Ифа тест система туберкулеза

Обновлено: 16.04.2024

Универсальный альтернативный вариант иммунологического исследования in vitro диагностики туберкулезного процесса путем количественного определения мононуклеарных клеток периферической крови, продуцирующих ИФН-γ в ответ на присутствие белков CFP-10 и ESAT-6 M. tuberculosis.

Синонимы русские

Иммунологический тест на туберкулез

Синонимы английские

Testing for tuberculosis infection

Метод исследования

Прямая оценка функции T-клеток энзим-связывающий иммуноспотингом (ELISPOT).

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

Не принимать пищу в течение 2-3 часов до исследования, можно пить чистую негазированную воду.

Общая информация об исследовании

Возбудителем туберкулёза является микобактерия туберкулеза (МБТ, палочка Коха, Mycobacterium tuberculosis) – высокоустойчивый микроорганизм. В настоящее время описано около 150 видов микобактерий, но клинически значимыми признаны М. tuberculosis (более 90 % всех случаев туберкулезной инфекции), М. bovis (5 %) и М. africanum (около 3 % – главным образом среди населения стран тропической Африки).

Источником инфекции являются больные люди и животные. Наиболее распространен воздушно-капельный путь заражения, при котором возбудитель проникает в организм через верхние дыхательные пути, иногда через слизистые оболочки пищеварительного тракта или через поврежденную кожу.

Попадая в окружающую среду, возбудитель способен длительно сохраняться: в высохшей мокроте он выживают до 10 месяцев, на предметах, окружающих больного (белье, книги), – более 3 месяцев, в воде – более года, в почве – до 6 месяцев.

В настоящее время описаны следующие варианты развития ситуации после проникновения МБТ в организм человека: [1]

полная элиминация (удаление) возбудителя из организма;
развитие первичного туберкулеза (при быстром росте и размножении МБТ);
инфицирование, или "латентная туберкулезная инфекция" (ЛТИ), [2] – состояние стойкого иммунного ответа на антигены МБТ при отсутствии клинических проявлений активной формы туберкулеза.

Присутствующий в организме возбудитель способен не только длительно бессимптомно персистировать в организме, но при определенных обстоятельствах (интенсивное размножение МБТ на фоне малоэффективного иммунитета и т.д.) реактивироваться и вызвать развитие заболевания. В настоящее время установлено, что с момента инфицирования МБТ в течение первого года заболевание развивается у 5 % инфицированных людей, в течение всей оставшейся жизни туберкулез развивается еще у 5 %, то есть пожизненный риск заболевания туберкулезом среди инфицированных составляет 10 %.

Вместе с тем наличие различных факторов может способствовать повышению риска развития локального туберкулеза: так, при ВИЧ-инфицировании ежегодный риск заболевания туберкулезом на фоне ЛТИ составляет 10 %, а пожизненный риск – 50 %.

Диагностика туберкулеза является комплексной и включает, согласно регламентирующим документам, [3] аллергические внутрикожные пробы (реакция Манту и "Диаскинтест"), инструментальное обследование (ФЛГ, рентген) и лабораторные – направленные как на выявление и идентификацию возбудителя с определением спектра его чувствительности к препаратам этиотропной терапии, так и на изучение выраженности иммунологической реакции на патоген.

Одним из современных и высокоинформативных методов определения специфической иммунной реакции на МБТ, особенно при отсутствии или минимальных клинико-инструментальных признаках инфекции и сомнительных результатах общепринятых методов лабораторной диагностики туберкулеза, является тест T-SPOT.

Исследование иммунного Т-клеточно-опосредованного ответа: количественное определение в крови эффекторных Т-клеток (CD4 и CD8), вырабатывающих ИФН-ɣ (гамма-интерферон), который продуцируется в ответ на стимуляцию специально подобранными антигенами ESAT-6 и CFP10. Эти белки входят в состав клинически значимых МБТ (М. tuberculosis, М. bovis, М. africanum) и отсутствуют у бактерий, используемых при производстве вакцины БЦЖ и у непатогенных для человека микобактерий.

Отдел новых технологий производит более 120 различных тест-систем, 66 из которых представлены в виде дисков с антибиотиками. Выпускаемую продукцию можно разделить на шесть групп по методам анализа.

I. Иммуноферментные тест-системы: туберкулез, лептоспироз, ку-риккетсиоз. Все диагностикумы за исключением одного препарата, используемого для обнаружения Ку-антигена, предназначены для серологических исследований. Интенсивная научная работа ведется по совершенствованию ИФА тест-системы для серодиагностики туберкулеза. Были получены и в настоящее время апробируются новые антигены M. tuberculosis как синтетические, так и генноинженерные.

II. Агглютинационные тесты. Новинка этого раздела – диагностикум эритроцитарный сальмонелезный Vi-антигенный для РПГА, на который получено регистрационное удостоверение.

III. Реагенты для окраски микроорганизмов. Это набор стандартных реагентов.

IV. Реагенты для биохимической идентификации микроорганизмов. Базовый набор (Рапид-энтеро-50М) предназначен для идентификации энтеробактерий до рода и вида по 16 биохимическим тестам. Каждый тест, кроме того, выпускается отдельным набором.

V. Селективные питательные среды и тест-системы для определения чувствительности возбудителей к лекарственным препаратам. Возбудители следующие: M. hominis, U. urealiticum, T. vaginalis, C. albicans и другие. Для урогенитальных микоплазм наборы для определения чувствительности выпускаются в 3 модификациях: на 12 антибиотиков, на 6 антибиотиков и на 4 антибиотика (для обследования беременных). На эти препараты получено 5 регистрационных удостоверений.

Наши новинки из этого раздела:

VI. Диски с антибиотиками, а также индикаторные диски.

История отдела

Отдел новых технологий был создан в НИИЭМ имени Пастера в 1992 году. Долгие годы перестройки он состоял из нескольких человек, по мере появления новых разработок и внедрения их в производство численность отдела росла. В настоящее время отдел новых технологий состоит из 3 лабораторий и одного отделения: лаборатория биопрепаратов, лаборатория иммунохимических технологий, лаборатория молекулярно-биологических технологий и отделение лиофильной сушки и стерилизации. Подробнее об истории отдела вы можете прочитать в соответствующем разделе сайта.

Инструкции по применению

С инструкциями по применению всех препаратов, а также с регистрационными удостоверениями на них вы можете ознакомиться на нашем сайте.

Одной из актуальных социальных задач является совершенствование лабораторной диагностики туберкулёза. По данным Минздравсоцразвития РФ заболеваемость туберкулезом на 100 000 населения в 2012 г. составила 68.1. Растет распространенность туберкулеза со множественной лекарственной устойчивостью возбудителя.

В настоящее время лабораторная диагностика туберкулеза основывается на микробиологических, молекулярно-генетических и иммунологических методах, которые имеют свои ограничения. Так микробиологические и молекулярно-генетические методы трудоемки, длительны. С их помощью не всегда обнаруживают возбудителя в мокроте при латентном течении инфекции. К используемым в практике иммунологическим методам относятся кожно-аллергические пробы - проба Манту и разработанный недавно "Диаскинтест".

Методы оценки клеточного иммунитета

В тесте Манту, используемом для диагностики туберкулеза in vivo, количество ложноположительных реакций составляет от 40 % до 90 %. Это обусловлено тем, что в качестве сенситина используется смесь антигенов возбудителей туберкулеза человека и крупного рогатого скота. Примесь антигенов возбудителя туберкулеза крупного рогатого скота и есть причина низкой специфичности пробы Манту у детей. Наличие этих антигенов связано с обязательной вакцинацией новорожденных инактивированным авирулентным штаммом M. bovis BCG.

В "Диаскинтесте" в качестве сенситина выступают белки ESAT-6 и CFP-10, присущие только M. tuberculosis, что устраняет ложноположительные реакции при лабораторной диагностике туберкулеза. Недостаток этого теста - необходимость вводить сенситины в организм (под кожу) обследуемого, что небезопасно. Кроме того этот тест рекомендован для оценки клеточного иммунитета только у детей.

Перечисленных недостатков лишен клеточный тест "QuantiFERRON TB", используемый in vitro. Он основан на количественном измерении гамма-интерферона, индуцированного специфическими туберкулезными антигенами – ESAT-6, CFP-10 и TB-7.7. Этот тест с высокой чувствительностью и специфичностью дифференцирует здоровых лиц от лиц, инфицированных микобактериями. Однако отличить лиц, инфицированных микобактериями, от больных туберкулезом с помощью этого теста нельзя.

Методы оценки гуморального иммунитета

Кроме клеточного иммунитета при туберкулезе важно оценивать и гуморальный иммунитет. Для этого используют серологические методы, в частности иммуноферментный анализ для обнаружения противотуберкулезных антител класса IgG. Этот метод дифференцирует здоровых лиц от больных туберкулезом.

Современная диагностика основывается на комплексном использовании новых методов оценки клеточного иммунитета ("QuantiFERRON TB") и модифицированных методов оценки гуморального иммунитета (ИФА). Это позволяет проводить дифференциальную диагностику активной и латентной форм заболевания.

Выступление на конкурсе Science Slam Васильевой Елены Викторовны

Иммуноферментная тест-система для обнаружения антител к возбудителю туберкулеза производства ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера

Инструкции к тест-системе для диагностики туберкулеза

Публикации по теме

Автор публикаций — Васильева Елена Викторовна, младший научный сотрудник лаборатории биопрепаратов ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера.

Основная цель иммунологических исследований при туберкулезе - оценка состояния и выявление возможных изменений в иммунной системе, которые могут быть использованы для дифференциальной диагностики. Учитывая многокомпонентность и сложность структуры иммунного ответа, для его оценки необходимо использовать комплекс тестов, отражающих интенсивность как клеточного, так и гуморального иммунитета [1].

Цель работы заключалась в сравнении туберкулезных антигенов, используемых в непрямом варианте ИФА при обнаружении IgG - антител к возбудителю туберкулеза, для оценки гуморального иммунитета. Были изучены два антигена: первый антиген - PPDN-3, который представляет собой ультрафильтрат культур возбудителя туберкулеза штаммов DТSТ и Valee и используется в тест-системе "ИФА-анти-ТУБ", выпускаемой НИИЭМ имени Пастера (г.Санкт-Петербург); второй антиген - специфический рекомбинантный антиген P38 M. tuberculosis, полученный одним из авторов методом генетической инженерии в НИИ биохимии СО РАМН (г.Новосибирск). Сорбцию антигенов в лунках полистирольных планшетов проводили при следующих концентрациях: 2,5 мкг/мл для P38 и 40 мкг/мл для PPDN-3. Методика постановки ИФА - согласно инструкции по применению "ИФА-анти-ТУБ". Для каждого антигена было исследовано в диагностическом разведении 97 сывороток крови, полученных от больных с активным туберкулезным процессом, и 45 сывороток крови от здоровых доноров.

При этом у 12,5 % больных был ответ только на антиген Р38 и у 17,5 % - только на антиген PPDN-3, 52,5 % больных имели антитела к обоим белкам. Из полученных данных следует, что совместное использование микобактериальных антигенов P38 и PPDN- 3 в серодиагностике туберкулеза позволит достигнуть чувствительности 82,5% и специфичности 93,2% (табл. 1). Отсутствие антител у 17,5% больных туберкулезом позволяет предположить, что у них гуморальное звено иммунного ответа не является преимущественным.

Таблица 1.

В качестве маркера для оценки напряженности клеточного иммунного ответа используют гамма-интерферон [2]. Количественное измерение гамма-интерферона (ИФН-гамма) позволяет диагностировать не только острые формы туберкулезной инфекции, протекающие преимущественно с клеточным типом иммунного ответа, но и латентную туберкулезную инфекцию (ЛТБИ). В качестве индуктора гамма-интерферона используют микобактериальный белок ESAT-6, секретируемый микобактериями на ранней стадии роста. Этот белок содержит эпитопы, распознаваемые протективными Т-клетками [3].

Иммунодоминантный белок ESAT-6 был разбит на отдельные, 15-ти членные фрагменты с перекрыванием в 9 аминокислотных остатков с помощью программы PeptGen. Для выделенных фрагментов были синтезированы 15 пептидов длиной 13-15 аминокислотных остатков. Синтез пептидов проводили на многоканальном синтезаторе пептидов Apex 396 на TentaGel полимерах (Rapp Polymere, GmbH) с использованием Fmoc-технологии твердофазного синтеза. В качестве временной защитной группы использовали флюоренилметилоксикарбонильную группу, для защиты боковых цепей трифункциональных аминокислот применялись защиты третбутильного и тритильного типов. После сборки полипептидной цепи полученные пептиды отщепляли от полимера с одновременным удалением постоянных защитных групп под действием трифторуксусной кислоты в присутствии скавенджеров. Чистоту полученных соединений определяли с помощью аналитической обращено-фазовой хроматографии. Масс-спектральный анализ выявил наличие пика молекулярного иона с расчетной молекулярной массой в каждом продукте синтеза.

Для предварительной оценки диагностической значимости полученных пептидов было обследовано 7 больных в возрасте 27-55 лет, проходивших лечение в СПб НИИ Фтизиопульмонологии. Из них с установленными диагнозами: фиброзно-кавернозный туберкулез легких, МБТ(+) - 6 пациентов; туберкулема S6 правого легкого, МБТ(-) - 1 пациент. Обследовано также 3 здоровых донора.

Образцы цельной венозной гепаринизированной крови были разлиты по 1 мл в 3 разные маркированные пробирки: контрольная проба без антигена и 2 опытные пробы, в одну из которых вносили 10 мкл фитогемаглютинина (ФГА) с концентрацией 25 мкг/мл, а в другую - 10 мкл исследуемых пептидов с концентрацией 10 мкг/мл. Лунки с ФГА использовали в качестве положительного контроля. Образцы крови инкубировали при 37 °С в течение 20-24 ч на ротаторе. Затем отбирали по 200 мкл образцов полученной плазмы, в которых определяли концентрацию ИФН-гамма методом твердофазного ИФА. Для оценки продукции ИФН-гамма использовали следующий коэффицент:

ИС = Кинд/Кспн, где ИС - индекс стимуляции, Кинд - значение индуцированной продукции цитокина (пг/мл), Кспн - значение спонтанной продукции цитокина (пг/мл).

Таким образом, комплексное определение наличия антител в диагностическом разведении и количественное определение гамма-интерферона до и после стимуляции иммунокомпетентных клеток крови специфическими митогенами позволит с большей уверенностью ставить диагноз заболевания и, возможно, прогнозировать его тяжесть и излечиваемость.

Антитела к возбудителю туберкулеза (M. tuberculosis) – это специфические иммуноглобулины, вырабатываемые иммунной системой в ответ на инфицирование возбудителем туберкулеза.

Синонимы русские

Суммарные антитела к Mycobacterium tuberculosis, иммуноглобулины класса G и M к возбудителю туберкулеза (микобактерии).

Синонимы английские

Anti-mycobacterium tuberculosis IgA, IgG, IgM, M. tuberculosis antibodies, IgA, IgG, IgM, MBT antibodies, total.

Метод исследования

Иммуноферментный анализ (ИФА).

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

Не курить в течение 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

Туберкулез – это инфекционное заболевание, возбудителями которого являются аэробные микобактерии (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanus, M. microti), распространенные в почве, воде и у животных. Mycobacterium tuberculosis – это вид микобактерий, который вызывает туберкулез у человека в 92 % случаев.

M. tuberculosis передается воздушно-капельным путем от больных туберкулезом в активной форме. У 90 % людей после первичного инфицирования микобактерии оседают в нижних отделах легких и не приводят к развитию заболевания, так как вырабатывается иммунный ответ, не допускающий увеличения количества бактерий. Однако в случае сильного ослабления иммунной системы туберкулезные палочки начинают активно размножаться и туберкулез переходит из латентной формы в активную. Возможно поражение легких, костей, суставов, мочеполовых органов, лимфатической системы, кожи, глаз и нервной системы.

Микроскопическое исследование посева мокроты по-прежнему считается "золотым стандартом" в диагностике туберкулеза. Однако данный метод имеет как свои достоинства (высокая специфичность), так и недостатки (низкая чувствительность, т. к. необходима определенная концентрация бактерий в образце). Эффективность метода ниже в отношении специфических категорий лиц (ВИЧ-инфицированных, людей старше 60 лет и детей, у которых к тому же существуют сложности со сбором мокроты). Кроме того, данное исследование занимает продолжительное время, т. к. для роста бактерий требуется 6-8 недель. Наряду с бактериологическим методом широко распространено рентгенологическое исследование. Оба метода применимы только к легочным формам туберкулеза. С другой стороны, при помощи метода туберкулиновой пробы практически невозможно дифференцировать латентную и активную формы туберкулеза.

Дифференциальная скрининговая диагностика активного туберкулеза возможна при помощи определения специфических антител к М. tuberculosis методом иммуноферментного анализа.

На активной стадии туберкулеза начинается интенсивная выработка IgG и IgM антител к специфическим антигенам, которые могут быть выявлены в сыворотке крови уже через месяц с начала активизации микобактерий. Среди антител при туберкулезе у взрослых обычно преобладают IgG, реже подавляющее количество антител представлено IgA. Антитела IgM у взрослых встречаются достаточно редко и более характерны для начальных стадий заболевания. У детей высокие титры специфических IgA и IgM отмечаются гораздо чаще, причем высокий уровень IgM иногда может сохраняться даже при большом стаже заболевания и относительно низких уровнях IgG и IgA-антител. В целом картина антительного ответа на туберкулез очень индивидуальна, сложна и зависит от большого числа факторов. Данный тест позволяет выявлять суммарный пул специфичных к антигенам микобактерий антител, что дает возможность охватить максимально большой спектр вариантов гуморального ответа на туберкулез. Высокая специфичность теста достигается использованием специфических для M. tuberculosis антигенов, что исключает ложноположительные результаты у вакцинированных и инфицированных другими микобактериями лиц. Чувствительность данной тест-системы составляет от 61 % (туберкулез лимфатических узлов) до 100 % (туберкулезный экссудативный плеврит) в зависимости от локализации инфекции; специфичность – 95 %.

Для чего используется исследование?

Для выявления активного туберкулеза, в особенности внелегочных форм.
Для мониторинга эффективности лечения туберкулеза.
Для выявления инфицированных лиц.
Для подтверждения диагноза (наряду с использованием дополнительных диагностических исследований).

Когда назначается исследование?

Когда известно, что пациент имел длительный контакт с больными туберкулезом или что его работа связана с постоянным контактом с людьми из групп риска (бездомными, инъекционными наркопотребителями, лицами, находившимися в местах лишения свободы).
При соответствующих симптомах: слабости, быстрой утомляемости, субфебрильной температуре тела, ночной потливости, персистирующем кашле в течение 2-3 недель, боли в грудной клетке (легочном туберкулезе), хронических болях в спине, суставах, брюшной области с невыясненной этиологией.
При длительном безрезультатном лечении хронического простатита, цистита, пиелонефритов и при воспалении эндометрия (туберкулезе мочеполовых органов).
При анемии, лейкоцитозе.

Что означают результаты?

Активная форма туберкулеза различной локализации.
Антитела, оставшиеся после перенесенного заболевания.
Тубинфицированность – присутствие микобактерий в организме (если нет клинических проявлений заболевания).

Что может влиять на результат?

Эффективное лечение туберкулеза сопровождается резким увеличением количества антител, уровень которых приходит в норму по истечении некоторого времени.

Читайте также: