Хемилюминесцентный иммуноанализ на вич что это
Обновлено: 19.04.2024
Иммунный блоттинг (иммуноблот, Western Blot, вестерн-блот) - сочетает в себе иммуноферментный анализ (ИФА) с предварительным электрофоретическим переносом на нитроцеллюлозную полоску (стрип) антигенов вируса.
Иммуноблот включает в себя несколько стадий:
Подготовка стрипа. Предварительно очищенный и разрушенный до составных компонентов вирус иммунодефицита (ВИЧ) подвергается электрофорезу, при этом входящие в состав ВИЧ антигены разделяются по молекулярному весу. Затем методом блоттинга (аналог выдавливания на "промокашку" избытка чернил) антигены переносят на полоску нитроцеллюлозы, которая отныне содержит невидимый пока глазом спектр антигенных полос, характерный для ВИЧ.
Исследование пробы. На нитроцеллюлозную полоску наносится исследуемый материал (сыворотка, плазма крови пациента и т.п.), и если в пробе есть специфические антитела, то они связываются со строго соответствующими им (комплиментарными) антигенными полосами. В результате последующих манипуляций результат этого взаимодействия визуализируется - делается видимым.
В настоящее время иммунный блоттинг (иммуноблот) является основным методом для подтверждения наличия вирусспецифических антител в исследуемой сыворотке. В некоторых случаях ВИЧ-инфекции, до развития сероконверсии, специфические антитела более эффективно выявляются методом иммунного блоттинга, чем ИФА. При исследовании методом иммунного блоттинга обнаружено, что чаще всего в сыворотках больных СПИДом выявляются антитела к gp 41, причем обнаружение р24 у лиц, обследуемых с профилактической целью, требует дополнительных исследований на наличие у них ВИЧ-инфекции. Тест-системы для иммунного блоттинга на основе рекомбинантных белков, полученных путем генной инженерии, оказались более специфичными, чем обычные системы на основе очищенного вирусного лизата. При использовании рекомбинантного антигена формируется не диффузная, а четко выраженная узкая полоска антигена, легко доступная для учета и оценки.
Сыворотки лиц, инфицированных ВИЧ-1, обнаруживают антитела к следующим основным белкам и гликопротеидам - структурным белкам оболочки (env) - gp160, gp120, gp41; ядра (gag) - p17, p24, p55, а также ферментов вируса (pol) - p31, p51, p66. Для ВИЧ-2 типичны антитела к env - gp140, gp105, gp36; gag - p16, p25, p56; pol - p68.
Среди лабораторных методов, необходимых для установления специфичности реакции, наибольшее признание имеет обнаружение антител к белкам оболочки ВИЧ-1- gp41, gp120, gp160, и ВИЧ-2 - gp36, gp105, gp140.
ВОЗ считает положительными сыворотки, в которых методом иммунного блотинга обнаруживаются антитела к каким-либо двум гликопротеидам ВИЧ. Согласно этим рекомендациям, при наличии реакции только с одним из белков оболочки (гп 160, гп 120, гп 41) в сочетании или без реакции с другими белками, результат считается сомнительным и рекомендуется повторное исследование, используя набор другой серии или другой фирмы. Если и после этого результат остается сомнительным, рекомендуется наблюдение в течение 6 месяцев (исследования через 3 месяца).
Наличие положительной реакции с антигеном p24 может указывать на период сероконверсии, так как антитела именно к этому белку иногда появляются первыми. В этом случае рекомендуется, в зависимости от клинических и эпидемиологических данных, повторить исследование с образцом сыворотки, взятым как минимум через 2 недели, и это является как раз тем случаем, когда при ВИЧ-инфекции необходимо исследование парных сывороток.
Положительные реакции с белками gag и pol без наличия реакции с белками env могут отражать стадию ранней сероконверсии, а также может указывать на ВИЧ-2 инфекцию или на неспецифическую реакцию. Лиц с такими результатами после тестирования на ВИЧ-2 повторно исследуют через 3 месяца (в течение 6 месяцев).
Для скрининга (т.е. быстрого и массового тестирования) применяется метод ИФА или ИХЛА. Для подтверждения диагноза применяется иммуноблот.
У лиц с диагностированной ВИЧ-инфекцией применяется количественный метод ПЦР на РНК ВИЧ, он позволяет ответить на вопрос сколько вируса в крови. Его так же не следует применять для диагностики.
КОГДА ПОСЛЕ РИСКА НУЖНО СДЕЛАТЬ ТЕСТ НА ВИЧ?
Оптимально сделать два теста: через 6 недель и через 12 недель (3 месяца, если округлить до целых месяцев) после риска — достоверность отрицательного результата будет предельно близка к 99,9 %. Тест через любой более длительный срок тоже будет достоверен.
На любых сроках от потенциально опасной ситуации после 6-12 недель ИФА не увеличивает и не теряет своей надежности, оставаясь точным методом диагностики и через год, и через два и далее. В очень редких случаях диагностические проблемы могут возникать у очень тяжелых, фактически терминальных пациентов, с развернутой картиной СПИДа. Подробнее можно почитать об этом здесь, также там даны ответы на вопросы о т.н. поздней сероконверсии.
ГДЕ Я МОГУ ПРОЙТИ ТЕСТ НА ВИЧ?
Существует много мест, где вы можете пройти тест на ВИЧ: в поликлинике, в кабинете частного врача, больницах, клиниках планирования семьи и в местах, специально отведенных для тестирования на ВИЧ.
Всегда старайтесь пройти тестирование там, где проводится консультирование. В некоторых местах имеются услуги по консультированию и тестированию на дому, которые могут включать консультирование пар и оказание им поддержки для безопасного раскрытия результатов после тестирования.
КАКОЙ НУЖНО СДЕЛАТЬ ТЕСТ?
ИФА или ИХЛА тест на ВИЧ. Это название технологии теста. Конкретное название оборудование будет написано на упаковке теста, например, Abbot ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo.
ЗАЧЕМ ДЕЛАТЬ ТЕСТ ЧЕРЕЗ 6 НЕДЕЛЬ, ЕСЛИ ВСЁ РАВНО НУЖНО БУДЕТ ДЕЛАТЬ ЧЕРЕЗ 12? МОЖНО ОБОЙТИСЬ ТОЛЬКО ОДНИМ ТЕСТОМ ЧЕРЕЗ 12 НЕДЕЛЬ?
Да, можно. Первый тест даст уже очень высокую предварительную достоверность, что важно для диагностики, и, кроме того, при отрицательном результате позволяет легче переждать срок до финального теста через 3 месяца.
ЧТО ТАКОЕ ПЕРИОД (СЕРОНЕГАТИВНОГО) ОКНА?
Это период между заражением ВИЧ и появлением обнаруживаемых антител к вирусу.
ВИЧ может передаваться другим людям во время периода окна, даже если тест на ВИЧ не показал, что у вас ВИЧ-инфекция.
КАКОВА ДОСТОВЕРНОСТЬ ТЕСТА ЧЕРЕЗ 6 НЕДЕЛЬ ПОСЛЕ РИСКА?
Для тестов, определяющих и антитела и антигены — практически полная, для тестов только на антитела — примерно на уровне 95%.
ЕСЛИ ИФА ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЙ, ТО ЭТО ОЗНАЧАЕТ ДИАГНОЗ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ?
Нет, требуется подтверждение другим методом. Подтверждающим методом для диагностики ВИЧ-инфекции сегодня является непрямая иммунофлюоресценция (РНИФ, иммуноблот, вестерн-блот). Иммуноблот демонстрирует высокую чувствительность (99,3 — 99,7 %) и специфичность (99,7 %), но так как метод определяет иммуноглобулины класса G, то с момента инфицирования результат может быть ложноотрицательным до трех недель.
У МЕНЯ ПЕРВЫЙ (ВТОРОЙ ТРЕТИЙ, СОРОК ШЕСТОЙ) ИФА ТЕСТ НА ВИЧ ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЙ, А ИММУНОБЛОТ ОТРИЦАТЕЛЬНЫЙ. ЧТО ЭТО ЗНАЧИТ?
Это значит, что ВИЧ у Вас нет.
У МЕНЯ ИММУНОБЛОТ СОМНИТЕЛЬНЫЙ (НЕОПРЕДЕЛЕННЫЙ). ЧТО ЭТО ЗНАЧИТ?
Вам необходимо повторить иммуноблот через 2-3 месяца после первого. Если он будет отрицательным или останется неопределенным, то ВИЧ можно исключить. Иммуноблот может быть отрицательным или сомнительным сразу после инфицирования в пределах 4-8 недель, именно для этого его нужно повторить.
ПРОВЕРОЧНЫЙ ИММУНОБЛОТ ОКАЗАЛСЯ ПОЛОЖИТЕЛЬНЫМ. У МЕНЯ ВИЧ? ОШИБКИ БЫТЬ НЕ МОЖЕТ?
Да, у вас, к сожалению, ВИЧ. Не может.
У МЕНЯ ОТРИЦАТЕЛЬНЫЙ ТЕСТ ЧЕРЕЗ 3 МЕСЯЦА, НО У МЕНЯ ПРОДОЛЖАЮТСЯ НЕПОНЯТНЫЕ СИМПТОМЫ, У МЕНЯ ВИЧ?
ВИЧ у Вас нет. Ваши симптомы к ВИЧ отношения не имеют. С любой непонятной симптоматикой нужно обращаться к врачам очно.
ЕСТЬ ЛИ ВОЗМОЖНОСТЬ УЗНАТЬ О НАЛИЧИИ ИЛИ ОТСУТСТВИИ ВИЧ РАНЬШЕ?
Да, возможно. Первый ИФА (ИХЛА) Ат+Аг тест можно сделать уже через 3 недели после риска, его достоверность будет высокой. Если есть лишние деньги, то можно сделать тест ПЦР ДНК качественный на ВИЧ через 2 недели после риска, его результат тоже даст высокую предварительную достоверность.
Я СДАВАЛ ТЕСТ ЧЕРЕЗ 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 МЕСЯЦЕВ ПОСЛЕ РИСКА. ОНИ ВСЕ ОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ. НО Я ПЛОХО СЕБЯ ЧУВСТВУЮ, У МЕНЯ ЧЕШЕТСЯ ЛЕВАЯ ПЯТКА И ЗУДИТ ПОД ЛЕВОЙ ПОДМЫШКОЙ. У МЕНЯ ТОЧНО ВИЧ, Я УВЕРЕН, ПРОСТО ТЕСТЫ ЕГО НЕ ПОКАЗЫВАЮТ!
ВИЧ у Вас нет. Со СПИДофобией нужно обратится к психиатру очно.
В ЧЕМ РАЗНИЦА МЕЖДУ ИФА И ИХЛА? ЧТО ИНФОРМАТИВНЕЕ?
Иммуноферментный анализ (ИФА) и иммунохемилюминесцентный анализ (ИХЛА) это два способа забить гвоздь, большим красным, или средним зеленым молотком. Результат один и тот же — взаимодействие антигена с антителом или отсутствие такового. Т.е. информация — забитый гвоздь — в итоге одна и та же.
Обычно указания на ИХЛА в отношении диагностики ВИЧ носит характер артефакта, и на самом деле речь идет об ИФА. Т.е. с одной стороны — разницы нет, с другой — правильнее оперировать не названием метода, а названием тест-системы.
КАК УЗНАТЬ ПОКОЛЕНИЕ ТЕСТА, ОПРЕДЕЛЯЕТ ЛИ ОН АНТИГЕН?
Антиген определяется, если известно, что это тест 4-го поколения, если в названии теста фигурируют слова или буквы: антиген, antigen, аг, ag.
КАКИЕ ПОКОЛЕНИЯ ТЕСТОВ СЕЙЧАС ИСПОЛЬЗУЮТСЯ? МОГУТ ЛИ ЭТО БЫТЬ СТАРЫЕ ТЕСТЫ 2-ГО ПОКОЛЕНИЯ?
Все современные тесты — это тесты 3-го (без антигена) или 4-го (с антигеном). Более старые тест-системы не производятся и не используются уже как минимум лет пять. Все современные тесты дают полную достоверность через 12 недель после риска, независимо от их обозначений и поколений.
ЧТО ТАКОЕ ТЕСТЫ 4 ПОКОЛЕНИЯ? ЧЕМ ОТЛИЧАЕТСЯ РАЗНЫЕ ПОКОЛЕНИЯ ИФА?
КАКОГО ПОКОЛЕНИЯ БЫЛ МОЙ ТЕСТ?
ВЫЯВЛЯЕТ ЛИ ИФА ТЕСТ 4 ПОКОЛЕНИЯ ВИЧ-2?
Да, все современные специализированные ИФА-системы выявляют ВИЧ-1 и ВИЧ-2.
Тест-системы 4 поколения способны обнаружить не только антитела к ВИЧ, которые организм вырабатывает в ответ на инфекцию, но и непосредственно ВИЧ, посредством выявления вирусного белка p24. Белок p24 может быть определен очень рано, но его уровень в крови в период после инфицирования постепенно снижается, но одновременно с этим снижением нарастает уровень антител. Все люди разные, потому назвать точный 100% минимальный срок, когда сомневаться в тесте уже нет поводов — невозможно. Однако, на сегодня есть достаточное количество исследований, которые дают нам весьма определенные ориентиры, приведем лишь несколько из них:
ТАК ВСЕ ЖЕ, С КАКОГО СРОКА ИФА 4 ПОКОЛЕНИЯ СОВЕРШЕННО НАДЕЖНО ИСКЛЮЧАЕТ ВИЧ?
Тест 4 поколения может в отдельных случаях выявлять ВИЧ-инфекцию уже через неделю после инфицирования, но ориентироваться на это все же нельзя, потому как это скорее исключение. Как Вы видели выше — месяц вполне надежный срок для современных лабораторных тест-систем.
Я ТЕСТИРОВАЛСЯ НА РАЗНЫХ СРОКАХ, В ТОМ ЧИСЛЕ И ЧЕРЕЗ 6-8 НЕДЕЛЬ, И ЧЕРЕЗ 12 НЕДЕЛЬ (3 МЕСЯЦА ПОСЛЕ ВОЗМОЖНОГО КОНТАКТА) И НЕ МОГУ УСПОКОИТЬСЯ, ПОТОМУ КАК НАБЛЮДАЮ РАЗЛИЧНЫЕ СИМПТОМЫ, В НЕКОТОРЫХ РЕЗУЛЬТАТАХ АНАЛИЗОВ ЕСТЬ ОТКЛОНЕНИЯ И Т.Д. И Т.П. ЧТО ДЕЛАТЬ? ЧТО МНЕ ЕЩЕ СДАТЬ?
Ничего, в данном случае вы имеете дело с неким иным заболеванием, и скорее всего с тревожным или тревожно-депрессивным расстройством. Получите консультацию квалифицированного инфекциониста, а затем, если инфекционная или иная природа будет исключена, то обратитесь за помощью к психотерапевту или психиатру.
ЧТО ТАКОЕ СПЕЦИФИЧНОСТЬ И ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ?
Специфичность диагностического теста – это доля верно определенных тестом заведомо отрицательных образцов.
Иначе говоря, для определения специфичности теста необходимо взять несколько тысяч заведомо здоровых людей и проверить их при помощи теста. Если на каждые 1000 образцов будет получено 10 ложных положительных результатов – то специфичность теста составит: (1000-10)/1000*100%=99%. Если количество ложных срабатываний больше, то специфичность становится меньше (т.е. хуже). Так, специфичность теста 99% означает примерно 10 ложных позитивных результатов на 1000 проверенных здоровых людей.
Внимательно изучите инструкцию и материалы предлагаемых на рынке тестов, найдите информацию о том, каким образом была проверена специфичность. Как правило, это данные по испытаниям нескольких тысяч образцов, полученных из разных географических регионов.
Чувствительность диагностического теста – это доля верно определенных тестом заведомо положительных образцов.
Иными словами, если мы возьмем 100 достоверно ВИЧ-инфицированных людей, проверим их тестом и получим 100 положительных результатов, то чувствительность теста будет равна 100%. Практически у всех тестов на рынке чувствительность 100%.
Нельзя путать понятия точности выявления положительных и отрицательных образцов. Точность выявления положительных образцов — это чувствительность теста, а точность выявления отрицательных образцов — это специфичность.
Чувствительный тест часто дает положительный результат при наличии заболевания (обнаруживает его). Однако, особенно информативен он, когда дает отрицательный результат, т.к. редко пропускает пациентов с заболеванием. Пример — ИФА.
Специфичный тест редко дает положительный результат при отсутствии заболевания. Особенно информативен при положительном результате, подтверждая (предположенный) диагноз. Пример — иммуноблот.
Логично использовать для скрининга (быстрого и дешевого тестирования большого числа пациентов) максимально чувствительный вид тестов, а вот для установления диагноза — максимально специфичные методы. Именно поэтому ИФА исторически является скрининговым, а иммуноблотом подтверждается ВИЧ-инфекция.
Важно понимать, что ложные положительные результаты существуют у всех тестов, никакой тест не может давать 100% специфичности! Результаты экспресс-тестов подлежат особой проверке и перепроверке в лабораторных условиях при помощи других методов. Результаты лабораторных ИФА тестов подлежат перепроверке методом иммуноблотинга.
МОЖЕТ ЛИ ТЕСТ БЫТЬ ЛОЖНОПОЛОЖИТЕЛЬНЫМ?
Да, может. В этом случае в обязательном порядке необходимо сделать проверочный тест иммуноблот, который точно покажет есть у человека ВИЧ или нет.
ПО КАКИМ ПРИЧИНАМ ТЕСТ НА ВИЧ МОЖЕТ БЫТЬ ЛОЖНОПОЛОЖИТЕЛЬНЫМ?
Причин много и все они не известны. Самая частая причина — беременность, также такую вероятность несколько увеличивает недавние вакцинирование некоторыми иммунопрепаратами.
МОЖЕТ ЛИ ТЕСТ БЫТЬ ЛОЖНООТРИЦАТЕЛЬНЫМ?
Может, если он сделан в период окна, который длится до 3-х месяцев после риска инфицирования.
КАКОВЫ ПРИЧИНЫ ЛОЖНООТРИЦАТЕЛЬНОГО РЕЗУЛЬТАТА В ТЕСТЕ НА ВИЧ?
Но, нужно понимать, что тесты 4-го поколения определяют не только антитела, но и антиген p24, который является белком вирусной оболочки, т.е. эти тесты определят ВИЧ-инфекцию, даже если антитела по каким-то причинам задерживаются.
Алкоголь, иные психоактивные вещества, любая пища, БАДы, иммуностимуляторы, иммуномодуляторы, антибиотики и любые иные препараты, стресс, полнолуние, созерцание белого коня, усталость, общая болезненность и ослабленный иммунитет, грипп, ангина и прочие заболевания — все это не оказывает значимого влияния на риски ложноотрицательного результата теста на ВИЧ.
Чувствительность тестов на ВИЧ исследована и подтверждена в реальных условиях и на больших выборках, где люди принимают алкоголь, нервничают, принимают самые разные препараты, болеют различными заболеваниями, имеют самые разные отклонения лабораторных параметров.
Я СДАВАЛ ОБЩИЙ АНАЛИЗ КРОВИ (БИОХИМИЮ ПЕЧЕНИ, ИММУНОГРАММУ, ЛИПИДНЫЙ ПРОФИЛЬ), АНАЛИЗЫ В НОРМЕ. ОЗНАЧАЕТ ЛИ ЭТО, ЧТО У МЕНЯ НЕТ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ?
Нет, не означает. Ни по каким анализам, кроме теста на ВИЧ, невозможно ни исключить ни подтвердить ВИЧ-инфекцию.
Я ПРИНИМАЮ АНТИБИОТИКИ (АНТИДЕПРЕССАНТЫ, ТРАНКВИЛИЗАТОРЫ, НАСТОЙ НА МЫШИНЫХ ХВОСТАХ), БУДЕТ ЛИ ТЕСТ ДОСТОВЕРЕН?
Будет. Никакие препараты, кроме препаратов АРТ в качестве постконтактной профилактики не влияют на достоверность теста на ВИЧ.
Я ПЕРЕД СДАЧЕЙ ТЕСТА ВЫПИЛА СТАКАН ПИВА (БУТЫЛКУ ВОДКИ, СЪЕЛА ДВА ТОРТА, ВЫКУРИЛА 5 ПАЧЕК СИГАРЕТ, КОСЯЧОК МАРИХУАНЫ), НЕ ПОВЛИЯЕТ ЛИ ЭТО НА РЕЗУЛЬТАТ ТЕСТА?
МОЖЕТ БЫТЬ ТАК, ЧТО АНТИГЕН УЖЕ СВЯЗАН АНТИТЕЛАМИ, А АНТИТЕЛ ЕЩЕ МАЛО ДЛЯ ТЕСТА?
Если бы доминирующие ИФА системы отдельно показывали срабатывание At или Ag линии, то мы бы знали (т.е. мы и так это знаем, но вот имели бы статистику по этому поводу), что за редким исключением выявление ВИЧ происходит по At линии, а если бы мы неким волшебным образом знали дату инфицирования, то мы бы знали, что за редким исключением мы выявляем довольно поздно, спустя многие месяцы и годы. В отдельных группах риска под влияем активных действий ситуация может чуть смещаться в сторону более раннего выявления, но это все не меняет погоды по большому счету. Т.е. реальных практических рисков феномен второго окна не несет — любой врач будет рекомендовать и принимать во внимание тестирование на тех сроках, когда с очень высокой вероятностью будет антитела в достаточных для детекции количествах.
А КАКИЕ ПОДТИПЫ ВЫЯВЛЯЕТ ИФА? ЧТО ЕСЛИ Я ЗАРАЗИЛСЯ РЕДКИМ ПОДТИПОМ И ТЕСТ ЕГО НЕ ВИДИТ?
В 2006 ГОДУ ИХ БЫЛО ИЗВЕСТНО ДЕСЯТЬ КАМЕРУНЦЕВ С ГРУППОЙ N, НО СПУСТЯ 5 ЛЕТ, ПОСЛЕ ТЩАТЕЛЬНЫХ ПРОСЕИВАНИЙ ТЫСЯЧ КАМЕРУНЦЕВ НАШЛИ ЕЩЕ… ЧЕТЫРЕ.
По разным оценкам от 400 до 800 тысяч камерунцев живут с ВИЧ, и мы знаем, что возможно до 0,1% являются носителями группы N. Т.е. от 400 до 800 человек на планете.
Важно: все редкие группы и подтипы ВИЧ были выявлены исходно обычным методом ИФА. То, что в технических характеристиках систем не указаны эти подтипы, говорит лишь об одно — число пациентов слишком мало, чтобы можно было бы провести стандартные исследования, для которых требуется не несколько случаев, а сотни, и официально утвердить у регулятора новые строчки в инструкции.
Я СЛЫШАЛА, ЧТО МЕТОДОМ ИФА ВИЧ-2 ВЫЯВЛЯЕТСЯ ПОЗДНЕЕ, ЭТО ТАК?
АПТЕЧНЫЕ ИФА ЭКСПРЕСС-ТЕСТЫ ДОСТАТОЧНО НАДЕЖНЫ?
Экспресс-тесты на антитела к ВИЧ в США одобрены с 2002 года, в том числе ультрабыстрые тесты, чувствительность таких тестов от 93% и специфичность — от 99%. Одобренный и доступный в РФ экспресс-тест Alere Determine HIV ½ Ag/Ab Combo, значительно уступает по способности к обнаружению антигена р24 ВИЧ по сравнению с коммерческими лабораторными системами 4 поколения.
Следует учитывать, что экспресс-тесты значительно чаще лабораторных дают ложный положительный результат. Положительный прогностический результат для РФ у экспресс-тестов будет примерно 50 на 50, т.е. если экспресс-тест дает положительный результат, то в среднем, т.е. для групп низкого риска, вероятность в данном случае наличия ВИЧ-инфекции лишь 50%, и любой положительный результат обязательно требует перепроверки методом ИФА в условиях лаборатории.
МОЖНО ЛИ ПРИМЕНЯТЬ ПЦР РНК ИЛИ ДНК ВИЧ ДЛЯ СКРИНИНГА НА ВИЧ?
Да, можно. но не не рекомендуется. Хотя за последнее десятилетие метод стал значительно дешевле и точнее, но все же он до сих пор и дорог, более длительный, и технически сложен, что предполагает большие риски ошибок. В России, так же впрочем, как и США, количественный метод ПЦР не рекомендован для скрининга и диагностики ВИЧ-инфекции в обычных случаях.
ЧЕМ ОТЛИЧАЕТСЯ ПЦР ДНК ОТ ПЦР РНК ВИЧ?
РНК обычно используется в количественных тестах для оценки вирусной нагрузки у диагностированных лиц, например для оценки эффективности терапии. ДНК — в мононуклеарных клетках, например для диагностики у детей, там, где антитела к ВИЧ матерей мешает использовать метод ИФА. И тот и другой тест могут быть и количественными и качественными. И тот и другой можно в узких случаях применить как диагностический, с учетом конкретных ограничений, которые накладывают технические параметры системы.
У большинства больных антитела к ВИЧ выявляются через 6–12 недель после заражения с использованием тест-систем первых поколений и через 3–4 недели с использованием тест-систем третьего поколения, работающих по принципу сэндвич-ИФА с двумя антигенами. Однако ВИЧ-инфекция выявляется уже спустя 2 недели после заражения путем анализа на антиген p24 и уже через 1 неделю - путем анализа на вирусную РНК. Другими словами, период окна можно сократить до 2 недель и более с помощью комплексного диагностического подхода. Капсидный антиген p24 появляется в крови при бурной репликации вируса в острой лихорадочной фазе ВИЧ-инфекции и в этот период легко обнаруживается с помощью простого и сравнительно дешевого ИФА.
Если стоит задача выявить всех ВИЧ-инфицированных, в том числе лиц с ранними стадиями инфекции, то необходимо использовать весь арсенал анализов: на антитела, на антигены и на РНК. Однако тестирование на вирусную РНК дорого стоит, требует больших трудозатрат и недоступно для большинства лабораторий. И все же те лаборатории, в которых есть оборудование для ИФА, способны выявлять большинство случаев ВИЧ-инфекции при условии тестирования проб как на антитела к ВИЧ, так и на антиген p24.
В конце 1990-х гг. появились тест-системы для параллельного ИФА на антитела к ВИЧ и антиген p24, снявшие необходимость проведения раздельных анализов. Разработано и внедряется новое поколение комбинированных тест-систем для одновременного выявления антител к ВИЧ и антигенов ВИЧ.
Преимущество комбинированных анализов заключается в том, что они занимают меньше времени, требуют меньших трудозатрат и экономически более выгодны, чем раздельные анализы. Комбинированные тест-системы обладают высокой аналитической чувствительностью как за счет применения сэндвич-ИФА с двумя антигенами для выявления антител к ВИЧ, так и за счет одновременного выявления антигена p24.
В настоящее время на рынке имеется 8 комбинированных тест-систем четвертого поколения, прошедших клинические испытания: VIDAS HIV DUO Ultra (bioMérieux; Марси-л’Этуаль, Франция); Enzymun-Test-HIV-Combi (Boehringer; Мангейм, Германия); Vironostika HIV Uni-Form II Ag/AB (Organon Teknika; Бокстел, Нидерланды); AxSYM-HIV Ag/AB (Abbott Laboratories; Эбботт-Парк, Иллинойс, США); Enzygnost HIV Integral (Dade Behring; Марбург, Германия); Genescreen Plus HIV Ag-AB (Bio-Rad), and COBAS Core HIV Combi (Roche Diagnostics; Мангейм, Германия); Elecsys-HIV Combi (Boehringer; Мангейм, Германия). В последней тест-системе применен электрохемилюминесцентный сэндвич-метод с двумя антигенами; анализ занимает 18 минут; специфичность по данным испытаний на госпитализированных больных составляет 99,8%. Эта тест-система позволяет диагностировать ВИЧ-инфекцию на 5 дней раньше, чем самые чувствительные тест-системы на антитела к ВИЧ. Существует еще одна комбинированная тест-система без торговой марки для ИФА на антитела и антиген p24 с чувствительностью всего 99,5% и специфичностью 94,8%.
Комбинированный анализ на антитела и антиген для выявления недавней и длительно существующей ВИЧ-инфекции оправдан не только при тестировании доноров крови, но и во многих клинических ситуациях. Ранний диагноз ВИЧ-инфекции путем выявления антигена p24 позволяет безотлагательно начать лечение, провести консультирование больного и принять меры для снижения риска передачи инфекции. Благодаря способности выявлять антиген p24 тест-системы четвертого поколения позволяют диагностировать ВИЧ-инфекцию на ранних стадиях. Эти тест-системы весьма полезны для диагностики недавней и длительно существующей ВИЧ-инфекции в больничных и независимых клинических лабораториях и диагностических центрах (как бюджетных, так и коммерческих). В подобные учреждения нередко обращаются пациенты, риск ВИЧ-инфекции у которых значительно выше, чем у доноров крови. Для раннего выявления ВИЧ-инфекции у таких пациентов требуются тест-системы с высокой аналитической чувствительностью.
Важно отметить, что высокая аналитическая и эпидемиологическая чувствительность большинства тест-систем четвертого поколения, доказанная в испытаниях на больных из разных популяций, больных с сероконверсией и больных с разными подтипами ВИЧ, делает эти тест-системы незаменимыми для диагноза как недавней, так и длительно существующей ВИЧ-инфекции в самых разных ситуациях. Так, например, в клинических лабораториях бюджетных учреждений здравоохранения тестирование крови на антигены ВИЧ обычно не проводится (это прерогатива станций переливания крови), и поэтому при стандартном тестировании на антитела к ВИЧ случаи недавней инфекции могут быть пропущены. Было показано, что выявление инфекции на ранних стадиях дает основание вовремя начать антиретровирусную терапию, что повышает ее эффективность. Кроме того, появляется возможность своевременно проконсультировать пациента, правильно организовать его ведение и предотвратить передачу ВИЧ-инфекции.
Экспресс-тесты: Это класс тест-систем, дающих результат быстрее, чем через 30 минут. Экспресс-тесты для выявления специфических антител к ВИЧ появились в конце 1980-х гг., а в начале 1990-х гг. приобрели популярность. Благодаря усовершенствованию технологии производства экспресс-тесты стали не менее точными, чем ИФА (при условии, что анализ проводится аккуратно, квалифицированным сотрудником). Однако из-за мнимой простоты экспресс-тестов персонал часто допускает ошибки. Например, при внесении реагентов пипетки не всегда держат вертикально (как указано в инструкции), что нарушает соотношение объемов реагентов. Еще один источник ошибок - стремление многих лаборантов одновременно провести анализ нескольких проб. Из-за этого не выдерживается время этапов анализа.
При правильном выполнении экспресс-тесты на антитела к ВИЧ дают надежные результаты и могут использоваться в самых разных медицинских учреждениях и клинических ситуациях. В частности, их применяют в приемных отделениях, кабинетах врачей, амбулаториях, патологоанатомических отделениях, моргах, пунктах переливания крови, а также везде, где требуется срочное тестирование на ВИЧ (например, после контакта медицинского работника с возможным источником инфекции).
Экспресс-тесты на ВИЧ незаменимы для тестирования рожениц, за которыми не проводилось дородовое наблюдение (т. е. рожениц с невыясненным ВИЧ-статусом). Показано, что антиретровирусная терапия (в частности, зидовудином) эффективно снижает риск вертикальной передачи ВИЧ и что такое лечение в максимально ранние сроки необходимо матери, а затем и новорожденному. Экспресс-тестирование беременной на ВИЧ в предродовом периоде позволяет в случае выявления антител начать лечение до родов.
Самым распространенным методом диагностики ВИЧ-инфекции является иммуноферментный анализ (ИФА) , с помощью которого в сыворотке крови больного выявляются антитела к ВИЧ.
Антитела к вирусу появляются у 90-95 % инфицированных лиц через 4-6 недель от момента заражения, у 5-10% через 3-6 месяцев и у 0,5-1% в более поздние сроки. В связи с этим, период от момента заражения до появления в крови определяемых с помощью общепринятых методов лабораторной диагностики количеств антител к ВИЧ называется "серонегативным окном". В течение этого времени диагноз поставить невозможно, но такой человек может быть источником инфекции и заражать других людей.
Иммуноферментный анализ (ИФА) позволяет выявлять в крови суммарный спектр антител к структурным белкам ВИЧ. В том случае если исследуемая сыворотка или плазма дала дважды положительный результат в ИФА, она тестируется в подтверждающем тесте иммуноблота (II этап). В отличие от ИФА иммуноблот позволяет обнаруживать антитела к индивидуальным белкам вируса. На основании результатов иммуноблота ставится окончательный диагноз ВИЧ-инфекции.
В этом анализе используется два типа реакций: иммунологическая и ферментативная.
Все вариации ИФА основаны на способности антител специфически взаимодействовать только с "собственными" антигенами, т.е. на иммунологической реакции "антиген-антитело".
Наибольшее распространение получил гетерогенный вариант иммуноферментного анализа, при котором антиген (определяемое соединение) или антитела фиксируется на твердой основе, в качестве которой могут выступать полистироловый планшет, полистироловые бусины, пористая подложка или магнитный носитель. Анализ проводят в 3 стадии. В лунку планшета, содержащую на своих стенках тот или иной антиген (т.е. один из белков вируса), добавляют исследуемый биологический материал - сыворотку крови больного. При наличии в организме инфекционного агента, в сыворотке появляются антитела к нему. Они прочно связываются с антигеном и не удаляются при последующей промывке чашки.
На следующем этапе необходимо определить, образовался или нет в лунке иммунный комплекс, то есть произошло ли соединение антигена с антителом. Простым глазом или под микроскопом это нельзя увидеть, поэтому требуются следующие две стадии, которые можно назвать проявляющими.
На второй стадии анализа в лунку вносят специальные (реагирующие с разными антителами) антитела с заранее прикрепленным к ним ферментом (поэтому метод называется ферментным). Слитый в единый комплекс "антитело-фермент" (конъюгат) способен связаться с антителами, уже зацепившимися за антиген, который закреплен на твердой подложке. В результате возникает "молекулярная цепочка", на одном конце которой вирусный белок, а на другом - фермент. После отмывки весь этот многослойный "пирог" остается в лунке планшета. Теперь нужно обнаружить активность фермента, чтобы сделать вывод о наличие антитела. Для этого на третьей стадии в ту же лунку вносят раствор субстрата и специального бесцветного вещества - хромогена, который способен окрашиваться в результате серии биохимических реакций, осуществляемых присутствующим в лунке ферментом. Если в лунке появляется окраска, это означает, что все элементы цепочки присутствуют. Из этого следует вывод: в крови пациента имеются антитела к антигенам ВИЧ и, следовательно, сам пациент инфицирован этим вирусом.
Существуют и другие варианты метода ИФА. Например, можно детектировать не антитела, а сам антиген. Процедура в целом будет похожей, хотя немного более сложной.
Результаты анализа могут быть положительными, отрицательными или сомнительными.
При отрицательном результате и отсутствии подозрения на недавнее (в течение последних 6 месяцев) заражение, можно считать диагноз ВИЧ неподтвержденным. Если есть подозрение на недавнее заражение, проводят повторное исследование.
ИФА может дать как ложноотрицательный, так и ложноположительный результат.
Ложноотрицательный результат ИФА возможен при свежем инфицировании, пока антитела к ВИЧ еще не выработались организмом больного.
Ложноположительные результаты могут быть получены при обследовании больных хроническими заболеваниями и в некоторых других случаях:
Административная ошибка в клинике или лаборатории (на пример, путаница в маркировке образцов или бланков) может привести к неверным результатам, сообщаемым лицам, проходящим тестирование на ВИЧ-инфекцию. Поэтому рекомендуется у всех пациентов с положительной реакцией на наличие антител к ВИЧ взять еще одну пробу крови и исследовать ее на антитела к ВИЧ по той же методике.
Наиболее распространенной причиной ложноположительного теста является вакцинация. Однако описан один случай такого результата при заболевании системной красной волчанкой и в терминальной стадии заболевания почек.
Поэтому при получении положительного результата ИФА его обязательно перепроверяют более чувствительными методами.
Читайте также: