Иммунофлюоресцентный метод диагностики туберкулеза

Обновлено: 28.03.2024

Выявление – составная часть борьбы с туберкулезом. Для выявления и диагностики туберкулеза применяются различные методы (туберкулинодиагностика, рентгено-флюорографические, бактериологические), но наиболее информативным, быстрым и экономичным является бактериоскопия мокроты по Цилю – Нельсену у лиц с симптомами, подозрительными на туберкулез (кашель с выделением мокроты более 3 нед, кровохарканье, боли в грудной клетке, потеря массы тела) и рентгенография грудной клетки.

To detect tuberculosis is part of its control programme. For identification and diagnosis of the disease, different (tuberculin diagnostic, X-ray, fluorographic, and bacteriological) methods are used, but the most informative, rapid, and cost-effective ones are Ziehl-Neelsen’s sputum bacterioscopy in individuals with signs of suspected tuberculosis (over 3-week productive cough, hemoptysis, chest pain, weight loss) and chest X-ray.

В.В. Пунга — доктор мед. наук, руководитель отдела Центрального НИИ туберкулеза РАМН, Москва
V.V. Punga — MD, Head of Department, Central Research Institute of Tuberculosis, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow

В ыявление – составная часть борьбы с туберкулезом, направленная на идентификацию случаев туберкулеза в обществе. Выявление больных туберкулезом осуществляется медицинским персоналом учреждений общей лечебной сети при обследовании пациентов, обратившихся за медицинской помощью, а также при плановых профилактических обследованиях определенных групп населения.
Основными методами выявления туберкулеза остаются:
– туберкулинодиагностика;
– рентгенофлюорографические обследования;
– бактериологическая диагностика.
Все эти методы, каждый в отдельности или в комбинации, применяются у разных групп населения: туберкулинодиагностика – у детей и подростков; профилактические флюорографические обследования – у лиц старше 15 лет; бактериологические, рентгенологические обследования, туберкулинодиагностика – у лиц с повышенным риском заболевания туберкулезом, находящихся на диспансерном учете, обращающихся в поликлиники и поступающих в стационар на лечение с симптомами заболевания, подозрительными на туберкулез. Туберкулез поражает различные органы и системы, поэтому для диагностики внелегочного туберкулеза применяются специальные методы обследования в зависимости от локализации заболевания.
Одним из приоритетных направлений в системе противотуберкулезных мероприятий в сложившихся социально-экономических условиях является выявление туберкулеза в учреждениях общей лечебно-профилактической сети среди лиц, обратившихся за медицинской помощью. У всех лиц с симптомами, подозрительными на туберкулез органов дыхания (кашель с мокротой более 2 – 3 нед, боли в грудной клетке, потеря массы тела, субфебрильная температура, потливость, кровохарканье), необходимо исследовать мокроту на микобактерии туберкулеза (МБТ) методом микроскопии мазка по Цилю – Нельсену и провести рентгенографию (флюорографию) грудной клетки. Как показали исследования, проводимые в ряде территорий Российской Федерации (Ивановская, Томская области, республика Марий Эл), этот подход позволяет выявить более половины впервые заболевших туберкулезом органов дыхания с бактериовыделением, наиболее опасных в эпидемиологическом отношении, сократить сроки диагностики туберкулеза и время от первого обращения больного в медицинское учреждение до начала противотуберкулезного лечения. Исследования мокроты методом микроскопии мазка по Цилю – Нельсену необходимо осуществлять во всех клинико-диагностических лабораториях общей лечебной сети. Больных, у которых выявлены МБТ, следует направлять в противотуберкулезные диспансеры для дообследования, подтверждения диагноза туберкулеза, лечения и постановки на учет.
Бактериоскопический метод прост, экономичен и позволяет при положительном результате исследования мазка мокроты установить диагноз туберкулеза органов дыхания. Бактериоскопическому обследованию подлежат обратившиеся в медицинское учреждение лица:
– с явными симптомами заболевания;
– с наличием продолжительного (более 3 нед) кашля с выделением мокроты, кровохарканьем и болями в грудной клетке;
– контактировавшие с бациллярными больными туберкулезом;
– имеющие рентгенологические изменения в легких, подозрительные на туберкулез.
Выявление больных туберкулезом легких бактериоскопическим методом должно осуществляться во всех клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений общей сети: взрослых и детских поликлиниках, республиканских, краевых, областных, городских и центральных районных больницах, клиниках научно-исследовательских институтов, участковых больницах и сельских врачебных амбулаториях, психиатрических больницах, медико-санитарных частях пенитенциарных учреждений и др. Как минимум 3 мазка мокроты необходимо исследовать в лаборатории методом микроскопии по Цилю – Нельсену на кислотоустойчивые бактерии. Первую и вторую пробы мокроты берут в присутствии медицинского работника в день обращения пациента (с промежутком 1,5 – 2 ч), затем ему выделяют посуду для сбора утренней мокроты перед вторым посещением врача. Для получения положительного результата важно правильно организовать сбор мокроты, который следует проводить в отсутствии посторонних людей в отдельной, хорошо проветриваемой комнате. Пациенту необходимо объяснить, как следует откашливать мокроту из более глубоких отделов легких. В поликлинике или больнице все медицинские сестры должны быть обучены методике сбора мокроты. Больной должен откашливать мокроту в присутствии медицинской сестры. Следует попросить больного сделать несколько глубоких вдохов и покашлять в емкость, после чего проверить наличие в емкости мокроты. Если больной не может откашлять мокроту или она отсутствует, материал для исследования можно получить с помощью раздражающих ингаляций, промывания бронхов и желудка.
В первый же день необходимо сделать рентгенографию грудной клетки. В отдельных случаях (например, когда больной живет далеко от лечебного учреждения или ему трудно добираться до него, или его состояние неудовлетворительное) пациента можно госпитализировать на 2 – 3 дня для обследования. В некоторых отдаленных населенных пунктах более целесообразно обучить фельдшеров или других медицинских работников правильному сбору мокроты, консервации и быстрой доставке ее в ближайшую клинико-диагностическую лабораторию; можно также обучить персонал приготовлению мазков мокроты, высушиванию, фиксации с последующей доставкой в ближайшую лабораторию для окрашивания и исследования. Необходимо исследовать не менее 100 микроскопических полей зрения. Если кислотоустойчивые бактерии не обнаружены в 100 полях зрения, необходимо исследовать дополнительно еще 100 полей.
У взрослых диагноз туберкулеза легких подтверждается обнаружением МБТ в мокроте. У детей до 10 лет в связи с трудностью получения мокроты исследуют промывные воды желудка или мазок из гортани. Процедуру проводят рано утром натощак, полученное содержимое собирают в стерильную посуду и направляют в лабораторию для бактериоскопического и культурального исследования.
Чтобы предупредить заражение туберкулезом при сборе мокроты, медицинский работник обязан быть в шапочке, маске, клеенчатом фартуке и резиновых перчатках. Меры предосторожности также должны применяться при хранении и доставке мокроты в лабораторию на исследование. Для хранения и перевозки используют специальные контейнеры или металлические биксы. Если первые мазки оказались положительными, а больной не пришел к врачу повторно, его следует срочно разыскать и вызвать для дообследования, установления диагноза и направления на лечение.
Кроме микроскопии мазка мокроты, окрашенного по Цилю – Нельсену, в лабораториях, оснащенных люминесцентными микроскопами, возможно исследование материала методом люминесцентной микроскопии. Необходимо обязательно проводить посев мокроты на питательные среды у всех больных, так как у части больных МБТ выявляются только культуральным методом. Посев мокроты или другого материала на выделение возбудителя туберкулеза осуществляют в специализированных лабораториях противотуберкулезных учреждений.
Посев мокроты или другого материала (крови, промывных вод желудка, бронхоальвеолярных смывов, плевральной жидкости) повышает число положительных результатов, которые становятся известными через 4 – 8 нед. В настоящее время существуют методы, которые позволяют сократить длительность выявления МБТ: применение сред для бифазного посева, системы БАКТЕК-460, сокращающие в среднем наполовину сроки роста МБТ. Использование системы БАКТЕК-460 технически просто и позволяет идентифицировать МБТ, определить их лекарственную чувствительность в течение недели.
Кроме прямых методов диагностики туберкулеза (бактериоскопия, культуральный метод), используют и непрямые, основанные на серодиагностике и определении в исследуемом материале нуклеиновых кислот МБТ (полимеразно-цепная реакция – ПЦР). Данные, касающиеся чувствительности и специфичности ПЦР, не позволяют еще в настоящее время использовать этот метод в широкой практике. Микроскопическое исследование патологического материала остается пока наиболее быстрым, чувствительным и дешевым методом, позволяющим установить диагноз туберкулеза.
Активный метод выявления туберкулеза, основанный на массовом рентгенофлюорографическом обследовании населения, для большинства территорий в настоящее время крайне затруднен вследствие его высокой стоимости, изношенности аппаратуры и недостаточной результативности. Проведенный в Ивановской области анализ соотношения стоимости – эффективности выявления случая туберкулеза показал, что на выявление больного по обращаемости затрачивается $ 1590, а при профилактическом осмотре – $ 4000. Сплошные профилактические флюорографические обследования всего населения в возрасте 15 лет и старше, проводимые в прежние годы, в настоящее время также могут быть осуществлены по эпидемиологическим показаниям и при достаточных ресурсах. Профилактические флюорографические обследования для активного выявления туберкулеза в настоящее время следует использовать среди отдельных групп населения, где наиболее часто выявляется туберкулез. Рентгенофлюорографический метод в основном позволяет выявить все случаи “абациллярного” туберкулеза легких (в настоящее время регистрируется 45 – 50% случаев).
Туберкулинодиагностика является основным методом раннего выявления инфицирования туберкулезом детей и подростков. Туберкулинодиагностика как специфический диагностический тест применяется при массовых обследованиях населения на туберкулез, а также в клинической практике для диагностики туберкулеза. Для этих целей используется единая внутрикожная туберкулиновая проба Манту с 2 туберкулиновыми единицами (ТЕ) очищенного туберкулина PPD-L. Ежегодная постановка пробы Манту с 2 ТЕ позволяет своевременно выявить лиц с гиперергическими и усиливающимися реакциями на туберкулин, у которых высок риск заболевания, возможны начальные и локальные формы туберкулеза. Проба Манту считается положительной при размере папулы более 5 мм.
Массовую туберкулинодиагностику среди детей и подростков, посещающих детские ясли, сады, школы, колледжи, проводят специальными бригадами (2 медсестры и врач), сформированными при детских поликлиниках. Детям раннего и дошкольного возраста, не посещающим детские учреждения, пробу Манту ставят в детской поликлинике, а в сельской местности ее производят медицинские работники районных сельских больниц и фельдшерско-акушерских пунктов. При правильной организации мероприятий по раннему выявлению туберкулеза ежегодно туберкулинодиагностикой должно охватываться 90 – 95% детского и подросткового населения административной территории.
Проба Манту с 2 ТЕ безвредна как для здоровых детей и подростков, так и для лиц с различными соматическими заболеваниями. Противопоказаниями для постановки туберкулиновой пробы являются кожные заболевания, аллергические состояния, эпилепсия, острые инфекционные заболевания и хронические заболевания в период обострения. В условиях массовой внутрикожной вакцинации (ревакцинации БЦЖ) проба Манту 2 ТЕ выявляет как послевакцинную, так и инфекционную аллергию. Систематическое проведение детям и подросткам внутрикожных туберкулиновых проб позволяет установить первичное инфицирование и осуществлять поиск очага туберкулезной инфекции среди взрослых.
Таким образом, в настоящее время для выявления больных туберкулезом применяются различные методы. Наиболее информативными, простыми, достоверными и экономичными являются бактериоскопическое исследование мокроты у лиц с симптомами, подозрительными на туберкулез (кашель с выделением мокроты более 3 нед, боли в грудной клетке, кровохарканье, потеря массы тела), рентгенография грудной клетки и туберкулинодиагностика у детей и подростков.

1. Джон Крофтон, Норман Хорн, Фред Миллер. // Клиника туберкулеза. – М., 1996.
2. Диагностика туберкулеза легких бактериоскопическим методом. Метод указания МСБТЛЗ. – Париж, Франция, 1995.

Антитела к возбудителю туберкулеза (M. tuberculosis) – это специфические иммуноглобулины, вырабатываемые иммунной системой в ответ на инфицирование возбудителем туберкулеза.

Синонимы русские

Суммарные антитела к Mycobacterium tuberculosis, иммуноглобулины класса G и M к возбудителю туберкулеза (микобактерии).

Синонимы английские

Anti-mycobacterium tuberculosis IgA, IgG, IgM, M. tuberculosis antibodies, IgA, IgG, IgM, MBT antibodies, total.

Метод исследования

Иммуноферментный анализ (ИФА).

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

Не курить в течение 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

Туберкулез – это инфекционное заболевание, возбудителями которого являются аэробные микобактерии (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanus, M. microti), распространенные в почве, воде и у животных. Mycobacterium tuberculosis – это вид микобактерий, который вызывает туберкулез у человека в 92 % случаев.

M. tuberculosis передается воздушно-капельным путем от больных туберкулезом в активной форме. У 90 % людей после первичного инфицирования микобактерии оседают в нижних отделах легких и не приводят к развитию заболевания, так как вырабатывается иммунный ответ, не допускающий увеличения количества бактерий. Однако в случае сильного ослабления иммунной системы туберкулезные палочки начинают активно размножаться и туберкулез переходит из латентной формы в активную. Возможно поражение легких, костей, суставов, мочеполовых органов, лимфатической системы, кожи, глаз и нервной системы.

Микроскопическое исследование посева мокроты по-прежнему считается "золотым стандартом" в диагностике туберкулеза. Однако данный метод имеет как свои достоинства (высокая специфичность), так и недостатки (низкая чувствительность, т. к. необходима определенная концентрация бактерий в образце). Эффективность метода ниже в отношении специфических категорий лиц (ВИЧ-инфицированных, людей старше 60 лет и детей, у которых к тому же существуют сложности со сбором мокроты). Кроме того, данное исследование занимает продолжительное время, т. к. для роста бактерий требуется 6-8 недель. Наряду с бактериологическим методом широко распространено рентгенологическое исследование. Оба метода применимы только к легочным формам туберкулеза. С другой стороны, при помощи метода туберкулиновой пробы практически невозможно дифференцировать латентную и активную формы туберкулеза.

Дифференциальная скрининговая диагностика активного туберкулеза возможна при помощи определения специфических антител к М. tuberculosis методом иммуноферментного анализа.

На активной стадии туберкулеза начинается интенсивная выработка IgG и IgM антител к специфическим антигенам, которые могут быть выявлены в сыворотке крови уже через месяц с начала активизации микобактерий. Среди антител при туберкулезе у взрослых обычно преобладают IgG, реже подавляющее количество антител представлено IgA. Антитела IgM у взрослых встречаются достаточно редко и более характерны для начальных стадий заболевания. У детей высокие титры специфических IgA и IgM отмечаются гораздо чаще, причем высокий уровень IgM иногда может сохраняться даже при большом стаже заболевания и относительно низких уровнях IgG и IgA-антител. В целом картина антительного ответа на туберкулез очень индивидуальна, сложна и зависит от большого числа факторов. Данный тест позволяет выявлять суммарный пул специфичных к антигенам микобактерий антител, что дает возможность охватить максимально большой спектр вариантов гуморального ответа на туберкулез. Высокая специфичность теста достигается использованием специфических для M. tuberculosis антигенов, что исключает ложноположительные результаты у вакцинированных и инфицированных другими микобактериями лиц. Чувствительность данной тест-системы составляет от 61 % (туберкулез лимфатических узлов) до 100 % (туберкулезный экссудативный плеврит) в зависимости от локализации инфекции; специфичность – 95 %.

Для чего используется исследование?

  • Для выявления активного туберкулеза, в особенности внелегочных форм.
  • Для мониторинга эффективности лечения туберкулеза.
  • Для выявления инфицированных лиц.
  • Для подтверждения диагноза (наряду с использованием дополнительных диагностических исследований).

Когда назначается исследование?

  • Когда известно, что пациент имел длительный контакт с больными туберкулезом или что его работа связана с постоянным контактом с людьми из групп риска (бездомными, инъекционными наркопотребителями, лицами, находившимися в местах лишения свободы).
  • При соответствующих симптомах: слабости, быстрой утомляемости, субфебрильной температуре тела, ночной потливости, персистирующем кашле в течение 2-3 недель, боли в грудной клетке (легочном туберкулезе), хронических болях в спине, суставах, брюшной области с невыясненной этиологией.
  • При длительном безрезультатном лечении хронического простатита, цистита, пиелонефритов и при воспалении эндометрия (туберкулезе мочеполовых органов).
  • При анемии, лейкоцитозе.

Что означают результаты?

  • Активная форма туберкулеза различной локализации.
  • Антитела, оставшиеся после перенесенного заболевания.
  • Тубинфицированность – присутствие микобактерий в организме (если нет клинических проявлений заболевания).

Что может влиять на результат?

Эффективное лечение туберкулеза сопровождается резким увеличением количества антител, уровень которых приходит в норму по истечении некоторого времени.

Исследование для выявления возбудителя туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis), в ходе которого с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (РТ-ПЦР) определяется генетический материал (ДНК) микобактерии в образце биоматериала.

Синонимы русские

Туберкулез, микобактерии туберкулеза, палочка Коха.

Синонимы английские

Tuberculosis, Tubercle bacillus, Koch's bacillus.

Метод исследования

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Биоптат, венозную кровь, ликвор, мокроту, плевральную жидкость, первую порцию утренней мочи, эякулят.

Общая информация об исследовании

Туберкулез (от лат. tuberculum – "бугорок") – инфекционное заболевание человека и животных, передающееся преимущественно воздушно-капельным путем. Риск заразиться повышает подавление иммунитета, вызванное ВИЧ/СПИДом, диабетом, заболеванием почек, трансплантацией органов и применением иммуносупрессоров, беременностью, старением. Кроме того, наиболее подвержены ему те, кто контактирует с больными туберкулезом, а также дети до 5 лет после виража туберкулиновой пробы. К наиболее уязвимым группам населения относят бездомных, заключенных, мигрантов из стран с высокой заболеваемостью туберкулезом, наркопотребителей, а также пожилых людей.

Для данного исследования используется тест-система, основанная на выявлении геномной ДНК возбудителя туберкулеза с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени (реал-тайм ПЦР). В современной диагностике это один из самых быстрых, универсальных и высокочувствительных методов.

Стандартные способы обнаружения микобактерий туберкулеза базируются на выращивании патогенных микроорганизмов в питательной среде. Сложности связаны с низкой скоростью роста колоний Mycobacterium tuberculosis – необходимо ожидать до 1,5 месяцев после взятия материала.

Высокой чувствительностью и специфичностью обладают молекулярно-биологические методы, основанные на детекции генетического материала микобактерий туберкулеза. Их важнейшим преимуществом является высокая скорость получения результата. Использование ПЦР реал-тайм позволяет выявить возбудитель туберкулеза уже в день получения клинического образца.

Бактериемия (попадание в кровь пациента микобактерий) может возникать на ранних стадиях туберкулезной инфекции, а также при развитии генерализованного или внелегочного туберкулеза. Она опасна тем, что иммунный ответ на бактерии вызовет сепсис и септический шок, чреватый смертью. Риск развития генерализованного туберкулеза наиболее высок у пациентов с ВИЧ на поздних стадиях, у тех, кто прервал противотуберкулезную терапию, а также у не обратившихся вовремя за медицинской помощью при появлении симптомов туберкулеза.

Диагностика туберкулеза у ВИЧ-инфицированных затруднена из-за иммуносупрессированного состояния организма, что зачастую проявляется в ложноотрицательных результатах туберкулиновых реакций и микробиологических тестов. В связи с этим тестирование на Mycobacterium tuberculosis методом ПЦР реал-тайм имеет большое значение.

Для чего используется исследование?

  • Для диагностики туберкулеза легких (в частности, его генерализованных и внелегочных, связанных с бактериемией, форм), и контроля за его лечением.

Когда назначается исследование?

  • При подозрении на внелегочный туберкулез.
  • При симптомах бактериемии на фоне туберкулезной инфекции: повышенной температуре тела, потливости и пр. (при небольшом количестве бактерий в крови бактериемия может протекать бессимптомно).
  • Если у пациента был длительный контакт с больным туберкулезом.
  • При ненормальной реакции на туберкулиновую пробу у детей.
  • Когда у пациента ВИЧ-инфекция.

Что означают результаты?

Референсные значения: отрицательно.

  • Наличие возбудителя в исследуемом биоматериале. Это обычно встречается при активной форме туберкулеза, требующей лечения. Выявление большого количества микобактерий чаще всего указывает на внелегочную форму туберкулеза либо генерализацию инфекции.
  • Возбудителя туберкулеза не выявлено. Бактериемия отсутствует.

Что может влиять на результат?

Эффективная противотуберкулезная терапия со временем приводит к исчезновению микобактерий в клиническом материале.

Важные замечания

  • Для назначения корректной схемы лечения при выявлении у пациента туберкулеза необходимо провести тест на чувствительность микобактерий к противотуберкулезным препаратам.

Также рекомендуется

Кто назначает исследование?

Врач общей практики, терапевт, фтизиатр, уролог, гинеколог, инфекционист.

Универсальный альтернативный вариант иммунологического исследования in vitro диагностики туберкулезного процесса путем количественного определения мононуклеарных клеток периферической крови, продуцирующих ИФН-γ в ответ на присутствие белков CFP-10 и ESAT-6 M. tuberculosis.

Синонимы русские

Иммунологический тест на туберкулез

Синонимы английские

Testing for tuberculosis infection

Метод исследования

Прямая оценка функции T-клеток энзим-связывающий иммуноспотингом (ELISPOT).

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

  • Не принимать пищу в течение 2-3 часов до исследования, можно пить чистую негазированную воду.

Общая информация об исследовании

Возбудителем туберкулёза является микобактерия туберкулеза (МБТ, палочка Коха, Mycobacterium tuberculosis) – высокоустойчивый микроорганизм. В настоящее время описано около 150 видов микобактерий, но клинически значимыми признаны М. tuberculosis (более 90 % всех случаев туберкулезной инфекции), М. bovis (5 %) и М. africanum (около 3 % – главным образом среди населения стран тропической Африки).

Источником инфекции являются больные люди и животные. Наиболее распространен воздушно-капельный путь заражения, при котором возбудитель проникает в организм через верхние дыхательные пути, иногда через слизистые оболочки пищеварительного тракта или через поврежденную кожу.

Попадая в окружающую среду, возбудитель способен длительно сохраняться: в высохшей мокроте он выживают до 10 месяцев, на предметах, окружающих больного (белье, книги), – более 3 месяцев, в воде – более года, в почве – до 6 месяцев.

В настоящее время описаны следующие варианты развития ситуации после проникновения МБТ в организм человека: [1]

  • полная элиминация (удаление) возбудителя из организма;
  • развитие первичного туберкулеза (при быстром росте и размножении МБТ);
  • инфицирование, или "латентная туберкулезная инфекция" (ЛТИ), [2] – состояние стойкого иммунного ответа на антигены МБТ при отсутствии клинических проявлений активной формы туберкулеза.

Присутствующий в организме возбудитель способен не только длительно бессимптомно персистировать в организме, но при определенных обстоятельствах (интенсивное размножение МБТ на фоне малоэффективного иммунитета и т.д.) реактивироваться и вызвать развитие заболевания. В настоящее время установлено, что с момента инфицирования МБТ в течение первого года заболевание развивается у 5 % инфицированных людей, в течение всей оставшейся жизни туберкулез развивается еще у 5 %, то есть пожизненный риск заболевания туберкулезом среди инфицированных составляет 10 %.

Вместе с тем наличие различных факторов может способствовать повышению риска развития локального туберкулеза: так, при ВИЧ-инфицировании ежегодный риск заболевания туберкулезом на фоне ЛТИ составляет 10 %, а пожизненный риск – 50 %.

Диагностика туберкулеза является комплексной и включает, согласно регламентирующим документам, [3] аллергические внутрикожные пробы (реакция Манту и "Диаскинтест"), инструментальное обследование (ФЛГ, рентген) и лабораторные – направленные как на выявление и идентификацию возбудителя с определением спектра его чувствительности к препаратам этиотропной терапии, так и на изучение выраженности иммунологической реакции на патоген.

Одним из современных и высокоинформативных методов определения специфической иммунной реакции на МБТ, особенно при отсутствии или минимальных клинико-инструментальных признаках инфекции и сомнительных результатах общепринятых методов лабораторной диагностики туберкулеза, является тест T-SPOT.

Исследование иммунного Т-клеточно-опосредованного ответа: количественное определение в крови эффекторных Т-клеток (CD4 и CD8), вырабатывающих ИФН-ɣ (гамма-интерферон), который продуцируется в ответ на стимуляцию специально подобранными антигенами ESAT-6 и CFP10. Эти белки входят в состав клинически значимых МБТ (М. tuberculosis, М. bovis, М. africanum) и отсутствуют у бактерий, используемых при производстве вакцины БЦЖ и у непатогенных для человека микобактерий.

Основная цель иммунологических исследований при туберкулезе - оценка состояния и выявление возможных изменений в иммунной системе, которые могут быть использованы для дифференциальной диагностики. Учитывая многокомпонентность и сложность структуры иммунного ответа, для его оценки необходимо использовать комплекс тестов, отражающих интенсивность как клеточного, так и гуморального иммунитета [1].

Цель работы заключалась в сравнении туберкулезных антигенов, используемых в непрямом варианте ИФА при обнаружении IgG - антител к возбудителю туберкулеза, для оценки гуморального иммунитета. Были изучены два антигена: первый антиген - PPDN-3, который представляет собой ультрафильтрат культур возбудителя туберкулеза штаммов DТSТ и Valee и используется в тест-системе "ИФА-анти-ТУБ", выпускаемой НИИЭМ имени Пастера (г.Санкт-Петербург); второй антиген - специфический рекомбинантный антиген P38 M. tuberculosis, полученный одним из авторов методом генетической инженерии в НИИ биохимии СО РАМН (г.Новосибирск). Сорбцию антигенов в лунках полистирольных планшетов проводили при следующих концентрациях: 2,5 мкг/мл для P38 и 40 мкг/мл для PPDN-3. Методика постановки ИФА - согласно инструкции по применению "ИФА-анти-ТУБ". Для каждого антигена было исследовано в диагностическом разведении 97 сывороток крови, полученных от больных с активным туберкулезным процессом, и 45 сывороток крови от здоровых доноров.

При этом у 12,5 % больных был ответ только на антиген Р38 и у 17,5 % - только на антиген PPDN-3, 52,5 % больных имели антитела к обоим белкам. Из полученных данных следует, что совместное использование микобактериальных антигенов P38 и PPDN- 3 в серодиагностике туберкулеза позволит достигнуть чувствительности 82,5% и специфичности 93,2% (табл. 1). Отсутствие антител у 17,5% больных туберкулезом позволяет предположить, что у них гуморальное звено иммунного ответа не является преимущественным.

Таблица 1.

В качестве маркера для оценки напряженности клеточного иммунного ответа используют гамма-интерферон [2]. Количественное измерение гамма-интерферона (ИФН-гамма) позволяет диагностировать не только острые формы туберкулезной инфекции, протекающие преимущественно с клеточным типом иммунного ответа, но и латентную туберкулезную инфекцию (ЛТБИ). В качестве индуктора гамма-интерферона используют микобактериальный белок ESAT-6, секретируемый микобактериями на ранней стадии роста. Этот белок содержит эпитопы, распознаваемые протективными Т-клетками [3].

Иммунодоминантный белок ESAT-6 был разбит на отдельные, 15-ти членные фрагменты с перекрыванием в 9 аминокислотных остатков с помощью программы PeptGen. Для выделенных фрагментов были синтезированы 15 пептидов длиной 13-15 аминокислотных остатков. Синтез пептидов проводили на многоканальном синтезаторе пептидов Apex 396 на TentaGel полимерах (Rapp Polymere, GmbH) с использованием Fmoc-технологии твердофазного синтеза. В качестве временной защитной группы использовали флюоренилметилоксикарбонильную группу, для защиты боковых цепей трифункциональных аминокислот применялись защиты третбутильного и тритильного типов. После сборки полипептидной цепи полученные пептиды отщепляли от полимера с одновременным удалением постоянных защитных групп под действием трифторуксусной кислоты в присутствии скавенджеров. Чистоту полученных соединений определяли с помощью аналитической обращено-фазовой хроматографии. Масс-спектральный анализ выявил наличие пика молекулярного иона с расчетной молекулярной массой в каждом продукте синтеза.

Для предварительной оценки диагностической значимости полученных пептидов было обследовано 7 больных в возрасте 27-55 лет, проходивших лечение в СПб НИИ Фтизиопульмонологии. Из них с установленными диагнозами: фиброзно-кавернозный туберкулез легких, МБТ(+) - 6 пациентов; туберкулема S6 правого легкого, МБТ(-) - 1 пациент. Обследовано также 3 здоровых донора.

Образцы цельной венозной гепаринизированной крови были разлиты по 1 мл в 3 разные маркированные пробирки: контрольная проба без антигена и 2 опытные пробы, в одну из которых вносили 10 мкл фитогемаглютинина (ФГА) с концентрацией 25 мкг/мл, а в другую - 10 мкл исследуемых пептидов с концентрацией 10 мкг/мл. Лунки с ФГА использовали в качестве положительного контроля. Образцы крови инкубировали при 37 °С в течение 20-24 ч на ротаторе. Затем отбирали по 200 мкл образцов полученной плазмы, в которых определяли концентрацию ИФН-гамма методом твердофазного ИФА. Для оценки продукции ИФН-гамма использовали следующий коэффицент:

ИС = Кинд/Кспн, где ИС - индекс стимуляции, Кинд - значение индуцированной продукции цитокина (пг/мл), Кспн - значение спонтанной продукции цитокина (пг/мл).

Таким образом, комплексное определение наличия антител в диагностическом разведении и количественное определение гамма-интерферона до и после стимуляции иммунокомпетентных клеток крови специфическими митогенами позволит с большей уверенностью ставить диагноз заболевания и, возможно, прогнозировать его тяжесть и излечиваемость.

Читайте также: