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий семейства Enterobacteriaceae

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному справочному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 колиформные бактерии: Бактерии, которые при температуре 37 °С ферментируют лактозу с образованием газа по методам, приведенным в настоящем стандарте.

3.2 выявление колиформных бактерий: Определение присутствия или отсутствия колиформных бактерий в определенной массе или объеме продукта в соответствии с настоящим стандартом

3.3 определение количества колиформных бактерий:

3.3.1 Количество бактерий, содержащееся в 1 см или 1 грамме продукта, определенное путем посева продукта и (или) его разведений в или на агаризованную селективно-диагностическую среду, подсчете после инкубирования при температуре 37 °С типичных и атипичных колоний и определении возможности бактерий из этих колоний ферментировать лактозу с образованием газа по методам, приведенным в настоящем стандарте.

При необходимости, подтверждают по биохимическим признакам принадлежности выделенных колоний к колиформным бактериям.

3.3.2 Количество бактерий, содержащееся в 1 см или 1 грамме продукта, определенное по методу НВЧ, указанному в настоящем стандарте.

4 Метод выявления колиформных бактерий и определения количества по методу НВЧ

Методы выявления и определения НВЧ колиформных бактерий основаны на высеве определенного количества продукта и (или) разведений навески продукта в жидкую селективную среду с лактозой, инкубировании посевов, учете положительных пробирок, пересеве культуральной жидкости в жидкую селективную среду для учета газообразования или пересева, при необходимости, культуральной жидкости на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды для подтверждения по биохимическим и культуральным признакам роста принадлежности выделенных колоний к колиформным бактериям.

4.1 Метод выявления колиформных бактерий

4.1.1 Пробирку с селективной обогатительной средой инокулируют продуктом или разведением навески продукта и инкубируют при температуре 37 °С 24 или 48 ч.

4.1.2 Пробирку с подтверждающей средой инокулируют из пробирки, полученной по 4.1.1, где отмечено образование газа и/или помутнение и инкубируют при температуре 37 °С 24 или 48 ч.

4.1.3 Присутствие колиформных бактерий считается подтвержденным, в случае если отмечено помутнение и образование газа после осмотра пробирки, полученной по 4.1.2.

4.2 Метод НВЧ - определение количества колиформных бактерий

4.2.1 Три пробирки с жидкой обогатительной средой двойной концентрации инокулируют определенным количеством продукта, если исходный продукт жидкий, или определенным количеством исходной суспензии в случае другого продукта.

4.2.2 Три пробирки с жидкой обогатительной средой нормальной концентрации инокулируют определенным количеством продукта и/или разведением продукта, если исходный продукт жидкий, или определенным количеством исходной суспензии и/или разведением в случае другого продукта.

4.2.3 Посевы в пробирках, содержащие обогатительную среду двойной концентрации, инкубируют при температуре 37 °С 24 ч. Посевы в пробирках со средой нормальной концентрации, инкубируют 24 или 48 ч, после этого в этих пробирках отмечают наличие газа и/или помутнения, мешающего выявлению образования газа.

4.2.4 Пробирки с подтверждающей средой инокулируют культурами из пробирок с обогатительной селективной средой двойной концентрации и культурами из пробирок с обогатительной селективной средой нормальной концентрации, в которых отмечено образование газа и/или помутнение.

Посевы в пробирках с подтверждающей средой инкубируют при температуре 37 °С 24 или 48 ч, после этого в пробирках отмечают образование газа.

4.2.5 Наиболее вероятное число колиформных бактерий в 1 см или 1 г пробы продукта (НВЧ) рассчитывают исходя из числа пробирок с подтверждающей средой (4.2.4), показавших образование газа. Для определения наиболее вероятного числа пользуются таблицей ГОСТ 26670.

КОРМА ДЛЯ ЖИВОТНЫХ

Метод обнаружения и подсчета бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий). Метод наиболее вероятного числа

Animal feeding stuffs. Method for the detection and enumeration of coliforms. Most probable number technique

Дата введения 2014-01-01

Предисловие

Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Открытым акционерным обществом "Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации" (ОАО "ВНИИС")

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 3 декабря 2012 г. N 54-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны
по МК (ИСО 3166) 004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

5 Настоящий стандарт соответствует международному стандарту ИСО 4831:2006* "Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод обнаружения и подсчета колиформных бактерий. Методика наиболее вероятного числа" (ISO 4831:2006 "Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection and enumeration of coliforms - Most probable number technique", NEQ).

Настоящий стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 53985-2010*

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

7 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Апрель 2020 г.

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.

В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге "Межгосударственные стандарты"

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на корма для животных и устанавливает метод обнаружения и подсчета наиболее вероятного числа (НВЧ) бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий).

Метод наиболее вероятного числа колиформных бактерий предназначен для кормов, содержащих искомое количество микроорганизмов в диапазоне от 1 до 100 на миллилитр или грамм анализируемой пробы.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ ISО 7218 Микробиология пищевых продуктов и кормов. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям

ГОСТ ISO 11133-1 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть 1. Общие руководящие указания по обеспечению качества приготовления культуральных сред в лаборатории

ГОСТ ISO 11133-2-2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть 2. Практические руководящие указания по эксплуатационным испытаниям культуральных сред

ГОСТ 13496.0 Комбикорма, сырье. Методы отбора проб

ГОСТ 25311 Мука кормовая животного происхождения. Методы бактериологического анализа

ГОСТ 29227 (ISO 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 31747 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены термины и определения по ГОСТ 31747.

4 Обнаружение колиформных бактерий и определение количества методом наиболее вероятного числа (НВЧ)

Сущность метода - по ГОСТ 31747.

4.1 Метод обнаружения колиформных бактерий

4.1.1 В пробирку с селективно обогащенной питательной средой вносят около 1 г корма, пробирку помещают в термостат для инкубирования при температуре 30°C или 37°C (по договоренности) в течение 24 ч или 48 ч.

4.1.2 Пробирку после выращивания по 4.1.1 проверяют на наличие помутнения и/или образования газа. Затем из пробирки, в которой установлено наличие помутнения и/или образования газа, вносят в другую пробирку с селективно обогащенной питательной средой около 1 см суспензии и проводят повторное выращивание микроорганизмов при температуре 30°C или 37°C (по договоренности) в течение 24 ч или 48 ч.

4.1.3 Присутствие колиформных бактерий подтверждают в случае, если помутнение и/или образование газа замечено после осмотра пробирки, полученной по 4.1.2

4.2 Метод НВЧ - определение количества колиформных бактерий

4.2.1 В три пробирки с селективно обогащенной жидкой питательной средой двойной концентрации вводят определенное количество анализируемой пробы, если исходный корм является жидким, или определенное количество исходной суспензии в случае испытания других кормов.

4.2.2 В три пробирки с селективно обогащенной жидкой питательной средой нормальной концентрации вводят определенное количество анализируемой пробы, если исходный корм является жидким, или определенное количества исходной суспензии в случае испытания других кормов.

Затем, в таких же условиях, в дополнительные пробирки с питательной средой нормальной концентрации вводят десятикратные разведения анализируемой пробы или исходной суспензии.

4.2.3 Пробирки с посевами, содержащие селективно обогащенную питательную среду двойной концентрации, выращивают при температуре 30°C или 37°C (по договоренности) в течение 24 ч, а пробирки, содержащие селективно обогащенную питательную среду нормальной концентрации, инкубируют 24 ч или 48 ч и после этого пробирки осматривают и отмечают образование пузырьков газа или помутнение, затрудняющее учет газообразования.

4.2.4 В ряд пробирок с подтверждающей питательной средой вводят суспензию культур из пробирок с селективно обогащенной питательной средой двойной концентрации и суспензию культур из пробирок с селективно обогащенной питательной средой нормальной концентрации, в которых было замечено образование пузырьков газа или помутнение.

4.2.5 Посевы в пробирках по 4.2.4 выращивают при температуре 30°C или 37°C в течение 24 ч или 48 ч и эти пробирки исследуют на формирование газа.

4.2.6 Наиболее вероятное число колиформных бактерий в 1 см или 1 г пробы корма (НВЧ) рассчитывают исходя из числа пробирок по 4.2.5, показывающих формирование газа. В этом случае используют таблицу установления наиболее вероятного числа.

5 Питательные среды и разбавители

5.1 Общие положения

Качество подготовки, изготовления и оценки эффективности питательных сред для выращивания бактерий - по ГОСТ ISO 7218, ГОСТ ISO 11133-1 и ГОСТ ISO 11133-2-2011.

5.2 Селективно обогащенная питательная среда: LST (Триптоза лаурилсульфата)

5.2.1 Состав приведен в таблице 1.

а)
Среда двойной концентрации

b)
Среда нормальной концентрации

Энзиматический гидролизат молока и животных протеинов, г

Лактоза , г

Дикалия гидрофосфат , г

Калия дигидрофосфат , г

Хлорид натрия, г

Лаурилсульфат натрия, г

5.2.2 Приготовление

Различные компоненты или сухую питательную среду растворяют при нагреве в воде.

При необходимости корректируют pH так, чтобы после стерилизации он был равен 6,8 ±0,2 ед. pH при температуре 25°C.

Питательную среду разливают по 10 см в пробирки Дархама (поплавки) размером приблизительно 16 мм160 мм, когда используют среду нормальной концентрации, и в пробирки с размерами приблизительно 20 мм200 мм (не содержащие поплавки), когда используют среду двойной концентрации.

Стерилизуют среду в автоклаве при температуре (121±1)°C в течение 15 мин. Пробирки Дархама не должны содержать воздушные пузырьки после стерилизации.

5.2.3 Тестирование эффективности для обеспечения качества питательной среды

Текст ГОСТ 31747-2012 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION

Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)

(ISO 4831:2006, MOD)

(ISO 4832:2006, MOD)

Сведения о стандарте

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 1 октября 2012 г. № 51)

За принятие проголосовали:

по МК (ИСО 3106) 004-97

Сокращенное ианменоеаиие национального органа по стандартизации

Минэкономики Республики Армения

Госстандарт Республики Беларусь

4 Настоящий стандарт модифицирован по отношению к международным стандартам:

Степень соответствия — модифицированная (MOD).

Стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 52816—2007

5 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2012 г. № 1771-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 31747—2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2013 г.

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизвел ден. тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

1 Область применения. 1

2 Нормативные ссылки. 1

3 Термины и определения. 2

4 Метод выявления колиформных бактерий и определения количества по методу НВЧ. 2

4.1 Метод выявления колиформных бактерий. 2

4.2 Метод НВЧ — определение количества колиформных бактерий. 2

5 Методы определения количества колиформных бактерий — подсчет колоний. 3

5.1 Метод посева в агаризоеанную селективно-диагностическую среду. 3

5.2 Метод посева на агаризоеанную селективно-диагностическую среду. 3

6 Питательные среды и реактивы. 3

7 Аппаратура, посуда, материалы и реактивы. 7

8 Отбор и подготовка проб. 7

9 Проведение испытания. 8

10 Дополнительное подтверждение принадлежности выявленных бактерий к колиформным

11 Протокол испытания. 11

Приложение А (справочное) Схема выявления колиформных бактерий. 12

Приложение ДА (справочное) Сравнение структуры настоящего стандарта со структурами

примененных в нем международных стандартов. 13

Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек

Food products. Methods (or detection and quantity determination of coirformes

Дата введения — 2013—07—01

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты, кроме молока и молочных продуктов. и устанавливает метод выявления в определенной навеске пищевого продукта колиформных бактерий и три метода определения их количества: метод наиболее вероятного числа (НВЧ) и методы посева в или на агаризованные селективно-диагностические среды.

Метод определения НВЧ колиформных бактерий предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта менее 150 или в 1 см 3 жидкого продукта менее 15 клеток колиформных бактерий.

Метод определения количества колиформных бактерий посевом в агаризованные селективно-диагностические среды предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта более 150 или в 1 см 3 жидкого продукта более 15 колониеобразующих единиц (КОЕ) колиформных бактерий.

Метод определения количества колиформных бактерий посевом на агариэоеанные селективно-диагностические среды предназначен для пищевых продукпюв. содержащих в 1 г твердого продукта более 1500 или в 1 см 3 жидкого продукта болев 150 КОЕ колиформных бактерий.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ ISO 7210—2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям

ГОСТ 9284—75 Стекла предметные для микропрепаратое. Технические условия

ГОСТ 10444.1—84 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе

ГОСТ 24104—2001 Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 25336—82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26668—85 Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26669—85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26670—91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов

ГОСТ 29184—91 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий семейства Enterobacteriaceae

3 Термины и определения

8 настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 колиформиые бактерии: Бактерии, которые при температуре 37 *С ферментируют лактозу с образованием газа по методам, приведенным в настоящем стандарте.

3.2 выявление колиформных бактерий: Определение присутствия или отсутствия колифор-мных бактерий в определенной массе или объеме продукта в соответствии с настоящим стандартом.

3.3 определение количества колиформных бактерий:

3.3.1 Количество бактерий, содержащееся в 1 см 3 или 1 грамме продукта, определенное путем посева продукта и (или) его разведений в или на агариэованную селективно-диагностическую среду, подсчете после инкубирования при температуре 37 *С типичных и атипичных колоний и определении возможности бактерий из этих колоний ферментировать лактозу с образованием газа по методам, приведенным в настоящем стандарте.

При необходимости, подтверждают по биохимическим признакам принадлежности выделенных колонии к колиформным бактериям.

3.3.2 Количество бактерий, содержащееся в 1 см 3 или 1 грамме продукта, определенное по методу НВЧ. указанному в настоящем стандарте.

4 Метод выявления колиформных бактерий и определения количества

Методы выявления и определения НВЧ колиформных бактерий основаны на высеве определенного количества продукта и (или) разведений навески продукта в жидкую селективную сроду с лактозой, инкубировании посевов, учете положительных пробирок, пересеве культуральной жидкости в жидкую селективную среду для учета газообразования или пересева, при необходимости, культуральной жидкости на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды для подтверждения по биохимическим и культуральным признакам роста принадлежности выделенных колоний к колиформным бактериям.

4.1 Метод выявления колиформных бактерий

4.1.1 Пробирку с селективной обогатительной средой инокулируют продуктом или разведением навески продукта и инкубируют при температуре 37 *С 24 или 48 ч.

4.1.2 Пробирку с подтверждающей средой инокулируют из пробирки, полученной по 4.1.1. где отмечено образование газа и/или помутнение и инкубируют при температуре 37 ®С 24 или 48 ч.

4.2 Метод НВЧ — определение количества колиформных бактерий

4.2.3 Посевы в пробирках, содержащие обогатительную среду двойной концентрации, инкубируют при температуре 37 ®С 24 ч. Посевы в пробирках со средой нормальной концентрации, инкубируют 24 или 48 ч. после этого в этих пробирках отмечают наличие газа и/или помутнения, мешающего выявлению образования газа.

Посевы в пробирках с подтверждающей средой инкубируют при температуре 37 *С 24 или 48 ч. после этого в пробирках отмечают образование газа.

4.2.5 Наиболее вероятное число колиформных бактерий в 1 см 3 или 1 г пробы продукта (НВЧ) рассчитывают. исходя из числа пробирок с подтверждающей средой (4.2.4), показавших образование газа. Для определения наиболее вероятного числа пользуются таблицей ГОСТ 26670.

5 Методы определения количества колиформных бактерий — подсчет

Методы определения количества колиформных бактерий посевом в или на агаризованные селективно-диагностические среды основаны на высеве определенного количества продукта и/или его разведений в или на агаризованную селективно-диагностическую среду с лактозой, инкубировании посевов, подсчете типичных и атипичных колоний, пересеве типичных колоний и атипичных колоний в жидкую селективную среду с лактозой для определения газообразования, подтверждения, при необходимости. по биохимическим признакам принадлежности выделенных колоний к колиформным бактериям.

5.1 Метод посева в агаризованную селективно-диагностическую среду

5.1.1 Для определения количества колиформных бактерий по 1 см 3 продукта, если продукт жидкий, или по 1 см 3 исходного разведения в случае другого продукта вносят в две стерильные чашки Петри.

Другую пару чашек используют для других количеств — исходной суспензии и/или десятикратных разведений продукта.

Чашки с внесенным в них продуктом или его разведением заливают агариэованной питательной средой.

Посевы в чашках инкубируют при температуре 37 *С в течение 24 ч.

5.1.2 Типичные и атипичные колонии подсчитывают и определяют у бактерий из типичных и атипичных колоний возможность ферментации лактозы.

5.1.3 Число колоний на 1 см 3 или на 1 г продукта рассчитывают по ГОСТ 26670. исходя из числа подтвержденных типичных и атипичных колоний, выросших на чашках.

5.2 Метод посева на агаризованную селективно-диагностическую среду

5.2.1 На подсушенную поверхность агаризоеанной селективно-диагностической среды в двух чашках Петри наносят 0.1—0.2 см 3 продукта, если продукт жидкий, или исходной суспензии в случае другого продукта.

Другую пару чашек используют для других количеств — исходной суспензии или десятикратных разведений продукта.

внесенный в чашки продукт или его разведения распределяют по поверхности агаризоеанной питательной среды стерильным шпателем.

Посевы в чашках инкубируют при температуре 37 °С в течение 24 ч.

5.2.2 Типичные и атипичные колонии подсчитывают и определяют у бактерий из этих колоний возможность ферментации лактозы.

5.2.3 Число колоний на 1 см 3 или на 1 г продукта посчитывают по ГОСТ26670. исходя из числа подтвержденных типичных и атипичных колоний, выросших на чашках.

6 Питательные среды и реактивы

Химические вещества, используемые для приготовления питательных сред и реактивов, должны быть аналитического качества.

6.1 Селективная обогатительная среда (лаурил сульфат триптозный бульон)

6.1.1 Состав среды приведен в таблице 1.

а) Среда двойной концентрации

5) Среда нормальной концом грации

Ферментативный перевар молока и животных протеинов, г

Двузвмещенный фосфорнокислый келий (К₂НР0₄), г

Одноэвмещенный фосфорнокислый калий (KHjPO^). г

Натрий хлористый, г

Натрий лвурил сульфат, г

При нагревании растворяют компоненты или дегидратированную готовую среду в воде. Устанавливают pH так. чтобы после стерилизации он составлял (6,8 ± 0.2) при температуре 25 *С.

Разливают среду по 10 см 3 в пробирки размером приблизительно 16 х 160 мм. содержащие пробирки Дархама (поплавки), в случае использования среды нормальной концентрации, и в пробирки размером приблизительно 20x200 мм. не содержащие пробирки Дархама (поплавки), в случае использования среды двойной концентрации.

Стерилизуют среду в автоклаве при температуре (121 ± 1) °С в течение 15 мин. Пробирки Дархама (поплавки) после стерилизации не должны содержать пузырьков воздуха.

6.2 Бриллиантовый зеленый лактозкый желчный бульон

ферментативный перевар казеина. 10 г;

лактоза (СиНггОн НгО). 10 г;

бриллиантовый зеленый. 0,0133 г

(или 2,66 см 3 раствора. приготовлен• ного по 6.2.3. в случае приготовления среды из отдельных компонентов):

При нагревании растворяют компоненты или дегидратированную готовую среду в воде. Устанавливают pH так. чтобы после стерилизации он составлял (7.2 ± 0,2) при температуре 25 ®С. Разливают и стерилизуют среду по 6.1.2.

6.2.3 Раствор бриллиантового зеленого

бриллиантовый зеленый. 0.5 г:

Бриллиантовый зеленый переносят в фарфоровую ступку и постепенно растворяют в дистиллированной воде. Раствор переливают в мерную колбу вместимостью 100 см 3 и доводят водой до метки.

Читайте также: