Иммунохроматографический анализ при бруцеллезе

Обновлено: 28.03.2024

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА

Animals. Laboratory diagnostics of brucellosis. Serological methods

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГБУ "ВГНКИ")

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 7 июня 2017 г. N 99-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Минэкономики Республики Армения

Госстандарт Республики Беларусь

Госстандарт Республики Казахстан

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 июня 2017 г. N 582-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34105-2017 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2018 г.

5 ВЗАМЕН ГОСТ 25385-91 в части серологических методов диагностики

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на все виды млекопитающих животных и устанавливает следующие методы серологической диагностики бруцеллеза:

- реакция агглютинации с S- и R-бруцеллезными антигенами;

- пластинчатая реакция агглютинации с антигеном, окрашенным бенгальской розовой (роз бенгал проба);

- реакция связывания комплемента;

- реакция длительного связывания комплемента на холоде;

- реакция непрямой гемагглютинации;

- реакция иммунодиффузии в геле агара с олигополисахаридным антигеном;

- реакция иммунодиффузии в геле агара с R-бруцеллезным антигеном;

- кольцевая реакция с молоком;

Примечание - Методы применимы ко всем видам бактерий рода Brucella.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.0.004-2015 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.4.011-89 Система стандартов безопасности труда. Средства защиты работающих. Общие требования и классификация

ГОСТ 1625-2016 Формалин технический. Технические условия

ГОСТ 2651-78 Натрия бихромат технический. Технические условия

ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия

ГОСТ 4220-75 Реактивы. Калий двухромовокислый. Технические условия

ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 5962-2013 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 16445-2012 Сыворотка гемолитическая для реакции связывания комплемента. Технические условия

ГОСТ 16446-2012 Комплемент сухой для реакции связывания комплемента. Технические условия

ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ 17206-96 Агар микробиологический. Технические условия

ГОСТ 18704-78 Кислота борная. Технические условия

ГОСТ 23519-93 Фенол синтетический технический. Технические условия

ГОСТ 25134-2013 Бруцеллин ВИЭВ. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 25794.1-83 Реактивы. Методы приготовления титрованных растворов для кислотно-основного титрования

ГОСТ 29230-91 (ИСО 835-4-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 4. Пипетки выдувные

ГОСТ 33675-2015 Животные. Лабораторная диагностика бруцеллеза. Бактериологические методы

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины, определения и сокращения

3.1 В настоящем стандарте применены термины с соответствующими определениями по ГОСТ 33675.

3.2 В настоящем стандарте применены следующие сокращения:

- РА - реакция агглютинации;

- РСК - реакция связывания комплемента;

- РБП - пластинчатая реакция агглютинации с бруцеллезным роз бенгал антигеном;

- РДСК - реакция длительного связывания комплемента;

- РИД - реакция иммунодиффузии;

- ЛПС - липополисахаридный антиген;

- О-ПС - олигополисахаридный антиген;

- РНГА - реакция непрямой гемагглютинации;

- КР с молоком - кольцевая реакция с молоком;

- ИФА - иммуноферментный анализ;

- ИХА - иммунохроматографический анализ;

- PKг-G - раствор конъюгата, конъюгированного с пероксидазой;

- ФСБ-Т - фосфатно-солевой буферный раствор с твином;

- РБР-С - разводящий буферный раствор для сывороток;

- К+ - инактивированная сыворотка крови животных, содержащая специфические антитела класса G к бактериям рода Brucella (положительный контрольный образец);

- К- - инактивированная сыворотка крови животных, не содержащая специфических антител к бактериям рода Brucella (отрицательный контрольный образец).

Курчева С.А. 1 Тюменцева И.С. 1 Афанасьев Е.Н. 1 Жданова Е.В. 1 Старцева О.Л. 1 Жарникова И.В. 1 Гаркуша Ю.Ю. 1 Семирчева А.А. 1

Анализ сравнительных данных об особенностях течения бруцеллеза позволяет утверждать, что бруцеллез у людей в последнее десятилетие приобрел менее манифестное течение, что затрудняет его диагностику. В таких случаях чрезвычайно актуальными остаются лабораторные методы исследования этой инфекции. Это подчеркивает необходимость совершенствования и разработки новых, более чувствительных и специфических диагностических средств, особенно предполагающих экспресс-тестирование и инструментальный учет результатов тестов. Разработана диагностическая тест-система для выявления специфических антител к возбудителю бруцеллеза в непрямом методе иммуноферментного анализа при исследовании биологического материала от людей и оптимизированы условия её постановки. Приведены результаты, свидетельствующие о достаточно высокой специфичности и чувствительности тест-системы, что позволяет предложить её для рутинной диагностики бруцеллеза в качестве дополнительного или альтернативного теста.


1. Афанасьев Е. Н. Сравнительная характеристика антигенной структуры бактерий рода Brucella: дис. … канд. мед. наук. – Ставрополь, 1983. – 173 с.

2. Конструирование тест-системы диагностической для выявления антител к возбудителю бруцеллеза в непрямом методе иммуноферментного анализа / С. А. Курчева, О. Л. Старцева, А. А. Семирчева, Э. В. Криницына // Актуальные проблемы эпидемиологии и профилактической медицины: материалы VI Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора (22–24 октября 2014 г.), 2014. – С. 127–128.

4. Оценка иммунного статуса и дифференцированная иммунокоррекция при бруцеллезе / Г. М. Курманова, А. К. Дуйсенова, К. Б. Курманова, Н. Х. Спиричева // Методические рекомендации. – Алматы, 2002. – 30 с.

6. Тюменцева И. С., Афанасьев Е. Н., Ефременко В. И., Базиков И. А., Алиева Е. В. Способ получения диагностической сыворотки // Патент на изобретение № 2135210. – 1999.

Бруцеллез – бактериальная инфекционно-аллергическая болезнь, относящаяся к группе зоонозов и занимающая особое положение среди других инфекционных болезней из-за своеобразия возбудителя. Этиопатогенетические особенности бруцеллеза определяют большую склонность заболевания к хроническому течению с длительной персистенцией патогена. Фактор времени не играет абсолютной роли в определении формы или стадии болезни, так острый процесс может развиваться на фоне латентного бруцеллеза, а хроническое течение может развиваться с самого начала болезни. Как правило, после консультации инфекциониста для исключения возможного бруцеллеза кровь пациента тестируют только в реакциях Хеддельсона и Райта, обладающих, по информации ряда авторов, невысокой чувствительностью (35–64 %). Из современных серологических методов диагностики бруцеллеза иммуноферментный анализ (ИФА) является наиболее доступным и распространенным [2, 3, 4]. Явные преимущества этого теста – простота и быстрота выполнения, высокая чувствительность, стабильность реагентов, возможность количественного учета реакции, обработка большого количества проб, автоматизация процесса и объективность инструментального учета результатов [5]. Метод иммуноферментного анализа находится в постоянном развитии. С одной стороны, расширяется число объектов исследования, с другой – углубляются и совершенствуются методы самого анализа [7]. Специфичность и чувствительность ИФА зависит от качества используемых иммунореагентов и оптимизации постановки теста.

Целью настоящей работы стало изучение возможности выявления антител в сыворотках крови людей при хроническом течении бруцеллеза в иммуноферментном анализе.

Проведя анализ полученных результатов, нами была сконструирована экспериментальная тест-система диагностическая для выявления специфических антител в сыворотках крови больных острым и хроническим бруцеллезом в непрямом методе постановки иммуноферментного анализа (нИФА).

Материалы и методы

В качестве сенсибилизирующего агента был апробирован поливалентный бруцеллезный водорастворимый антиген (Аг-в/р), извлеченный по методу Е. Н. Афанасьева из смеси бакмасс Brucella (B.)abortus19ABB. melitensisRev-1, B. suis61, обеззараженных охлажденным до минус 20 оС ацетоном [1].

Конъюгацию кроличьих Ат против Ig G человека с индикаторным ферментом – пероксидазой хрена (ПХ) (тип VI-А, Rz: ~3.0 с активностью 1550 units/mg (Sigma)) проводили по методу перйодатного окисления по P. K. Nakane, A. Kawaoi (1974) в модификации M. B. Wilson, P. K. Nakane (1978).

ОПкрит. = ОПср К- + 0,2 (1),

где ОПсрК- – среднее значение ОП для отрицательного контрольного образца.

Для интерпретации результатов исследования применяли коэффициент позитивности (КП):

КП = ОПиссл. сыв./ ОПкрит. (2).

КП ≥ 1,0 – результат положительный.

Для определения диагностической ценности сконструированной тест-системы использовали сыворотки крови больных и здоровых людей.

Результаты и обсуждение

Основные параметры ИФА, а именно чувствительность, точность и воспроизводимость, могут существенно изменяться при варьировании условий проведения эксперимента (температура, ионная сила и рН реакционной среды, концентрационные соотношения компонентов и продолжительность их взаимодействия). Это определяет необходимость оптимизации каждой стадии анализа, для чего использовали эмпирический подбор параметров постановки теста.

При создании диагностического теста важным моментом является определение его антигенной композиции и условий адсорбции на твердой фазе, т. е. установление оптимальной концентрации антигена (Аг), состава сенсибилизирующего буфера, условий отмывания не связавшихся компонентов, времени и температуры связывания Аг с поверхностью полистироловых планшетов. Оптимальную сенсибилизирующую дозу бактериального агента определяли в серии опытов с сыворотками крови больных бруцеллезом и здоровых людей против иммуноглобулинового пероксидазного коньюгата. В экспериментах испытывали различные концентрации Аг в интервале 10÷300 мкг/мл. Процесс адсорбции Аг оценивали по интенсивности реакции с контрольными сыворотками крови людей. Наиболее оптимальный уровень насыщения поверхности планшет достигался при концентрации белка, равной 100 мкг/мл, при этом сыворотки здоровых людей реагировали отрицательно.

Для определения оптимальных условий сенсибилизации планшета Аг-в/р оценивали интенсивность реакции при инкубации в термостате (37±1) °С в течение (3, 2, 1 ч) и с использованием термошейкера при той же температуре (250 об./мин), а также 18 ч при температуре 4 °С (рисунок 1). Установлен оптимальный режим – при температуре 37 °С в течение 2 ч или в условиях термошейкера в течение 1 ч, в то время как при остальных значениях выдержки адсорбционная способность Аг-в/р, а также специфичность реакции несколько ниже. Инкубация при температуре 4 оС возможна при определенных условиях расчета времени постановки реакции без потери чувствительности и специфичности.


Рис.1. Зависимость КП от изменения условий инкубации

Далее были изучены особенности взаимодействия опытных сывороток крови с иммобилизованным на поверхности полистирола специфическим Аг-в/р с в интервале от 15 до 90 мин при температуре 37 оС и иммунопероксидазным конъюгатом (15; 30 и 40 мин). Как показано на графике (рисунок 2), оптимальное время инкубации сывороток – 60 мин, аинкубацию иммунопероксидазного конъюгата – 30 мин. В более короткий срок – не происходит эффективного взаимодействия компонентов реакции, а увеличение продолжительности инкубации не только удлиняет время постановки реакции, но и способствует появлению фонового окрашивания.


Рис. 2. Зависимость показаний КП от времени инкубации сыворотки и иммуноглобулинового пероксидазного конъюгата

Важным для проведения ИФА является определение кинетики связывания и концентрации пероксидазного конъюгата. В опытах максимальные значения были констатированы при рабочем разведении конъюгата 1:3000 при его взаимодействии с испытуемыми сыворотками – 30 минут при температуре 37 оС.

При испытании чувствительности тест-системы использовали различные разведения (от 1:10 до 1:100) сывороток крови больных острым и хроническим бруцеллезом, которые вносили в лунки планшет сенсибилизированных Аг-в/р. Постановка реакции осуществлялась согласно отработанным параметрам. Чувствительность выявления специфических антител оценивали по средней величине КП. Среднее значение КП при разведении сыворотки 1:10 составляет 2,140±0,129 при разведении сыворотки 1:100 – 2,658±0,221. Число степеней свободы (f) = 13. Парный t-критерий Стьюдента = 3689. Критическое значение t-критерия Стьюдента при данном числе степеней свободы составляет 2,16. tнабл. >tкрит., изменения признака статистически значимы (р<0,05).


Рис. 3. Зависимость показаний коэффициента позитивности от разведения сыворотки

Проведенные исследования позволили сконструировать диагностический набор реагентов тест-систему диагностическую для выявления антител к возбудителю бруцеллеза в нИФА (экспериментальные серии). В состав набора входят следующие компоненты: положительный контроль (инактивированный) – 1 ампула (0,1 мл); конъюгатпероксидазныйиммуноглобулиновый сухой – 1 ампула (0,1 мл); антиген бруцеллезного микроба (полигрупповой) в концентрации 10,0 мг/мл сухой 1 ампула (0,25 мл); фосфатно-солевой буфер (ФСБ), сухая навеска – 1 флакон; бычий сывороточный альбумин (БСА), сухая навеска – 1 флакон; твин 20 – 1 флакон; тетраметилбензидин (ТМБ) – 2 флакона; 4 N раствор серной кислоты (стоп-реагент) – 1 флакон; планшет полистироловый для ИФА однократного применения с объемом лунки 0,4 мл – 1 шт.; скарификатор дисковый ампульный керамический – 1 шт.

Способность тест-системы выявлять антитела к возбудителю бруцеллеза при различных формах заболевания была показана в нИФА с 24 сыворотками больных бруцеллезом людей (рисунок 4). Значения КП при острой форме бруцелеза в основном более 2,0 (средняя арифметическая – 2,86±0,22), при хронической форме значения лежат в диапазоне от 1,0 до 2,0 (средняя арифметическая – 1,53±0,10). Значения t-критерия Стьюдента: 5,50. Различия статистически значимы (р<0,05). Число степеней свободы f=23. Критическое значение t-критерия Стьюдента = 2,069.


Рис. 4. Значения КП при различных формах бруцеллеза (1–10 – сыворотки крови больных хронической формой бруцеллеза; 11–24 – сыворотки крови больных острой формой)

При испытании разработанная тест-система позволяла выявлять антитела к возбудителю бруцеллеза при различных формах заболевания. При этом отмечали отрицательную реакцию с сыворотками крови здоровых людей.

В результате проведенных исследований разработана тест-система для выявления специфических антител к возбудителю бруцеллеза на основе непрямого метода иммуноферментного анализа.

Установлены оптимальные параметры и условия постановки ИФА с разработанной тест-системой: сенсибилизация планшет раствором поливалентного бруцеллезного водорастворимого Аг в 0,1М ФСБ, рН 7,2±0,2 с концентрацией белка 100 мкг/мл в течение 2 ч при температуре 37 °С или 1 ч в условиях термошейкера (250 об/мин; 37 оС); блокировка свободных сайтов связывания – буферным растворомс 0,1 % БСА в присутствии неионного детергентадо 0,05 %; взаимодействие сывороток со специфическим Аг – 60 мин при 37 °С; время экспозиции с иммунопероксидазным конъюгатом – 30 мин при температуре 37 °С.

Таким образом, результатом проведенных исследований стала разработка тест-системы для выявления специфических антител к возбудителю бруцеллеза, позволяющая в течение 3–4 часов (включая предварительную сенсибилизацию) определить наличие их антител в сыворотках крови больных острой и хронической формой бруцеллеза.

В результате испытаний установлены высокая активность и специфичность тест-систем для выявления специфических антител к возбудителю бруцеллеза в сыворотках крови людей, что позволяет предложить их в качестве альтернативного теста в лабораторной диагностике бруцеллеза.

В работе рассматривается метод иммунохроматографического анализа, примененный для серодиагностики (определения специфических антител) бруцеллеза крупного рогатого скота. Отличительной особенностью предлагаемого метода является использование конъюгата коллоидного золота с липополисахаридом (ЛПС) Brucella abortus и нитроцеллюлозной мембраны с иммобилизованным ЛПС Brucella abortus (а не конъюгата антивидовых антител с коллоидным золотом, как в традиционных иммунохроматографических серодиагностических системах). Благодаря наличию у антител нескольких валентностей происходит связывание ими одновременно меченного золотом и иммобилизованного на мембране ЛПС и формирование окрашенной полосы в аналитической зоне. Данный подход позволяет детектировать минимальные концентрации специфических антител на фоне более чем 90 %-ного избытка неспецифических, устраняя мешающее влияние последних на результаты анализа. Эффективность подхода подтверждена при тестировании группы из 39 коров. Показана корреляция результатов, получаемых предлагаемым методом и традиционным иммуноферментным анализом.


1. Резникова Л. С., Эпштейн-Литвак Р. В., Леви М. И. Серологические методы исследования при диагностике инфекционных болезней. – М.: Медгиз, 1962. – 371 с.

2. Abdoel T., Dias I. T., Cardoso R., Smits H. L. Simple and rapid field tests for brucellosis in livestock // Vet. Microbiol. – 2008. – Vol. 130, № 3–4. – Р. 312-319.

3. Bronsvoort B. M. C., Koterwas B., Land F., Handel I. G., Tucker J., Morgan K. L., Tanya V. N., Abdoel T. H., Smits H. L. Comparison of a flow assay for brucellosis antibodies with the reference cELISA test in West African Bos indicus // PLoS One. – 2009. – Vol. 4, № 3–4. – Р. e5221.

4. Byzova N. A., Zvereva E. A., Zherdev A. V. Eremin S. A., Dzantiev B. B. Rapid pretreatment-free immunochromatographic assay of chloramphenicol in milk // Talanta. – 2010. – Vol. 81, № 3. – Р. 843-848.

5. Byzova N. A., Zvereva E. A., Zherdev A. V., Eremin S. A., Sveshnikov P. G., Dzantiev B. B. Pretreatment-free immunochromatographic assay for the detection of streptomycin and its application to the control of milk and dairy products // Anal. Chim. Acta. – 2011. – Vol. 701, № 3–4. – Р. 209-217.

6. Frens G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions // Nature Phys. Sci. – 1973. – Vol. 241. – P. 20-22.

7. Westphal O., Jann K. Bacterial lipopolysaccharides: extraction with phenol-water and further application of the procedure // Whistler R. L., Wolfan M.L., editors. Methods in Carbohydrate Chemistry. Vol. 5. – New York: Academic Press, 1965. – Р. 83-91.

Используемые в настоящее время методы диагностики инфекционных заболеваний направлены в основном на определение возбудителя заболевания и его антигенов либо на выявление иммунного ответа инфицированного организма на антигены возбудителя. К последнему типу относятся методы серодиагностики – определения специфических антител в крови. Несмотря на то, что современные аналитические методы обеспечивают крайне низкий предел обнаружения, в ряде случаев серодиагностический подход оказывается предпочтительным. Гуморальный иммунный ответ всегда сопровождается значительным повышением концентрации специфических антител в крови, делая сыворотку крови универсальным материалом для диагностики разнообразных инфекционных заболеваний [1].

Серодиагностический подход наиболее оправдан при первичных обследованиях, а поскольку для массового скрининга решающее значение имеет скорость получения результата, представляется перспективным сочетание серодиагностики с таким простым и экспрессным методом, как иммунохроматографический анализ (ИХА). Результат ИХА может быть получен за 10–15 мин непосредственно на месте отбора пробы, без дополнительного оборудования и привлечения высококвалифицированного персонала.

Существенным ограничением для применения иммунохроматографии в серодиагностике является необходимость без разделения реагентов выявлять специфические антитела на фоне многократного избытка неспецифических антител. В настоящей работе на примере тест-системы для определения специфических антител против липополисахарида (ЛПС) Brucella abortus рассматривается подход, позволяющий обойти данное ограничение.

Материалы и методы

3. Получение коллоидного золота [6]. К 97,5 мл воды добавляли 1,0 мл 1 %-ного раствора золотохлористоводородной кислоты. Смесь доводили до кипения и при перемешивании добавляли 1,5 мл 1 %-ного раствора цитрата натрия. Кипятили 30 мин, затем охлаждали до комнатной температуры.

Для формирования аналитической зоны использовали препарат ЛПС Br. abortus. На 1 см полосы наносили 2 мкл препарата (1,0 мг/мл в дистиллированной воде).

5. Изготовление иммунохроматографических тест-систем [4, 5]. Полученные подложки и рабочие мембраны сушили на воздухе при 20–22 °C не менее 20 ч. Собирали мультимембранный композит, из которого получали полоски шириной 3,5 мм, используя автоматический гильотинный нарезчик Index Cutter-1 (“A-Point Technologies”, США). Тест-полоски помещали в пластиковые кассеты и герметично упаковывали в пакеты из ламинированной алюминиевой фольги с силикагелем в качестве осушителя с помощью запаивателя с миниконвейером FR-900 (“Wenzhou dingli packing machinery”, Китай).

Результаты и обсуждение

Традиционная схема иммунохроматографического анализа, применяемая для серодиагностики, предполагает взаимодействие всех антител, содержащихся в пробе, с конъюгатом коллоидного золота и реагента для связывания антител (обычно в качестве такового реагента используют антивидовые антитела, белок А Staphylococcus aureus или белок G Streptococcus spp.). После связывания части иммуноглобулинов в пробе конъюгат диффундирует по тест-полоске, и в аналитической зоне небольшая часть связанных иммуноглобулинов, специфичных к патогену, взаимодействует с иммобилизованным в аналитической зоне антигеном. Таким образом, сигнал ИХА (степень связывания окрашенной метки в аналитической зоне) в этом случае зависит не только от концентрации специфических антител, но и от общего содержания иммуноглобулинов в пробе, что не является диагностически значимым параметром и негативно сказывается на достоверности диагностики. Этот принцип лежит в основе разработанных на сегодняшний день ИХА тестов для серодиагностики бруцеллеза [2, 3].

В настоящей работе использован альтернативный подход, основанный на применении поливалентности антител. В данном формате ИХА коллоидное золото конъюгируется с тем же антигеном, который иммобилизован в аналитической зоне. Специфические антитела взаимодействуют разными валентностями с молекулами антигена, иммобилизованными на разных поверхностях: коллоидного золота и рабочей мембраны. В таком случае во взаимодействии принимают участие только специфические антитела.

В качестве антигена был использован ЛПС Br. abortus. Для определения предела обнаружения иммунохроматографических тестов использовали моноклональные антитела против ЛПС Brucella abortus. Чувствительность тестов составила 5 мкг/мл антител – как в буферном растворе, так и в сыворотке крупного рогатого скота, несмотря на то, что сыворотка содержит более 5 мг/мл общих иммуноглобулинов (рис. 1). Таким образом, предложенная тест-система позволяет выявлять менее 0,1 % специфических антител в пробе.


Рис. 1. Иммунохроматографическое выявление специфических антител (5 мкг/мл): А – в фосфатном буфере (pH 7,4); Б – в сыворотке крови крупного рогатого скота. АЗ – аналитическая зона, КЗ – контрольная зона

Разработанный тест был испытан на выборке из 39 коров, больных бруцеллезом. Данные иммунохроматографического тестирования сравнивали с данными иммуноферментного анализа (ИФА). В качестве унифицированной характеристики количества специфических антител в сыворотке использовали величину ее разведения, которая на асимптотической кривой титрования в ИФА соответствует оптической плотности 0,7. Полученные результаты приведены в табл. 1. Как видим, данные, полученные двумя методами, хорошо согласуются друг с другом.

Хронический бруцеллез – зоонозное инфекционно-аллергическое заболевание, вызываемое бактериями рода Brucella, протекающее свыше шести месяцев, характеризуется выраженным полиморфизмом клинических проявлений с преимущественным поражением опорно-двигательной, нервной, мочеполовой и др. систем, склонностью к рецидивирующему течению.

I. ВВОДНАЯ ЧАСТЬ

Название протокола: Хронический бруцеллез
Код протокола:

Код МКБ X:
А23 – Бруцеллез
А23.0 – Бруцеллез, вызванный Brucella melitensis
А23.1 – Бруцеллез, вызванный Brucella abortus
A23.2 - Бруцеллез, вызванный Brucella suis
A23.3 - Бруцеллез, вызванный Brucella canis
A23.8 - Другие формы бруцеллеза
A23.9 - Бруцеллез неуточненный

Дата разработки протокола: 22.04.2013 г.

Сокращения, используемые в протоколе:
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота
ИФА– иммуноферментный анализ
КТ – компьютерная томография
МРТ – магнитно-резонансная томография
ПЦР – полимеразно цепная реакция
РСК – реакция связывания комплемента
РЭГ - реоэнцефалография
СОЭ – скорость оседания эритроцитов
УЗДГ – ультразвуковая допплерография
УЗИ – ультразвуковое исследование
ЦНС – центральная нервная система
ЭКГ - электрокардиография
IgA – иммуноглобулины класса А
IgG – иммуноглобулины класса G
IgM – иммуноглобулины класса М

Категория пациентов: взрослые больные поликлиник и инфекционных стационаров/отделений, многопрофильных и специализированных стационаров, беременные, роженицы и родильницы родильных домов/ перинатальных центров.

Пользователи протокола:
- ВОП ПМСП, врач-терапевт ПМСП, врач-инфекционист ПМСП, врач-невролог ПМСП;
- врач-инфекционист инфекционного стационара/отделения, врач-терапевт, врач-невролог многопрофильных и специализированных стационаров, врач акушер-гинеколог родильных домов/перинатальных центров.

Классификация

Клиническая классификация (Н.Д.Беклемишев (1957), дополнена К.Б.Курмановой, А.К.Дуйсеновой (2002)

Хронический бруцеллез - длительность заболевания свыше 6 месяцев.
Различают 2 формы:
- первично-хронический бруцеллез
- вторично-хронический бруцеллез

Стадии хронического бруцеллеза - определяют по степени нарушения трудоспособности:
- стадия компенсации – наличие симптомов бруцеллеза, не нарушающих трудоспособности больного;
- стадия субкомпенсации – наличие симптомов снижающих трудоспособности больного;
- стадия декомпенсации – наличие симптомов, делающих больного нетрудоспособным.

Органопатология
Опорно-двигательная система: артрит, пери- и параартрит, сакроилеит, остеоартрит, артроз, спондилоартрит, спондилит, спондилодисцит, спондилез, бурсит, тендовагинит фиброзит, периостит, остеохондроз и т.д.

Нервная система:
Центральная нервная система (менингит, энцефалит, миелит, васкулит сосудов головного мозга, вертебро-базилярная недостаточность, гипертензионный, диэнцефальный, гипоталамический синдромы и т.д.).
Периферическая нервная система (неврит, радикулит, плексит, солярит, корешковый синдром и т.д.).
Вегетативная нервная система (вегето-сосудистая дистония, нарушения микроцикуляции, атония кишечника и т.д.).
Психобруцеллез (астеноневротический синдром, депрессивный синдром, галлюциноз и т.д.).
Органы чувств (невриты зрительного и слухового нерва, увеонейрохориоретинит и т.д.).

Сердечнососудистая система (миокардит, перикардит, эндокардит, нарушения ритма и проводимости, миокардиодистрофия, флебит, тромбофлебит и т.д.).

Половая система (орхит, орхоэпидидимит, сальпингооофорит, нарушения менструального цикла, бесплодие и т.д.).

Мочевыделительная система (гломерулонефрит, мочевой синдром и т.д.).

Дыхательная система (бронхит, пневмония – редко).

Пищеварительная система (гепатит, холецистит, гастрит – редко).

Диагностика

ΙΙ. Методы, подходы и процедуры диагностики и лечения

Перечень диагностических мероприятий

Основные:
1. Общий анализ крови
2. Общий анализ мочи
3. Кровь на микрореакцию (сифилис)
4. Микроскопия кала для обнаружения яиц гельминтов
5. Исследование крови в реакции Хеддлсона-Райта

Дополнительные:
1. Исследование крови в РСК с бруцеллезными антигенами
2. ИФА крови для обнаружения Ig классов М, А, G к бруцеллам
3. ПЦР крови для обнаружения ДНК бруцелл
4. Бактериологическое исследование крови для выделения бруцелл
5. Биохимический анализ крови (общий билирубин, прямой билирубин, общий белок, белковые фракции, аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза, ревматоидный фактор, С-реактивный белок).
6. Рентгенологическое исследование опорно-двигательного аппарата.
7. МРТ при поражении позвоночника.
8. КТ головного мозга при нейробруцеллезе.
9. РЭГ или УЗДГ сосудов головного мозга.
10. ЭКГ.
11. УЗИ органов брюшной полости и малого таза.
12. Консультации специалистов: невропатолог; кардиолог; уролог; офтальмолог; фтизиоостеолог; нейрохирург; психиатр; гинеколог; эндокринолог; физиотерапевт.

Обследования, которые необходимо провести до плановой госпитализации:
1. Общий анализ крови
2. Общий анализ мочи
3. Исследование крови в реакции Хеддлсона-Райта

Диагностические критерии

Жалобы и анамнез [2]:
- потливость, ознобы;
- болевой синдром (нейро-артро-миалгии);
- слабость;
- снижение работоспособности;
- эмоциональная лабильность.

Эпидемиологический анамнез:
- Участие в окоте и отеле
- Уход за животными (мелкий и крупный рогатый скот)
- Забой животных и разделка туш, потрошение кишок
- Контакт с сырым мясом, фаршем, внутренними органами животных (печень, почки, легкие, кишки и т.д.)
- Употребление сырого молока или молочных продуктов кустарного производства (брынза, сметана, сливки, творог)
- Употребление недостаточно термически обработанного мяса (шашлык, донер, шаурма и т.д.)
- Обработка шкур животных, пошив изделий из шкур (каракуль)
- Стрижка овец
- Работа с шерстью животных, первичная обработка и т.д.
- Уборка помещений для животных
- Производство мясокостной муки
- Работа на мясокомбинате, мясных рынках
- Работа на молочных комбинатах
- Работа поваром, шашлычником
- Эпидемиологическая связь с известной вспышкой бруцеллеза или подтвержденным случаем бруцеллеза у людей.

Физикальное обследование:
- волнообразная, чаще субфебрильная повышенная температура;
- болевой синдром (нейро-артро-миалгии);
- артриты и/или сакроилеиты и/или спондилоартриты;
- миозиты и/или невриты;
- полилимфоаденопатия;
- увеличение печени.

1) Первично-хронический бруцеллез
- Постепенное начало болезни.
- Наличие субфебрильной температуры, потливости при обострении процесса.
- Преобладают астеновегетативный синдром и локальные поражения.
- Длительность болезни свыше 6 месяцев.
- В анамнезе отсутствует указания на перенесенный острый или подострый бруцеллез.
- Возможность минимального инфицирования бруцеллами в течение длительного времени.
- Чаще первично-хроническим бруцеллезом болеют лица, длительно работающие в хозяйстве, не благополучном по бруцеллезу – ветврачи, доярки, чабаны; или лица, живущие в районе, неблагополучном по бруцеллезу.

2) Вторично-хронический бруцеллез
- Характеризуется субфебрильной температурой, потливостью при обострении процесса.
- Преобладают астеновегетативный синдром и локальные поражения.
- Длительность болезни свыше 6 месяцев.
- Является следствием перенесенного острого или подострого бруцеллеза.

Клиника хронического бруцеллеза
- Умеренная интоксикация – длительный субфебрилитет, слабость, повышенная раздражительность, плохой сон и аппетит, снижение работоспособности.
- Генерализованная лимфаденопатия.
- Изменение локомоторного аппарата – артралгии, бурситы, фиброзиты, целлюлиты. Поражается несколько суставов, в основном крупные.
- В патологический процесс вовлекаются различные отделы позвоночника, особенно пояснично-крестовое сочленение.
- Поражение нервной системы проявляется развитием невритов, плекситов, радикулитов, ишиорадикулитов.
- Возможно развитие бруцеллезного менингита, менингоэнцефалита, арахноидита.
- Нарушается половая функция – у мужчин наблюдаются орхиты, импотенция; у женщин – дисминорея, вторичное бесплодие.

Лабораторное обследование:
1. Общий анализ крови – нормо-лейкопения, гипохромная анемия, нейтропения, лимфоцитоз, моноцитоз, тромбоцитопения, СОЭ – в пределах нормы/незначительно увеличена (нормальные показатели крови: эритроциты: муж. 4-5·10 12 /л, жен. 3-4·10 12 /л; цветовой показатель вычисляется по формуле: гемоглобин (г/л) / число эритроцитов · 3 = 0,9-1,1; гематокрит: муж. 40-54%, жен. 36-42%, гемоглобин: муж. 130-150 г/л, жен. 120-140 г/л; лейкоциты 4-9·10 9 /л; нейтрофилы: палочкоядерные 1-6%; плазматические клетки – отсутствуют; сегментоядерные – 47-72%; моноциты 3-11%; тромбоциты180-320·10 9 /л; СОЭ 6-9 мм/ч).
2. Титр агглютинирующих антител к Brucella в реакции Райта одной или более пробах сыворотки крови, взятой у больного после начала заболевания 1:50 и более.
3. Титр антител в РСК 1:5 и более.
4. Выявление противобруцеллезных антител класса IgG и/или IgM и/или IgA методом ИФА.
5. Бактериологическое исследование крови (посев) для выделения бруцелл, при подозрении на ре- и суперинфицирование.
6. Положительный результат ПЦР [3].

Инструментальное исследование:
- Рентгенологическое исследование опорно-двигательного аппарата;
- МРТ при поражении позвоночника: спондилит, спондилодисцит, превертебральный натечник;
- КТ головного мозга при нейробруцеллезе;
- РЭГ или УЗДГ сосудов головного мозга при васкулите сосудов головного мозга;
- ЭКГ;
- УЗИ органов брюшной полости и малого таза.

Показания для консультации специалистов:
- Невропатолог – для исключения нейробруцеллеза: поражения ЦНС (менингит, энцефалит, миелит)
- Кардиолог (изменения на ЭКГ, эндокардит)
- Уролог (орхит)
- Офтальмолог (поражение органов зрения)
- Фтизиоостеолог (спондилит)
- Нейрохирург (спондилодисцит с пролабацией диска, эпидуральный натечник)
- Психиатр (психобруцеллез)
- Гинеколог (воспалительные процессы, бесплодие)
- Эндокринолог (бесплодие)
- Физиотерапевт (коррекция дополнительного лечения)

Дифференциальный диагноз

Дифференциальный диагноз


Алгоритм дифференциальной диагностики хронического бруцеллеза

Примеры формулировки диагноза:
A23.9 Первично-хронический бруцеллез, стадия субкомпенсации. Полиартралгии.
А23.0 Вторично-хронический бруцеллез, вызванный Brucella melitensis, стадия декомпенсации. Левосторонний гонит. Левосторонний орхит. Вторичное бесплодие.

Лечение

Цели лечения:
1. Купирование признаков обострения локальных процессов;
2. Снижение признаков астеновегетативного синдрома.

Тактика лечения: (Клинические рекомендации ВОЗ, 2006) [6]

Немедикаментозное лечение:
- режим в соответствие с выраженностью локальных проявлений;
- диета №15.

Медикаментозное лечение

Этиотропная терапия
Антибиотики назначают при наличии повышения температуры.

Требования к антибиотикотерапии бруцеллеза:
- Длительность курса не менее 6 недель.
- Комбинация 2-х препаратов, обладающих синергизмом.
- Преемственность стационарного и поликлинического этапов лечения с указанием названия препарата, дозы и длительности лечения.

Возможные антибактериальные препараты:
- Антибиотики тетрациклинового ряда: доксициклин (вибрамицин) в дозе 0,2 г однократно 1 день, в последующие дни по 0,1 г.
- Аминогликозиды: гентамицин по 80 мг через 8 часов в/м.
- Ансамицины: рифампицин по 300 млн ЕД 3 раза в сутки.
- Фторхинолоны: ципрофлоксацин по 500 мг 2 раза в сутки или офлоксацин по 200 мг 2 раза в день 30 дней.
- Комбинированные сульфаниламиды: сульфаметоксазол + триметоприм (бисептол, бактрим) 960 мг перорально 2 раза в сутки.

Лечение неосложненного бруцеллеза
- Ципрофлоксацин по 500 мг 2 раза в сутки + доксициклин 200мг/день (30 дней)
- Доксициклин 200мг/день (30 дней) + гентамицин 0,08 г 3 раза в сутки 1гр/день (7-10 дней)
- Офлоксацин по 200 мг 2 раза в день + доксициклин 200мг/день (30 дней )

Лечение осложненного бруцеллеза:
- Спондиллит – длительная терапия доксициклином – 8 недель и более.
- Нейробруцеллез – поскольку тетрациклины и аминогликозиды не проникают через гематоэнцефалический барьер, рекомендуется рифампицин или сульфаметоксазол+триметопримв комплексе с доксициклином.

Осложненный бруцеллез (эндокардиты, менингиты, септические остеоартриты, абсцессы)
- Доксициклин + 2 других препарата с хорошей активностью (рифампицин, фторхинолон, цефалоспорины III поколения в средних терапевтических дозах). Лечить до купирования симптомов локальных проявлений (до 12 недель).

Лечение бруцеллеза во время беременности:
- Рифампицин по 300 млн ЕД 3 раза в сутки в течение 45 дней.

Патогенетическая терапия:
- Нестероидные противовоспалительные препараты в течение 2-4 недель: диклофенак, кетопрофен.
- Стероидные противовоспалительные средства (в инъекционной форме на 3-7 дней) при поражения ЦНС, орхитах (преднизолон, дексаметазон, гидрокортизон).
- Седативные средства: экстракт валерианы 125 мг, мелиссы 25 мг, мяты перечной 25 мг по 1 таблетке 3 раза в день; настойка пустырника по 30-50 капель 3-4 раза в день.
- Дезинтоксикационная терапия: При легких и средних степенях тяжести процесса больным назначается обильное питье из расчета 20-40 мл/кг жидкости в сутки в виде чая, фруктовых и овощных соков, морсов, минеральной воды. В тяжелых случаях требуется применение парентеральной дезинтоксикации. С этой целью используют кристаллоиды (физиологический раствор, ацесоль, лактосоль, ди- и трисоль и т.п.) и коллоиды (реополиглюкин, раствор гидроксиэтилкрахмала). Кристаллоидные и коллоидные растворы в соотношении 3:1 – 2:1.
- Десенсибилизирующая терапия: лоратадин внутрь по 1 таблетке (10 мг) 1 раз в день, кетотифен по 1 мг 2 раза в сутки (утром и вечером).
- Профилактика дисбиоза кишечника: стерильный концентрат продуктов обмена кишечной микрофлоры (Хилак-форте) капли для приема внутрь по 40-60 капель 3 раза в день (возможно назначение совместно с антибиотиками).

Перечень основных медикаментов:
1. Доксициклин таблетки, 100 мг, 200 мг; капсулы 100 мг;
2. Ципрофлоксацин раствор для инфузий 0,2%, 200 мг/100 мл, концентрат для приготовления раствора для инфузий 100 мг/10 мл; таблетки, покрытые оболочкой 250 мг, 500 мг, 750 мг, 1000 мг;
3. Гентамицин по 80 мг, табл, сироп 240 мг/мл;
4. Рифампицин капсулы 150 мг, 300 мг; лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,15 г;
5. Офлоксацин таблетки, покрытые (пленочной) оболочкой 200 мг, 400 мг, 800 мг; раствор для инфузий 200 мг/100 мл;
6. Сульфаметоксазол + триметопримтаблетки, 120 мг, 480 мг; таблетки, покрытые оболочкой 800 мг/160 мг; раствор для внутривенного введения 480 мг/5 мл; суспензия 120 мг/5 мл, 240 мг/5 мл; суспензия для перорального применения 240 мг/5 мл; сироп 200 мг/40 мг/5 мл.

Перечень дополнительных медикаментов:
1. Диклофенак, табл., драже 25 мг, 50 мг, 75 мг, 100 мг, 150 мг;мазь, гель; раствор для инъекций 75 мг/3 мл, 75 мг/2 мл;
2. Кетопрофен раствор для инъекций 100 мг/мл, 100 мг/2 мл; раствор для внутримышечных инъекций 50 мг/мл; капсула 50 мг, 150 мг; таблетки, таблетки покрытые оболочкой 100 мг, 150 мг;
3. Преднизолон раствор для инъекций в ампулах 25 мг/мл, 30 мг/мл;
4. Дексаметазон раствор для инъекций в ампулах 0,4%;
5. Глюкоза раствор для инфузий 5%, 10%
6. Натрия хлорид растворы для инфузий;
7. Натрия хлорида - 6,0; калия хлорида - 0,39, магния хлорида -0,19; натрия гидрокарбоната - 0,65; натрия фосфата однозамещенного - 0,2; глюкозы - 2,0 раствор для инфузий;
8. Гидроксиэтилкрахмал (пентакрахмал) раствор для инфузий 6%, 10%.
9. Стерильный концентрат продуктов обмена кишечной микрофлоры капли для приема внутрь 30 мл, 100 мл.
10. Лоратадин таблетки, 10 мг.
11. Кетотифен таблетки, 1 мг.
12. Экстракт валерианы 125 мг, мелиссы 25 мг, мяты перечной 25 мг; таблетки.
13. Настойка пустырника (1:5) на 70% спирте; во флаконах по 40 мл или флаконах-капельницах по 50 мл.

Другие виды лечения (назначаются консультантом физиотерапевтом):
- ультрафиолетовые лучи (УФО, соллюкс);
- электрофорез обезболивающих и противовоспалительных средств;
- ультразвук и фонофорез обезболивающих и противовоспалительных средств;
- массаж,
- индукторотерапия;
- магнитотерапия;
- УВЧ-терапия;
- лазеротерапия.

Хирургическое вмешательство: нет.

Дальнейшее ведение:
Санаторно-курортное лечение показано не ранее, чем через 3 месяца после обострения – желательны курорты местного климата: Мерке (Жамбылская область), Муялды (Восточно-Казахстанская область), Жана-Курган (Кызылординская область), Алма-Арасан, Капал-Арасан (Алматинская область).

Индикаторы эффективности лечения и безопасности методов диагностики и лечения:
1. Купирование признаков обострения локальных процессов.
2. Снижение признаков астеновегетативного синдрома.

Анализ на бруцеллез

Серологическое исследование крови, направленное на выявление антител IgG и IgM к возбудителю бруцеллеза, рекомендуется при появлении симптомов, схожих с проявлениями этой патологии, для подтверждения либо опровержения диагноза.

При появлении бактерий в крови начинают продуцироваться иммуноглобулины класса M. Титр их становится максимальным на протяжении первых недель после заражения, после этого постепенно уменьшается. В крови больного антитела IgM можно обнаружить в течение 3-4-х месяцев, что свидетельствует об острой форме недуга.

Продуцирование иммуноглобулинов класса G начинается по истечению месяца после заражения, а продолжаться этот процесс может около года. Обнаружение IgG в крови больного свидетельствует об острой форме бруцеллеза либо о перенесенном ранее инфекционном заболевании, повторном инфицировании, хронической формы болезни.

Под бруцеллезом понимают заболевание инфекционной этиологии, которое отличается затяжным течением, поражением костей и суставов, органов нервной и сердечно-сосудистой систем. Микроорганизмы рода Brucella поступают в организм человека через слизистую дыхательной системы, пищеварительного тракта и кожу. Инкубационный период составляет около 3 недель.

Когда делают анализ на антитела


Высокая температура тела у девушки

  • мигрирующую боль в суставах;
  • температуру тела, которая постоянно держится на отметке 37,9;
  • повышенное потоотделение;
  • сильную слабость и апатию.

Методика проведения анализа

Серологический анализ предполагает взятие крови путем венепункции. Лаборант забирает около 5 мл крови в пробирку, стенки которой он предварительно обрабатывает разделительным гелем. Такая манипуляция позволяет быстро отделить сыворотку от элементов плазмы.

Особой подготовки к обследованию не требуется. Сдавать кровь следует утром натощак. Питьевой режим можно не менять.

Интерпретация результатов анализа


Анализ крови на бруцеллез

Читайте также: