Индикация возбудителя сибирской язвы

Обновлено: 19.04.2024

Возбудитель сибирской язвы. Механизмы развития сибирской язвы

Возбудитель- Bacillus anthracis- крупная грамположительная спорообразующая палочка с обрубленными концами размерами до 3-10 мкм в длину и 2 мкм в ширину, неподвижная, располагается в окрашенных препаратах цепочками. В организме животных и человека существует в вегетативной форме, способной к образованию капсул, а во внешней среде - в споровой форме, сохраняющейся годами и десятилетиями, создавая стойкий резервуар инфекции.

Допускается возможность при благоприятных условиях их прорастания и размножения, что потенциально опасно, особенно при попадания возбудителя в воду или в воздух в облаке пыли (болезнь тряпичников). Вирулентность возбудителя связывают с капсульным антигеном, способным подавлять фагоцитарную активность лейкоцитов. Кроме того, возбудитель вырабатывает сильный экзотоксин, состоящий из трех патогенетических факторов белковой природы, отечного, летального и протективного (последний активирует патогенное действие двух других), равно как и вырабатываемые возбудителем протеолитические ферменты.

Оптимальная температура роста возбудителя +32-37°С в нейтральной среде. Вегетативные его формы гибнут при нагревании до 75-80°С в течение минуты, тогда как низкие температуры длительно сохраняют их активность. Споры при кипячении гибнут через 45-60 мин; сухой жар убивает их за 3 ч. Хорошо сохраняются в засоленном мясе, дубленых шкурах; устойчивы к действию дезинфицирующих средств.

При прорыве лимфатического барьера по причине незавершенности фагоцитоза молниеносно развивается геморрагическая септицемия, которая проявляется массивной бактериемией, тяжелой интоксикацией, полиорганными поражениями (отек легких, пневмония, плеврит, медиастинит, менингит и др.), развитием инфекционно-токсического шока (ИТШ) и тромбогеморрагического синдрома (ТГС).

При внедрении возбудителя через дыхательные пути и пищеварительный канал он также размножается в месте проникновения и регионарных ЛУ (медиастинальных, брыжеечных), прорывается в кровь, вызывая геморрагическую септицемию с последующим развитием ИТШ и ТГС. Поражения легких и кишечника в этих случаях носят преимущественно вторичный характер.

Встречаются редкие случаи, когда возбудитель не оставляет следа (при заражении через кожу и слизистую оболочку губ) на месте внедрения и болезнь манифестируется развитием молниеносной геморрагической септицемии (смерть наступает внезапно, в течение нескольких часов и даже десятков минут).

В месте внедрения возбудителя любой локализации развивается серозно-геморрагическое воспаление с резчайшим студневидным геморрагическим отеком и некрозом тканей со скоплением большого количества сибиреязвенных палочек в кровеносных сосудах При внедрении в кожу, обычно на открытых (незащищенных одеждой) участках, чаще рук и лица, образуется типичного вида сибиреязвенный карбункул

При патологоанатомическом исследовании находят выраженное полнокровие органов с жидкой, несвертывающейся кровью. Всюду картина серозно-геморрагического воспаления и резкого отека тканей, включая мозговые оболочки. В тонкой кишке иногда удается обнаружить очаги геморрагического воспаления с изъязвлением и некрозом, с ближайшим геморрагическо-некротическим поражением брыжеечных лимфоузлов. Селезенка, как и при всяком сепсисе, увеличена, дряблая, с обильным соскобом
У переболевших и выздоровевших остается продолжительный иммунитет, повторные заболевания сибирской язвой возможны, но встречаются редко.

Микробиологическая диагностика сибирской язвы. Принципы микробиологической диагностики сибирской язвы. Бактериоскопический, бактериологический, биологический, кожно-аллергический метод диагностики сибирской язвы.

Для микробиологической диагностики сибирской язвы берут содержимое пустулы, гнойное отделяемое из карбункула, кровь, мочу, мокроту, испражнения и рвотные массы. При патологоанатомическом исследовании забирают кусочки органов или целые органы. Все образцы следует помещать в герметичные сосуды и транспортировать закупоренными в опломбированные боксы или деревянные ящики.

Выделение возбудителя сибирской язвы. Проводят окраску материала по Граму и посев на обычные питательные среды. Затем определяют подвижность микроорганизмов из выросших колоний, изучают их биохимические и культуральные свойства. Серологические исследования проводят для распознавания больных и реконвалесцентов. Возбудитель сибирской язвы можно выявлять AT, меченными флюоресцеинами (особенно в смешанных культурах), диффузией в геле, в РСК, РИГА и ИФА.

Кожные пробы применяют для ретроспективной диагностики при эпидемиологических исследованиях. Проводят внутрикожное введение 0,1 мл бактериального аллергена (антраксина).

Реакция термопреципитации по Асколи имеет большое значение, так как позволяет идентифицировать возбудителей сибирской язвы при отрицательных результатах бактериологических исследований. Для прижизненной же диагностики эта реакция не имеет серьёзных преимуществ перед вышеуказанными бактериологическими и серологическими методами.

Биологическая проба при диагностике сибирской язвы. Заражение лабораторных животных проводят одномоментно с посевом на питательные среды. Материал можно вводить белым мышам (по 0,1-0,2 мл в спину), кроликам и морским свинкам (по 0,2-0,5 мл в область живота). Обычно мыши погибают через 1-2 сут, морские свинки и кролики— через 2-4 сут. При выживании животных наблюдение за ними продолжают в течение 10 дней. У павших животных исследуют печень, селезёнку, лимфатические узлы, почки, кровь из полостей сердца и места введения заразного материала. Затем проводят посев исследуемого материала на питательные среды.

Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.

Возбудитель сибирской язвы. Механизмы развития сибирской язвы

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы

1. РАЗРАБОТАНЫ: Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (С.Д.Кривуля, Н.Д.Пакскина); ФГУЗ Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (Е.И.Еременко, А.Н.Куличенко, Н.П.Буравцева, О.И.Цыганкова, А.Г.Рязанова, Е.А.Цыганкова, Л.Ю.Аксенова); ФГУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Роспотребнадзора (Н.А.Осина, И.Н.Шарова, В.Е.Куклев, Е.А.Плотникова, Т.В.Бугоркова); ФГУЗ Иркутский научно-исследовательский институт Сибири и Дальнего Востока Роспотребнадзора (А.В.Родзиковский, З.Ф.Дугаржапова); ФГУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (А.В.Липницкий, А.М.Барков, И.А.Баркова, В.В.Алексеев); ФГУЗ Противочумный центр Роспотребнадзора (В.Е.Безсмертный, С.М.Иванова, В.А.Подледнев); ФГУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора (Л.И.Маринин, И.А.Дятлов, Н.А.Шишкова, А.Н.Мокриевич); ФГУН Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора (Г.А.Шипулин, С.Б.Яцышина); ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии (Ю.О.Селянинов, И.Ю.Егорова).

2. РЕКОМЕНДОВАНЫ к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 3 июля 2008 г. N 2).

3. УТВЕРЖДЕНЫ И ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 29 июля 2008 г.

4. Введены в действие с 1 сентября 2008 г.

5. С введением в действие данных методических указаний при осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора методические указания "Лабораторная диагностика сибирской язвы у животных и людей, обнаружение возбудителя в сырье животного происхождения и объектах внешней среды", утвержденные 01.09.86 начальником Главного управления ветеринарии Госагропромкомитета СССР и начальником Главного управления карантинных инфекций Минздрава СССР, применению не подлежат.

1. Область применения

1.1. Настоящие методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы специалистами других заинтересованных организаций.

1.2. В методических указаниях определены порядок забора, хранения, транспортирования и выполнения лабораторных исследований биологического материала от больных и умерших людей, животных с подозрением на сибирскую язву, а также материала из объектов окружающей среды, подозрительного на контаминацию возбудителем данного заболевания.

ВНИИВВиМ - Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии;

ГИСК - Государственный институт стандартизации и контроля;

ГКИ - Государственный контрольный институт;

ДДМ - диско-диффузионный метод;

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

ИФА - иммуноферментный анализ;

ЛФ - летальный фактор;

МПА - мясопептонный агар;

МПБ - мясопептонный бульон;

МПК - минимальная подавляющая концентрация;

МФА - метод флуоресцирующих антител;

ОФ - отечный фактор;

ПА - протективный антиген;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

РНГА - реакция непрямой гемагглютинации;

РТНГА - реакция торможения непрямой гемагглютинации;

"СОПЭК" - среда для сочетанного определения продукции экзотоксина и капсулы;

ЭДТА - этилендиаминтетераацетата динатриевая соль;

DCL - абсолютная летальная доза;

LD - половинная летальная доза;

MLVA - метод анализа областей генома с вариабельным числом тандемных повторов.

2. Нормативные и методические ссылки

2.1. Санитарно-эпидемиологические правила "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности). СП 1.3.1285-03".

2.2. Санитарные правила "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности. СП 1.2.036-95".

2.3. "Сибирская язва. СП 3.1.089-96, ВП 13.3.1320-96".

2.4. Практическое руководство "Специфическая индикация патогенных биологических агентов", 2006.

2.5. Методические указания "Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности. МУ 1.3.1794-03".

2.6. Методические указания "Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. МУК 4.2.1890-04".

2.7. Методические указания "Обеззараживание биологического материала и объектов внешней среды, зараженных бактериями I-IV групп патогенности, при исследованиях методом ПЦР. МУ 3.5.5.1034-01".

2.8. Методические рекомендации по использованию этилового спирта с 3% перекиси водорода для фиксации на предметном стекле возбудителя сибирской язвы, 1984.

2.9. Методические рекомендации по отбору проб почвы для бактериологического исследования на наличие возбудителей сибирской язвы и актиномицетов-антагонистов, 1984.

2.10. Методические рекомендации "Использование 0,05-0,1% раствора Твина-80, как разводящей жидкости, для определения концентрации спор сибиреязвенного микроба", 1986.

2.11. Методические рекомендации "Определение гемолитической активности у сибиреязвенного микроба", 1989.

2.12. Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные положения, Госкомсанэпиднадзор РФ, 1995.

2.13. Методические рекомендации "Забор, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦР-диагностики". МЗ РФ, ЦНИИЭ, 2004.

2.14. Методические рекомендации "Взаимодействие органов управления, учреждений и специализированных формирований при ликвидации последствий террористических актов с применением патогенных биологических агентов и опасных химических веществ. МР 0100/0556-04-34", 2005.

2.15. Инструкция по определению чувствительности возбудителей опасных инфекционных заболеваний к антибиотикам и химиопрепаратам, 1990.

3. Общие положения

Сибирская язва (Anthrax) - это острое инфекционное заболевание животных и человека, относящееся к группе особо опасных инфекций. Основным источником инфекции для человека при сибирской язве являются больные травоядные животные. Они в течение всего периода болезни выделяют возбудитель с мочой, испражнениями и слюной в почву, которая становится его дополнительным резервуаром. Заражение животных происходит главным образом алиментарным (через корм и питьевую воду, инфицированные спорами), реже - трансмиссивным (через укусы кровососущих насекомых) и воздушным путями.

В подавляющем большинстве случаев человек заражается сибирской язвой при разделке туш вынужденно убитого скота; употреблении в пищу полученных от него мяса или мясных продуктов; непосредственном контакте с трупами погибших животных, шерстью, шкурами, кожей, щетиной, зараженными возбудителем; уходе за больными животными. Возможно также заражение через укусы кровососущих насекомых, контаминированную почву и при вдыхании содержащего споры аэрозоля.

В зависимости от путей заражения у человека развивается кожная или висцеральная (кишечная, легочная) формы сибирской язвы. Любая из этих форм может приводить к развитию сепсиса и осложняться сибиреязвенным менингитом (генерализованная форма).

Возбудитель этой инфекции в 2001 г. в США был использован как средство биологического терроризма, что привело к человеческим жертвам и возникновению паники среди населения. Поэтому своевременная и точная лабораторная диагностика сибирской язвы приобретает сейчас особое значение.

Диагностика сибирской язвы у человека и животных основывается на эпизоотологических, эпидемиологических, клинических, лабораторных и патологоанатомических данных. Лабораторные исследования направлены на обнаружение и идентификацию возбудителя сибирской язвы, выявление специфических антител и аллергической перестройки в организме больных людей.

3.1. Краткие сведения о возбудителе сибирской язвы

Возбудитель сибирской язвы - В. anthracis, относится к семейству спорообразующих микроорганизмов Васillасеае, роду Bacillus. В роду Bacillus, насчитывающем 101 вид, выделяют группу видов Bacillus cereus, в которую входят близкородственные В. cereus, В. anthracis, В. thuringiensis, В. mycoides и недавно признанный новым видом психротолерантный микроб В. weichenstephanensis.

Морфология В. anthracis. В зависимости от стадии развития культуры, а также условий окружающей среды, возбудитель сибирской язвы может существовать в трех формах - в виде бескапсульных вегетативных палочек (бацилл), инкапсулированных палочек и спор.

Процесс спорообразования состоит из четырех основных стадий: подготовительной, образования проспор, готовых спор и зрелых спор. Спорогенез зависит от особенностей штамма, наличия тех или иных питательных веществ, рН среды, температуры выращивания, влажности и др.

При попадании спор в благоприятные условия (влажность, аэрация, температура, наличие необходимых питательных веществ) из них быстро образуются вегетативные клетки. Время прорастания спор может составлять несколько часов и зависит от температуры (оптимум - 37 °С) и других факторов.

Культурально-биохимические свойства. Сибиреязвенный микроб - факультативный анаэроб, оптимальная температура роста 34-37 °С, оптимальное значение рН 7,2-7,8, неподвижный, хорошо растет на обычных питательных средах - МПБ и МПА. Характер роста в совокупности с другими признаками учитывается при идентификации.

При посевах на чашки Петри с питательным агаром после суточной инкубации при (36±1) °С микроб формирует крупные шероховатые сухие матовые колонии в R-форме, с "шагреневой" поверхностью, с неровными краями и отходящими от них волнистыми отростками. При малом увеличении под микроскопом (7x10) они напоминают локоны волос или львиную гриву (прилож.7, рис.4).

Характерный придонный рост сибиреязвенного микроба в МПБ или 1%-й пептонной воде похож на комочек ваты, с трудом разбивающийся при встряхивании, при этом бульон остается прозрачным (прилож.7, рис.5).

Сибиреязвенный микроб способен разлагать с образованием кислоты без газа глюкозу, мальтозу, сахарозу и некоторые другие сахара, но не разлагает лактозу. Обладает относительно низкой протеолитической активностью и при посеве уколом в столбик 10-12%-го мясопептонного желатина и выращивании при 22 °С рост микроба напоминает елочку, опрокинутую верхушкой вниз; на 3-5 день желатин разжижается в виде воронки. Большинство сапрофитов полностью разжижает желатин в более короткие сроки. При росте на кровяном агаре с 3-5% дефибринированной крови барана через 20-24 ч гемолиз не наблюдается, в то время как многие сапрофиты дают быстрый гемолиз (через 12-18 ч при 37 °С). Большинство штаммов сибиреязвенного микроба не образует фермент лецитиназу. При росте на агаре с куриным желтком вокруг колоний не происходит помутнения среды в виде беловатой зоны, а при посеве на жидкую желточную среду желток не свертывается даже при 5-6-суточном инкубировании. Сапрофиты свертывают желток в течение 6-10 ч. Сибиреязвенный микроб, в отличие от сапрофитных бацилл, обладает низкой фосфатазной активностью и не способен разлагать фосфаты, добавляемые в питательную среду (тест на фосфатазу).

Большинство штаммов сибиреязвенного микроба чувствительны к пенициллину и при выращивании на МПА или МПБ в присутствии 0,5-0,05 ЕД/мл бензилпенициллина через 3 ч инкубирования образуют цепочки из шарообразных клеток - "жемчужное ожерелье" (прилож.7, рис.6).

До 95% штаммов сибиреязвенного микроба лизируется сибиреязвенными бактериофагами "Гамма", "К" и Fah-ВНИИВВиМ (прилож.7, рис.7).

Чувствительность к антибиотикам. Возбудитель сибирской язвы чувствителен к большинству антибиотиков - цефалоспоринам I поколения, тетрациклинам, рифампицинам, аминогликозидам и фторхинолонам. Пенициллин способен задерживать развитие сибиреязвенного микроба даже при низкой концентрации в питательной среде. К некоторым макролидам сибиреязвенный микроб умеренно устойчив, а к цефалоспоринам II-IV поколения устойчив.

Факторы вирулентности (агрессии). Возбудитель сибирской язвы обладает почти универсальной патогенностью для млекопитающих - человека и других приматов, сельскохозяйственных и диких животных, лабораторных животных.

Важнейшими факторами патогенности у микроба являются капсула и экзотоксины. Сибиреязвенный микроб образует их в инфицированном макроорганизме или при культивировании на искусственных питательных средах в специальных условиях.

Наличие капсулы необходимо на первых этапах инфекционного процесса для предотвращения опсонизации и фагоцитирования микроорганизма.

Типичные вирулентные штаммы В. anthracis образуют капсулу в организме больных людей и животных, а также при культивировании на 1%-м бикарбонатно-сывороточном агаре в атмосфере, содержащей 5-50% углекислоты или на жидкой среде ГКИ, содержащей 40% инактивированной бычьей (лошадиной) сыворотки и 60% раствора Хенкса. На 1%-м бикарбонатном агаре микроб растет в SM-форме в виде гладких, блестящих, влажных, слизистых колоний с неровными краями (прилож.7, рис.8).

Геном типичных штаммов сибиреязвенного микроба представлен одной кольцевой хромосомой и двумя плазмидами. Токсинообразование и капсулообразование детерминированы плазмидами рХО1 и рХО2. Отсутствие хотя бы одной из этих плазмид приводит к снижению вирулентности вплоть до полной ее утраты.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для выявления возбудителя сибирской язвы в низкой концентрации из объектов внешней среды. Способ включает подготовку материала, концентрирование его селективной сорбцией на магноиммуносорбентах путем встряхивания суспензии исследуемого материала и магноиммуносорбентов с концентрацией 5-6 мкл/мл в течение 15-20 мин, культивирование в селективной среде в присутствии ингибиторов роста сопутствующей микрофлоры, в качестве которых используют смесь полимиксина и триметаприма в равных количествах с концентрацией смеси 23-25 мкг/мл, кипячение пробы в течение 1 ч, отделение супернатанта и последующее его исследование в полимеразной цепной реакции. Изобретение обеспечивает повышение надежности индикации микроорганизмов из объектов внешней среды, повышение его чувствительности.

Формула изобретения

Способ индикации возбудителя сибирской язвы в объектах внешней среды, включающий подготовку исследуемого материала и его концентрирование, посев материала в питательную среду, культивирование, кипячение пробы в течение 1 ч, отделение супернатанта и его исследование в полимеразной цепной реакции, отличающийся тем, что концентрирование исследуемого материала осуществляют селективной сорбцией на магноиммуносорбентах путем встряхивания суспензии исследуемого материала и магноиммуносорбентов с концентрацией 5-6 мкл/мл в течение 15-20 мин, отмывкой в магнитном поле стерильным физиологическим раствором, культивирование проводят в селективной среде в течение 1,5-2,0 ч с использованием в качестве ингибиторов роста сопутствующей микрофлоры смесь полимиксина и триметаприма в равных количествах с концентрацией смеси 23-25 мкг/мл.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано дня выявления возбудителя сибирской язвы в низкой концентрации в объектах внешней среды (почва, вода, смывы, сточные воды, воздух и др.).

Трудности индикации Bacillus anthracis в объектах внешней среды обусловлены не только низкой концентрацией, но и сходством его с другими видами аэробных спорообразующих микроорганизмов рода Bacillus.

Традиционные методы индикации возбудителя сибирской язвы включают подготовку суспензии пробы, приготовление мазков, окрашивание их антиспоровой люминисцирующей сывороткой и микроскопию с использованием люминисцентного микроскопа. Чувствительность этого метода не превышает 10 5 спор/мл пробы и чаще всего недостаточна для обнаружения возбудителя в почве. Кроме того, даже адсорбированные люминисцирующие глобулины не дают 100% специфичности и могут давать ложноположительные результаты со спорами Bacillus cereus и Bacillus thuringiensis (Буравцева Н.П. с соавт., 1998).

В последнее время интенсивно развиваются способы детекции возбудителей инфекционных заболеваний в биологическом материале и объектах внешней среды с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), которые позволяют обнаружить микроб с чувствительностью 10-100 м.к./мл в течение 5-6 ч.

В основе ПЦР лежит амплификация участка генома путем многократного копирования специфичной для данного микроорганизма нуклеотидной последовательности (Лабораторная диагностика возбудителей опасных инфекционных болезней. Т.2. Саратов, 1998, с.162-169).

Индикация сибиреязвенного микроба в объектах внешней среды, например, почве, стоках и т.д., методом ПЦР затрудняется низкой концентрацией микроорганизмов, присутствием посторонней микрофлоры, наличием споровых форм, которые трудно поддаются лизированию, а следовательно получению ДНК, необходимой для проведения реакции.

Представляет интерес селективное концентрирование микроорганизмов магноиммуносорбентами. Известен набор устройств и приспособлений для различных манипуляций с магноиммуносорбентами (Пат. РФ 2098828, G 01 N 33/553, С 12 М 1/00, 10.12.97. Бюл. 34).

При селективном концентрировании микроорганизмов на магносорбентах с иммобилизированными на их поверхности специфическими антителами значительно повышается надежность и чувствительность индикации микроорганизмов в объектах внешней среды за счет реакции антиген-антитело.

Однако такие методы обнаружения могут использоваться для установления присутствия или отсутствия патогеннных бактерий, а для определения их эпидзначимости требуются дальнейшие исследования.

В клинической практике проведен ряд исследований по объединению иммуномагнитной сорбции и полимеразной цепной реакции с последующей гибридизацией ДНК-зондом для обнаружения бактерий в патологическом материале.

На магнитные носители наносятся специфические иммуноглобулиновые фракции или моноклональные антитела и инкубируются в бактериальных суспензиях.

При использовании этого способа на 7 часов, по сравнению с традиионным, сократилось время проведения анализа. Повысилась чувствительность и специфичность индикации. Например, при исследовании испражнений на наличие Bacterioides forsythus иммунофлуоресцентным методом положительная реакция отмечалась в 62% случаев, а при использовании сочетанного применения магноиммуносорбции, ПЦР 4 и гибридизацией ДНК-зондами в 82%.

Однако использование этого метода при индикации возбудителя сибирской язвы не обеспечивает достаточной надежности и чувствительности при выявлении его в объектах внешней среды, что обусловлено наличием спор и сопутствующих спорообразующих микроорганизмов.

Наиболее близким к заявляемому является способ индикации Bacillus anthraсis с использованием полимеразной цепной реакции (Диагностика возбудителей опасных инфекционных болезней. Т.1, Саратов, 1998, с.77-79). Согласно этому способу исследуемый материал, сконцентрированный путем фильтрации в объеме 0,1-1,0 мл засевается в 5 мл бульона Хоттингера рН 7,2-7,3 и подращивается при 37 o С в течение 3 ч. Затем в бульон вносится пенициллин до конечной концентрации 1000 ед/мл и инкубируется еще 1 ч. После этого 0,5-1,0 мл содержимого переносится в пробирку типа "Eppendorf" и центрифугируется 20 мин при 6-8 тыс. об/мин. Надосадочная жидкость отбирается для проведения ПЦР.

После амплификации по программе, соответствующей праймерам продукт в объеме 10 мкл, наносится в гнезда 1,5% агарозного геля и подвергается электрофорезу при напряжени 60-100 V в течение 15-45 мин. Параллельно с исследуемыми образцами ставятся контроли: положительный с ДНК Bacillus anthracis и отрицательный со стерильной деионизированной водой. После окрашивания геля бромистым этидием (0,5 мкг/мл) в течение 30 мин просматривают гель в ультрафиолетовых лучах. Положительным результатом является наличие полос ДНК с такой же электрофоретической подвижностью, как в положительном контроле и отсутствие таковых в отрицательном.

Недостатком способа-прототипа является недостаточная надежность индикации микроорганизмов из объектов внешней среды при их низкой концентрации (до 10 м.к./мл), наличии спор сапрофитов и другой сопутствующей микрофлоры.

Техническим результатом заявляемого способа является повышение надежности индикации возбудителя сибирской язвы в объектах внешней среды при его низкой концентрации за счет повышения чувствительности способа и его ускорения.

Технический результат достигается тем, что способ включает подготовку исследуемого материала, концентрирование его селективной сорбцией на магноиммуносорбентах путем встряхивания суспензии исследуемого материала и магноиммуносорбентов с концентрацией 5-6 мкл/мл в течение 15-20 мин, культивирование в селективной среде в присутствии ингибиторов роста сопутствующей микрофлоры, в качестве которых используется смесь полимиксина и триметаприма в равных количествах с концентрацией смеси 23-25 мкг/мл, кипячение пробы в течение 1 ч, отделение супернатанта и последущее исследование в ПЦР.

По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки.

Сорбция исследуемого материала на магноиммуносорбентах при встряхивании в течение 15-20 мин с концентрацией магноиммуносорбентов 5-6 мкл/мл, что обеспечивает достаточно полный селективный отбор микроорганизмов из исследуемого материала при его низких концентрациях за счет образования комплекса антиген-антитело.

Культивирование пробы в селективной среде в течение 1,5-2,0 ч, содержащей в качесве ингибиторов роста сопутствующей микрофлоры смесь полимиксина и триметаприма в концентрации 23-25 мкл/мл, позволяет получать культуру Bacillus anthracis в вегетативной форме, которая в отличие от споровой легко лизируется и обеспечивает выход ДНК сибиреязвенного микроба при минимальном присутствии ДНК сопутствующих микроорганизмов, что в конечном счете дополнительно повышает чувствительность и специфичность индикации возбудителя сибирской язвы.

Возможность практического использования заявляемого способа подтверждается примерами его конкретного выполнения.

Пример 1. Исследуемый материал, концентрированный путем фильтрации в объеме 0,1-1,0 мл. Засевали в 5 мл бульона Хотгингера, рН 7,2-7,4, и подращивали в термостате при 37 o С в течение 3 ч. Затем в бульон добавляли пенициллин до конечной концентрации 1000 ед/мл и продолжали инкубировать еще 1 ч, после чего 0,5-1,0 содержимого переносили в пробирки типа "Eppendorf" и центрифугировали 20 мин при 6-8 тыс. об/мин. Для постановки ПЦР использовали надосадочную жидкость.

Возможны следующие варианты постановки ПЦР:
а) для выявления фрагмента 256 п.н. гена cap В с праймерами C1 C2 и фрагмента 407 п.н. гена pag с с праймерами Р1 и Р2.

Реакционная смесь содержала по 12 пМ праймеров, 8 мМ смеси dNTP, 1,5 мМ MgCl 2 , 1 ед. Taq-полимеразы и 5-10 мкл исследуемого материала. Программа амплификации: 30 циклов 92 o С - 1 мин, 46 o С - 1 мин, 70 o С - 1 мин (И.И. Тучков, А.Н. Куличенко, И.Г. Дроздов, 1994).

б) для выявления фрагмента хромосомы 152 п.н. с праймерами R1 и R2. Реакционная смесь содержала 0,5 мкМ праймеров, 200 мкМ смеси dNTP, 1,5 мМ MgCl 2 , 1 ед. Taq-полимеразы и 5-10 мкл исследуемого мериала. Программа амплификации: предварительная денатурация при 94 o С - 1 мин, затем 40 циклов 94 o С - 1 мин, 60 o С - 1 мин, 72 o С - 1 мин (Patra e.a., 1995). Амплификация проводилась в термоциклере "Amply 250". Параллельно с образцами ставились контроли: положительый с ДНК Bacillus anthracis и отрицательный со стерильной деионизированной водой в количестве 5 мкл.

По завершении амплификации продукты в объеме 10 мкл наносилсь в гнезда 1,5% агарозного геля и подвергались электрофорезу при 60-120 V в течение 15-45 мин. После окрашиваня геля бромистым этидием (0,5 мкг/мл) в течение 30 мин просматривали гель в УФ лучах.

Чувствительность метода составила 2000 спор в 1 мл суспензии почвы.

Пример 2. Вытяжку из почвы контаминировали спорами Bacillus anthracis с содержанием 10, 50, 100, 250, 500, 1000 и 2000 м.к./мл, добавляли 5 мкл/мл 10% суспензии сибиреязвенных магноиммуносорбентов и выдерживали 20 мин при комнатной температуре при периодическом встряхивании. Затем магноиммуносорбенты отмывали, переносили в пробирку типа "Eppendorf" с 1 мл бульона Хоттингера и инкубировали при 37 o С в течение 2 ч.

Пробы после подращивания лизировали кипячением в течение 1 ч, центрифугировали и исследовали в ПЦР с праймерами R1 и R2 к хромосомальной последовательности Ва 813 и праймерами P1, P2, C1, C2 к последовательностям к плазмидным генам pag и cap. Амплификацию проводили в термоциклере "Perkin Elmer 2400". Параллельно ставили положительный контроль с ДНК Bacillus anthracis и отрицательный со стерильной деионизированной водой.

Для праймеров к плазмидной последовательности (Р1, P2, C1, C2) реакционная смесь содержала: Н 2 O до конечного объема 25 мкл, 2,5 мкл x 10 реакционного буфера, 1,5 мМ MgCl 2 , 0,4 мкл BSA, 8 мМ смеси dNTP, 1 мкл праймеров, 5 мкл исследуемой ДНК и 1 ед. Taq-полимеразы. Программа амплификации: 30 циклов, 92 o С - 30 с, 46 o С - 30 с, 72 o С - 30 с.

Для выявления хромосомальной последовательности Ва 813 с праймерами R1 и R2 реакционная смесь содержала: Н 2 О до конечного объема 25 мкл, 2,5 мкл. х10 реакционного буфера, 1,5 мкл. MgCl 2 , 1 мкл. BSA, 200 мкМ смеси dNTP, по 0,5 мМ праймеров, 5,0 мкл исследуемой ДНК и 1 ед. Taq-полимеразы. Программа амплификации: предварительная амплификация 94 o С 5 мин, затем 40 циклов; 94 o С - 30 с, 60 o С - 30 с, 72 o С - 30 с.

После проведения амплификации продукты в объеме 10 мкл наносились в гнезда 1,5% агарозного геля и подвергались электрофорезу при напряжении 90-100 V в течение 20-45 мин. Предварительно окрашенный бромистым этидием гель просматривался в ультрафиолетовых лучах.

Чувствительность данного метода составила 500 спор в 1 мл суспензии почвы при одновременном определении детерминант вирулентности.

В работе использовали магноиммуносорбенты, приготовленные на основе аллюмосиликата и адсорбированного на нем сибиреязвенного иммуноглобулина (Пат. РФ. 2138813, G-01, 33/543 от 27.09.99. Бюл. 27).

Пример 3. Проводится аналогично примеру 2, за исключением того, что подращивание исследуемого материала, адсорбированного предварительно на магноиммуносорбенты, проводилось на селективную среду, состоящую из бульона Хоттингера, к которому в качестве ингибиторов роста сопутствующей микрофлоры была добавлена смесь полимиксина и триметаприма.

При учитывании результатов ПЦР чувствительность метода составила 50 спор в 1 мл суспензии почвы.

Как показали экспериментальные исследования, заявленные режимы концентрирования и инкубирования исследуемой культуры выбраны оптимально. Уменьшение концентрации магноиммуносорбентов менее 5 мкл/мл и времени перемешивания менее 15 мин снижает чувствительность способа, увеличение же этих параметров нецелесообразно. Уменьшение времени культивирования менее 1,5 ч и концентрации смеси ингибиторов роста сопутствующей микрофлоры ниже 23 мкг/мл приводит к понижению чувствительности ПЦР при низкой концентрации возбудителя сибиреязвенной инфекции в объектах внешней среды. Увеличение указанных параметров нецелесообразно.

Читайте также: