Инактивирующий реагент а для безопасной работы с микобактериями туберкулеза
Обновлено: 19.04.2024
В 2004 году по инициативе д.м.н., профессора Михаила Александровича Владимирского, заведующего сектором молекулярной диагностики туберкулёза НИИ Фтизиопульмонологии Первого МГМУ им. И.М.Сеченова, мы начали разработки в области ПЦР-диагностики туберкулёза.
Выделение ДНК: использование оригинальных реагентов и магнитных частиц обеспечивает получение максимального количества чистой ДНК и позволяет автоматизировать процесс выделения ДНК.
ПЦР в реальном времени: одновременная детекция нескольких различных участков генома комплекса микобактерий туберкулёза (МБТ) увеличивает информативность и достоверность анализа.
I этап – Пробоподготовка, инактивация
II этап – Выделение ДНК
Набор реагентов для выделения ДНК (на магнитных частицах)
Набор реагентов для выделения ДНК микобактерий из клинических образцов и культур клеток на автоматизированных станциях TECAN
- Снижение риска контаминации во время выделения ДНК практически до нуля.
- Значительное уменьшение трудоёмкости процесса выделения ДНК.
- Стандартизированное выделение ДНК из клинических образцов.
- Экономическая выгода: низкий расход пластика и реактивов.
Набор реагентов для ускоренной пробоподготовки и выделения ДНК микобактерий из образцов мокроты
III этап – ПЦР в реальном времени
Обнаружение и количественное определение комплекса МБТ
- высокая достоверность анализа благодаря одновременному обнаружению двух специфичных генов M.tuberculosis complex: IS6110 и regX3;
- оценка пригодности образца ДНК для определения антибиотикоустойчивости;
- высокая чувствительность (не более 100 КОЕ/мл мокроты или 1–10 копий фрагментов ДНК в реакции) и 100%‑ая специфичность, подтверждённые на панели QCMD (Quality Control for Molecular Diagnostics) Mtb EQA (UK).
Определение антибиотикоустойчивости МБТ к препаратам I и II ряда
Наборы реагентов АМПЛИТУБ-МЛУ-РВ, АМПЛИТУБ-FQ-РВ — это:
- диагностика форм туберкулеза с лекарственной устойчивостью, в том числе множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) и широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ);
- быстрая детекция мутаций M.tuberculosis, ассоциирующихся с устойчивостью к антибиотикам первого и второго ряда (рифампицину, изониазиду, этамбутолу, фторхинолонам);
- достоверность результатов, ежегодно подтверждаемая при проведении Федеральной службой внешней оценки качества (ФСВОК) Росздравнадзора испытаний шифрованных тест-культур и образцов.
Наборы АМПЛИТУБ-МЛУ-РВ и АМПЛИТУБ-FQ-РВ основаны на использовании оригинальной мультиконкурентной аллель-специфичной методики ПЦР в реальном времени, позволяющей выявлять мутации в генах микобактерий туберкулеза, ответственных за устойчивость к конкретным антибиотикам.
Принцип мультиконкурентной аллель-специфичной методики ПЦР в реальном времени
- В формате одной пробирки используются 5’-флуоресцентно-меченые аллель-специфичные праймеры с общим комплементарным им 3’-меченым олигонуклеотидом-гасителем и контрольный флуоресцентный зонд, комплементарный участку ДНК без мутаций.
- При отсутствии мутаций в ДНК нарастание флуоресценции в ходе ПЦР-РВ наблюдается только по флуорофору зонда.
- При наличии мутаций в ДНК нарастание флуоресценции в ходе ПЦР-РВ наблюдается как по флуорофору зонда, так и по флуорофору 5’-флуоресцентно-меченого аллель-специфичного праймера. Данный метод позволяет определить не только точку мутации, но и процент устойчивого мутантного штамма МБТ на фоне дикого.
Гены, кодоны, замены, используемые в наборах реагентов
АМПЛИТУБ-МЛУ-РВ при определении антибиотикоустойчивости
Использование автоматизированных станций Freedom EVO (TECAN, Швейцария) для молекулярно-генетической диагностики туберкулёза
Трудозатраты — 1 час
Продолжительность выделения ДНК — не более 2 часов
Подготовка к амплификации и ПЦР-РВ — 1,5 часа
ИТОГО: результаты анализа будут готовы через 3,5 часа
Оператор затратит 1 час своего рабочего времени.
Обзор
Автор
Редакторы
Спонсором приза зрительских симпатий выступил медико-генетический центр Genotek.
Тем не менее диагностика — это еще не диагноз, и результат любого теста не является истиной в последней инстанции. Диагноз же по-прежнему ставят, исходя из нескольких составляющих:
- клинической картины;
- наличия контакта с туберкулезным больным;
- рентгенографии легких, флюорографии или компьютерной томографии;
- результатов диагностических тестов.
Однако большинство этих методов диагностируют туберкулез постфактум — только скрининговые тесты помогают выделить лиц с высоким риском развития заболевания или с только зарождающимся процессом. И уже более 100 лет основным методом массовой диагностики туберкулеза является туберкулиновая проба Манту 2 ТЕ (содержащая 2 туберкулиновые единицы). Тест спорный, со множеством ложноположительных результатов, но именно его используют во всем мире и отказываться пока не собираются.
Проба Манту
В мире используют 3 вида туберкулина (рис. 1): датский препарат PPD (purified protein derivative) RT 23, американский PPD-S и российский — PPD-L. Различаются они видами микобактерий, из которых были получены: при производстве датского и американского препаратов используют только M. tuberculosis, а при производстве российского — смесь из M. tuberculosis и M. bovis (микобактерии, вызывающей туберкулез у крупного рогатого скота; на основе этого штамма была разработана вакцина БЦЖ). Различие в составах туберкулина обусловливает разные границы положительного результата: 15 мм для детей, привитых БЦЖ, и не более 10 мм для непривитых детей до 5 лет у датского препарата, не более 10 мм у американского и 5 мм у российского [4].
Рисунок 1. Препараты туберкулина
Диагностику с помощью пробы Манту проводят следующим образом: небольшое количество туберкулина вводят под кожу чуть выше запястья и через 72 часа оценивают реакцию, которую считают положительной, если в месте введения появляется припухлость (папула) более 5 мм в диаметре. В зависимости от ее размера, различают степень реакции от отрицательной (0–1 мм) до резковыраженной, или гиперергической (17 мм и более у детей и подростков, 21 мм и более у взрослых) [5]. И тут начинаются трудности, потому что у привитых БЦЖ реакция Манту положительна [6]! Мало того, чем больше поствакцинальный рубец, тем выше чувствительность к туберкулину [7]. Поэтому у привитых БЦЖ оценивают не только диаметр папулы, но и размер поствакцинального рубчика (табл. 1).
| Срок, прошедший с момента вакцинации БЦЖ | Размер рубчика после БЦЖ | Привитый иммунитет (мм) | Неясная причина | Подозрение на инфицирование |
|---|---|---|---|---|
| 1 год | 6–10 мм | 5–15 мм | 16 мм | Более 17 мм |
| 2–5 мм | 5–11 мм | 12–15 мм | Более 16 мм | |
| 0 мм | 2–4 мм | 5–11 мм | Более 12 мм | |
| 2 года | Вне зависимости от размера | Уменьшение размера папулы или прежний ее размер | Увеличение размера на 2–5 мм от предыдущего положительного результата | Реакция изменяется на положительную или папула увеличивается более чем на 5 мм |
| 3–5 лет | Вне зависимости от размера | 5–8 мм либо уменьшение размера папулы | Увеличение размера на 2–5 мм за последний год или отсутствие тенденции к уменьшению | Изменение на положительную (5 мм) реакцию или увеличение папулы на 6 мм; 12 мм при впервые поставленной пробе; изменение предыдущего размера на 2–4 мм или размер в 12 мм |
| 6–7 лет | Вне зависимости от размера | 0–4 мм | 5 мм | 6 мм и более |
| 7–9 лет | Если в 7 лет ребенку была сделана ревакцинация БЦЖ, реакция Манту вновь становится положительной и нормы повторяются | 0–4 мм | 5 мм | 6 мм и более |
| Взрослые | Отрицательная реакция, покраснение любого диаметра; папула до 4 мм | Более 5 мм |
Безусловно, метод оценки результата довольно субъективный. Но главное, папулу надо еще правильно измерить, зафиксировав только размер выпуклой части и игнорируя покраснение вокруг нее (рис. 2).
Рисунок 2. Правильная и неправильная оценки диаметра папулы
Еще одна трудность с диагностическими возможностями пробы Манту связана с тем, что они зависят от нижней границы положительного результата: чем ниже граница, тем больше будет наблюдаться ложноположительных реакций. К примеру, в России пороговым значением является папула в 5 мм. Это приводит к гипердиагностике — большому количеству зафиксированных реакций, но в итоге к низкому проценту реально выявленных случаев инфицирования [4].
В общем, не удивительно, что в последнее время информативность туберкулиновой пробы постоянно ставится под сомнение. Мало того, она может вызывать не связанные с туберкулезом аллергические реакции, поэтому все больше здоровых, но склонных к аллергии детей вынуждены идти в тубдиспансер в надежде выяснить причину положительной реакции. И наконец, на результат пробы может влиять множество факторов: недавно перенесенные инфекции, хронические заболевания, прием медикаментов, изменение гормонального фона или иммунитет к нетуберкулезным микобактериям [7].
Если говорить о достоинствах пробы Манту, то кроме низкой себестоимости, ими будут возможность выявления туберкулеза на ранних стадиях развития (за исключением лиц с иммуносупрессией и маленьких детей до двух лет [7]) и более высокая диагностическая ценность у непривитых БЦЖ по сравнению с привитыми (от 50% и ниже против 65,4% [6], [9]).
Мифы о пробе Манту
Рисунок 3. Антигены ESAT-6 и CFP-10
Что нужно знать о кожных пробах?
Анализы крови на туберкулез: плюсы и минусы
- в ранние сроки инфицирования;
- при иммунодефицитных состояниях;
- при неправильном заборе крови или ее транспортировке;
- из-за ошибок во время расшифровки результатов.
Добавлю, что тесты IGRA требуют наличия качественного оборудования, специальных реактивов и квалифицированного персонала, поэтому себестоимость у них довольно высока.
Кроме того, по сравнению с кожными тестами существенным недостатком этих анализов является определение in vitro только образования гамма-интерферона или активности Т-клеток. Поэтому в странах с высокой заболеваемостью (а Россия, несомненно, в их числе с показателем более 50 больных на 100 000 населения [13]) у IGRA-анализов нет никаких дополнительных преимуществ [12]. Тем более что их способность диагностировать туберкулезный процесс колеблется в районе 42–90% для разных возрастных групп, к тому же они не маркируют латентное носительство [12]. Другими словами, для жителей нашей страны анализы крови на туберкулез в общем-то напрасная трата денег, хотя в странах с низкой заболеваемостью (США, Канада, Западная Европа) они более информативны и рекомендованы к замене туберкулиновых проб для привитых БЦЖ [14].
В мире живет более полумиллиарда латентных носителей M. tuberculosis. Причем, далеко не каждый из них в итоге заболевает, потому что размножение микобактерии сдерживает иммунная система. Например, из 100 инфицированных палочкой Коха детей, лишь у одного развивается активная форма туберкулеза, поэтому диагностические тесты направлены не только на выявление латентных носителей, но и на оценку риска развития заболевания [15].
Анализы крови vs кожные тесты: сравнение эффективности
При оценке эффективности тестов для диагностики туберкулеза чаще всего учитывают два параметра: чувствительность (sensitivity) и специфичность (specificity). Под чувствительностью понимают способность метода выявлять лиц с заболеванием или носителей с высоким риском развития туберкулеза. Под специфичностью — способность теста правильно идентифицировать людей, у которых нет туберкулеза (то есть этот параметр характеризует риск появления ошибочных ложноположительных результатов) [12].
Какой тест все-таки выбрать?
Как говорится, при всем богатстве выбора альтернатив немного. К сожалению, при выборе теста многие руководствуются не его диагностическими характеристиками, а безвредностью для здоровья, потому что фенол в составе кожных проб пугает многих. И существует даже движение против пробы Манту, группа поддержки которого периодически предлагает заменить ее анализами крови IGRA. Но, как было отмечено выше, у подобных страхов нет никаких оснований. В придачу, являясь продуктом жизнедеятельности организма, фенол не накапливается, а выводится вместе с мочой. Поэтому главными критериями все-таки являются чувствительность и специфичность тестов.
Обзор
эта и другие иллюстрации Анастасии Смирновой
Авторы
Редакторы
- Биология
- Биотехнологии
- Вакцины
- Иммунология
- Медицина
- Микробиология
- Наглядно о ненаглядном
- Нано(био)технологии
Спонсором приза зрительских симпатий выступил медико-генетический центр Genotek.
. Вот я пришла,
Живу себе,
Пока дела ты мечешь.
А мне вот в твоих легких,
Считаю, жить полегче.
Отрывок из стихотворения А. Матвиенко
Привет, бацилла!
Знакомьтесь, на картинке выше — бактерия Mycobacterium tuberculosis, и она, также как и вы, хочет лишь выжить этой холодной дождливой осенью. Вообще, если быть честным, то хочет она не только выжить, но и размножиться, как и всякий уважающий себя живой организм. И вот тут-то начинается самое интересное, ведь для размножения ей нужны вы. На самом деле, различные микобактерии встречаются в более чем 120 видах различных позвоночных и беспозвоночных животных [1], но для Mycobacterium tuberculosis вы вполне подходите в качестве уютного домика с отличными условиями для размножения. Однако у большинства людей это существо вызывает не симпатию или сочувствие, а инфекционное заболевание, от которого человечество страдает и по сей день, — туберкулез. Человеку же тоже надо жить, размножаться или новые планеты исследовать, например. А когда вы больны туберкулезом, заниматься подобными вещами может оказаться крайне затруднительно. M. tuberculosis поражает не только легкие, распространяясь с капельками в воздухе, но и другие органы и ткани: заражена может быть даже центральная нервная система. Хотя это верно далеко не всегда, ведь многие люди являются носителями инфекции и не подозревают о скрытой угрозе, которая может никогда и не заявить о себе .
На помощь приходят дендритные клетки . Их основная функция — доносить другим клеткам — Т-лимфоцитам (Т-клеткам), — что в организм, между прочим, пробрался враг, и неплохо бы что-то предпринять. На самом деле в организме целое множество разнообразных групп Т-лимфоцитов, выполняющих различные функции . Итогом взаимодействия дендритной клетки и Т-лимфоцита может явиться целый спектр различных процессов, в результате которых должен произойти иммунный ответ с последующим уничтожением патогенных организмов.
Дендритные клетки узнают свою жертву по молекулам на поверхности бактерии. А чтобы передать Т-клеткам информацию о том, что произошло заражение, дендритной клетке необходимо самой разобраться, что это за гость, и для этого фагоцитировать патогенную бактерию.
Далее патоген расщепляется до небольших белковых последовательностей (такая обработка называется процессингом антигена), часть из которых доставляется на поверхность клетки и предъявляется (презентируется) Т-лимфоциту.
Дальше, если повезет, Т-клетка сможет распознать часть этих последовательностей (антигенов). И тогда может начаться подготовка к борьбе с бактериями-захватчиками, которая заключается в созревании и усиленном делении Т-лимфоцитов, что в дальнейшем и должно привести к адекватному иммунному ответу.
Поможем дендритным клеткам?
К классической вакцине от туберкулеза достаточно добавить самособирающиеся пептидные нановолокна (self-assembling peptide nanofibers), которые вступают в игру на этапах, где требуется предъявить части бактерий иммунным клеткам [7].
Самособирающиеся пептиды (self-assembling peptides) — это категория пептидов, которые могут спонтанно организовываться в упорядоченные структуры.
Итак, вот из чего состоит набор молекул, присоединенных к нановолокнам:
Вся эта конструкция, смешанная с вакциной БЦЖ, вводится в виде аэрозоля через нос. Слизистые оболочки — основная зона контакта с патогеном, пришедшим извне. Важно обеспечить взаимодействие нановолокон именно с легочными иммунными клетками, находящимися в легких постоянно .
Важно понимать, что белковые нановолокна не могут моментально избавить от инфекции зараженный туберкулезом организм. Речь идет, в первую очередь, именно о вакцинации, хотя в исследовании представлены также данные о том, что вакцина с нановолокнами приводит к уменьшению количества бактерий и в уже зараженных тканях.
Описанный метод борьбы с туберкулезом дает достоверно более сильный иммунный ответ, если сравнивать с классической вакциной БЦЖ. В классической вакцине содержится ослабленный патоген, и на развитие специфического иммунного ответа требуются недели. Кроме того, имеется ряд ограничений в применении этой вакцины: защитный эффект ослабевает с возрастом, кроме того, нельзя прививать людей с ослабленным иммунитетом и латентной туберкулезной инфекцией.
Читайте также: