Инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота диссертация
Обновлено: 26.04.2024
Введение к работе
1.1. Актуальность темы исследований. ИРТ КРС причиняет значительный ущерб промышленному животноводству, вызывая поражение органов дыхания, пищеварения и размножения. Особенно тяжело болезнь протекает в крупных животноводческих хозяйствах, где большое количество животных разного возраста содержится на ограниченных площадях, что, в значительной степени, способствует быстрому распространению вирусных инфекций, поражающих дыхательные пути, желудочно-кишечный тракт и репродуктивные органы. Вирус, повреждая чувствительные клетки дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта и репродуктивных органов способствует размножению различных микроорганизмов -эшерихий, пастерелл, сальмонелл, протея на пораженных клетках (Плещакова В.И., 2012; Пчельников А.В., 2017; Прасолова О.В., 2017 и др.).
Актуальность проблемы ИРТ КРС состоит в следующем:
широкое распространение болезни среди крупного рогатого скота всех возрастов;
недополучение приплода молодняка крупного рогатого скота из-за по-вышения уровня абортов и мертворождений (до 30%);
рождение нежизнеспособных телят (до 10%);
снижение удоя коров во время болезни (до 60%);
гибели телят от пневмоэнтеритов (до 60%);
недополучение привесов живой массы у телят (до 70%);
увеличение числа коров с многократным непроизводительным осеменением (до 30%);
увеличение затрат на профилактику и лечение больных животных (Мищенко В.А., 2012; Пчельников А.В., 2017).
В связи с особенностями патогенеза и течения ИРТ КРС, выражающихся в скрытом течении заболевания, персистенции вируса в организме и выделении вируса во внешнюю среду, существует необходимость в своевременном выявлении таких животных для исключения их как источника инфекции в эпизоотической цепи.
В настоящее время важное значение приобретает разработка молекулярно-генетических методов, основанных на выявлении генома вируса в биологическом материале, а также совершенствование серологических тестов для выявления противовирусных антител. К таким методам относятся полимеразная цепная реакция (ПЦР), способная выявлять возбудителя на любой стадии заболевания, включая латентную, а также иммуноферментный анализ (ИФА) и реакция непрямой гемагглютинации (РНГА), позволяющие значительно сократить время на постановку диагноза.
В комплексе лечебно-профилактических мероприятий при ИРТ КРС важную роль играет специфическая профилактика. Разработка новых подходов к
конструированию вакцин, особенно инактивированных, имеет большое значение. При современном ведении животноводства, связанном с концентрацией поголовья, важным моментом является облегчение процесса иммунизации. Такой метод, как внутрикожная иммунизация, является одним из самых перспективных современных методов. При иммунизации животных, осуществляемой на фоне недостатков и несбалансированности кормления, нарушении микробиоценоза, при которых зачастую отмечается угнетение иммунной системы, специфическая профилактика не всегда достигает нужного эффекта. При этом для снятия иммунодепрессивного эффекта стимуляция поствакцинального иммунитета с помощью различных препаратов, особенно пробиотиков, оправдана.
Важным подходом к терапии вирусных инфекций на современном этапе является использование физических методов (поляризованного полихроматического и лазерного излучения), энергетических средств и рекомбинантных штаммов бактерий, содержащих геном вирусов [Л. Е. Козловская, 1999; П. А. Красочко, 2009; К. Н. Мукантаев, 2016; К. К. Муканов, 2015; J. E. Farley, 1979 и др.)
В связи с вышеизложенным, изучение современной эпизоотической ситуации по ИРТ КРС, разработка новых средств и способов иммунологической диагностики, профилактики и терапии вышеуказанной болезни является актуальной задачей ветеринарной науки и практики.
1.2. Степень разработанности темы. Работы по изучению ИРТ КРС в
различных аспектах (биология возбудителя, диагностика, профилактика,
эпизоотология) проводились в нашей стране и за рубежом в различные годы.
Разработкой молекулярно-генетических методов диагностики ИРТ КРС занимались Морозов И.А. (1989), Глотов А.Г. (1991), Котенева С.В. (2006), S. Vilcek (1993), F.S. Kibenge (1994), M.A. Rocha (1999), A. Candido (2000), M. Alegre (2001) и другие. В своих работах они использовали праймеры к генам гликопротеинов В, С и тимидинкиназы, а чувствительность метода повышали, используя гнездовой вариант ПЦР и блот-гибридизацию.
Серологические методы диагностики ИРТ КРС на основе ИФА и РНГА разрабатывали и совершенствовали Васильев А.В. (1980), Непоклонова И.В. (1984), Стеценко В.И. (2003), Кузнецов Д.П. (2001), Ахметсафин Р.Г. (2005), V.E. Vengris (1971), H.J. Cho (2002), L. Bertonni (2005) и другие.
Проблему специфической профилактики ИРТ КРС решали с помощью своих разработок Лобастов А.Е. (1983), Музычин С. И. (1988),Стеценко В. И. (1990), Сюрин В.Н. с соавт. (1982, 1981); Крюков Н.Н., Вечеркин А.С. (1983); Белявская Т.В. (1998), Красочко П.А. (2009), Хитрова А.Е. (2003) и другие. При этом разрабатывались живые или инактивированные эмульгированные вакцины. Однако, разработка сухих инактивированных вакцин против ИРТ КРС для внутрикожной иммунизации не достаточно широко проработана.
Изучению морфологии вируса ИРТ КРС посвящены работы Надточей Г.А., Сюрин (1977), Brees S.S. (1971), Rockborn G. (1990), Hoferer M. (2017) и других. Примененный ими метод электронной микроскопии позволял получать четкие изображения вируса, позволяющие судить о структурной организации вирионов. Аналогичный по разрешающей способности, но отличный по способу формирования изображения вируса, метод атомно-силовой микроскопии для изучения вируса ИРТ КРС не применялся.
Рекомбинантные технологии в профилактике ИРТ КРС применялись для получения маркерных вакцин Bosch J. C. (1996), Flores E. F. (1998), Brownlie R. (2015) и другими, которые успешно внедрены и имеют коммерческий успех, а также для получения рекомбинантных белков и ДНК-вакцин для иммунизации животных S. Van Drunen Littel-vanden Hurk (1993), Caselli E. (2005), Langellotti C. A. (2011), Blanc A. M. (2012), Mackenzie-Dyck S. (2014). Однако последние технологии апробированы только на лабораторных животных.
Предложения по стимуляции иммунного ответа на введение вакцин против вирусных инфекций, в том числе и ИРТ КРС с помощью иммуномодуляторов были выдвинуты П.А.Красочко (1997), с помощью пробиотических средств Неминущей Л.В. (2011), продуктами пчеловодства С.М.Усовым (1998), но использование физических факторов, таких как поляризованный полихроматический свет или лазерное излучение не достаточно изучено.
Таким образом, возникла необходимость применения новых методов изучения вируса ИРТ КРС, разработки средств диагностики, профилактики и терапии данной болезни и повышении эффективности лечебно-профилактических мероприятий новыми способами и препаратами.
1.3. Цель и задачи исследований. Целью настоящих исследований явилась разработка и совершенствование молекулярно-генетических, физических и биотехнологических средств и методов диагностики, специфической профилактики и терапии ИРТ КРС.
Для выполнения указанной цели были поставлены следующие задачи:
Провести серологический мониторинг распространения ИРТ КРС в хозяйствах Республики Беларусь, изучить клиническое проявление, состояние иммунитета и обменных процессов при различных формах течения инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.
Провести исследования по изучению дрейфа возбудителей вирусных и бактериальных болезней при формировании экологических ниш ассоциациями ИРТ со сходными по клиническим проявлениям возбудителями инфекционных болезней телят.
Применить новые подходы к изучению морфологии вируса и дать генетическую оценку штаммов вирусов, входящих в биопрепараты для профилактики ИРТ на территории Республики Беларусь.
Разработать средства и способы специфической профилактики ИРТ КРС с использованием инактивированных вакцин и активизации поствакцинального иммунитета с использованием пробиотических препаратов.
Теоретически обосновать и применить способ иммунотерапии ИРТ КРС с использованием штамма Bacillus licheniformis КМИЭВ-В202, имеющего участки генома вируса ИРТ.
Отработать новые подходы неспецифической профилактики и терапии животных, больных ИРТ КРС с использованием физических способов, пробиотических и энергетических средств.
Разработать комплекс мероприятий по применению молекулярно-генетических, иммунологических и физических средств и методов для диагностики, профилактики и терапии респираторных, желудочно-кишечных и гинекологических болезней крупного рогатого скота, в этиологии которых ведущую роль играет вирус ИРТ КРС.
1.4. Научная новизна. Для контроля эффективности иммунизации, проведения диагностических и мониторинговых исследований при ИРТ КРС разработаны:
- тест-система для определения генома вируса методом ПЦР-РВ путем
использования участков высококонсервативных областей генома вируса,
кодирующих синтез гликопротеинов В. Определены оптимальные концентрации
праймеров (к гликопротеиду В в концентрации 5 пмоль/мкл), Taq-полимеразы,
дезоксинуклеозидтрифосфатов (3 и 2 пмоль/мкл), буферных растворов,
флуоресцентно-меченых олигонуклеотидных зондов (для Taqman-зонда 3 пмоль/мкл, для МВ-зонда 10 пмоль/мкл), что позволило повысить специфичность диагностики до 100%, определять концентрацию вируса в вирусосодержащей жидкости за 14-15 часов по сравнению с классическим методом на культуре клеток;
-набор эритроцитарного диагностикума для выявления антител к вирусу ИРТ КРС в РНГА путем использования стабилизированных глутаровым альдегидом эритроцитов барана, сенсибилизацию которых проводили вирусом с использованием трипанового синего и хлорида хрома, что позволило существенно повысить специфичность, активность и стабильность диагностикума.
Разработанными тест-системами проведен серологический мониторинг по инфекционному ринотрахеиту крупного рогатого скота сывороток крови от невакцинированных коров и телят, который показал наличие антител в среднем у 70,1% обследованных коров и 49,9% у телят.
Разработаны вакцина сухая инактивированная против ИРТ КРС для внутрикожной иммунизации телят с профилактической эффективностью 92,3-93,3%, а также вакцина эмульгированная инактивированная для внутримышечной иммунизации коров и телят с профилактической эффективностью 91,4-96,4%.
Выявлены закономерности формирования иммунного ответа у крупного рогатого скота после иммунизации против инфекционного ринотрахеита на различном фоновом уровне антител - низком или высоком показавшие, что иммунизацию животных в хозяйствах, в которых не проводилась плановая вакцинация, необходимо осуществлять путем двукратного введения биопрепарата, а в хозяйствах, систематически проводящих плановую иммунизацию как живыми, так и инактивированными вакцинами - однократное введение биопрепаратов.
Использование суспензии, инактивированной 0,2% теотропином, Bacillus licheniformis КМИЭВ-В202 внутримышечно двукратно с интервалом в 3 дня позволило получить 100% терапевтический эффект и повышение антителообразования при заболевании телят инфекционным ринотрахеитом, проявившимся поражением органов дыхания.
Научная новизна подтверждена патентами Российской Федерации и Республики Беларусь:
патент Российской Федерации № 2538116 «Биологически активный
1.5. Теоретическая и практическая значимость работы. Особенности современных подходов к изучению патогенеза и эпизоотического процесса при ИРТ КРС с использованием диагностических тест-систем, разработка новых средств и способов специфической и неспецифической его терапии и профилактики дополняют и расширяют имеющиеся теоретические и практические данные при борьбе с ИРТ КРС.
Установлен дрейф возбудителей вирусных и бактериальных инфекций в экологических нишах, который возможно регулировать с помощью вакцинации, особенно при бактериальных инфекциях, что ведет к элиминации возбудителей из организма и замена их на другие, более патогенные, а иммунизация против вирусных инфекций не приводит к элиминации возбудителя из стада, но способствует снижению инфицированности, заболеваемости и отхода животных.
Выявлен геном вируса ИРТ КРС в бациллах (Bacillus licheniformis КМИЭВ -В202), подтвержденный с помощью ПЦР-РВ с праймерами, гомологичными консервативным участкам генов гликопротеина D и гликопротеина В и секвенирования - сходство генома вируса ИРТ (штамм КМИЭВ-V123) и фрагмента, выделенного из бацилл.
На основе проведенных исследований разработаны:
методические рекомендации по использованию полихроматического поляризованного света для профилактики и терапии пневмоэнтеритов телят;
методические указания по диагностике ИРТ КРС методом полимеразной цепной реакции;
методические указания по использованию полихроматического поляризованного света для лечения и профилактики заболеваний животных;
методические рекомендации по специфической профилактике и мерам борьбы с респираторными инфекциями телят;
технические условия (ТУ BY 300002681.029-2015) и инструкция по применению вакцины инактивированной эмульгированной против ИРТ КРС;
технические условия (ТУ BY 600049853.157-2017) на набор жидких цветных эритроцитарных антигенов и сывороток для диагностики ИРТ КРС;
методические указания по применению набора жидких цветных эритроцитарных диагностикумов с антигеном вируса ИРТ КРС для постановки реакции непрямой гемагглютинации и торможения непрямой гемагглютинации;
методические рекомендации по изучению культуральных, антигенных, генетических свойств и инфекционной активности производственных и эпизоотических штаммов вируса ИРТ КРС;
определение микробиоценоза кишечного тракта животных в норме и при дисбактериозах : рекомендации.
1.6. Методология и методы исследования. Методология проведенных
исследований включает стандартные процедуры с использованием различных
материалов и естественно восприимчивых животных. В работе использовали
молекулярно-генетические, вирусологические, серологические, клинические,
эпизоотологические, физические и иммунологические методы исследований со
статистической обработкой данных.
1.7. Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
разработка и совершенствование диагностических тест-систем для выявления генома и антител к вирусу ИРТ КРС;
мониторинговые исследования, клиническое проявление, состояние иммунитета и обменных процессов при различных формах течения инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в Республике Беларусь;
дрейф возбудителей вирусных и бактериальных болезней при формировании экологических ниш ассоциациями ИРТ со сходными по клиническому проявлению возбудителями инфекционных болезней телят;
новые подходы к изучению морфологии и генетической структуры штаммов вирусов ИРТ, входящих в биопрепараты для его профилактики на территории Евразийского экономического союза;
технологии изготовления вакцин нового поколения для профилактики ИРТ КРС;
способ активизации поствакцинального иммунитета с использованием пробиотических препаратов;
способ иммунотерапии ИРТ КРС с использованием штамма Bacillus licheniformis КМИЭВ-В202, имеющего участки генома вируса ИРТ;
новые подходы неспецифической профилактики и терапии животных, больных ИРТ КРС с использованием физических, пробиотических и энергетических способов и средств;
комплекс мероприятий по применению молекулярно-генетических, иммунологических и физических средств и методов для диагностики, профилактики и терапии респираторных, желудочно-кишечных и гинекологических болезней крупного рогатого скота, в этиологии которых ведущую роль играет вирус ИРТ.
патологии и биотехнологии в агропромышленном комплексе (Минск, 2017); Научные достижения Республики Беларусь (Минск, 2017); Знания молодых для развития ветеринарной медицины и АПК страны (СПб. : ФГБОУ ВО СПбГАВМ, 2017); Наука, образование, культура (Комрат, 2018).
Разработки новых вакцин, пробиотиков, терапевтических энергетических
средств, способов выращивания телят на Международной специализированной выставке Infoinvent-2013 (Кишинэу, Молдова, 2013), Международной выставке изобретений и инноваций (г. Тимишоара, Румыния, 2015 г.), Международной выставке изобретений (г. Клуи-Напока, Румыния 2015 г.), Международной выставке изобретений и инноваций г. Тимишоара, Румыния, 2018 г.) удостоены 6 Золотых медалей.
1.10. Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 76
научных работ, 13 из них в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства
образования и науки РФ для докторских и кандидатских диссертаций, 17 – в других
изданиях, 7 патентов, 5 монографий, 3 учебных пособий, 31 – в материалах
конференций, 7 методических рекомендаций и указаний.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 414 страницах, содержит разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, приложения. Диссертация содержит 74 таблиц и 42 рисунка. Список использованной литературы включает 403 источника. В приложениях представлены копии документов, подтверждающих достоверность и практическую значимость.
Глотова Татьяна Ивановна. Инфекционный ринотрахеит и вирусная диарея крупного рогатого скота : 16.00.03, 16.00.04 Глотова, Татьяна Ивановна Инфекционный ринотрахеит и вирусная диарея крупного рогатого скота (диагностика, молекулярно-биологические свойства возбудителей, эффективность противовирусных препар: дис. . д-ра биол. наук : 16.00.03, 16.00.04 Новосибирск, 2006 364 с. РГБ ОД, 71:06-3/285
Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 6
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 17
1. Характеристика инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота
2. Латентная форма инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, ее влияние на диагностику, специфическую профилактику заболевания и эпизоотологическое значение
3. Структура и функционирование генома вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота
4. Методы молекулярной биологии и их использование в диагностике и молекулярной эпизоотологии инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота
4.1. Рестрикционное картирование 26
4.2. Исследования по молекулярной эпизоотологии инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.
4.3. Конструирование молекулярных зондов для выявления нуклеотидных последовательностей вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота и их применение для диагностики болезни
4.4. Разработка и применение полимеразной цепной реакции для диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого
4.5. Методы оценки полиморфизма ДНК 37
5. Иммунный ответ на инфекцию вирусом инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота
6. Экспериментальные инфекции, вызванные вирусом инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота
7. Характеристика вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота
8. Особенности клинического проявления вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота
9. Особенности патогенеза вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота
10. Серологическая диагностика вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота
11. Экспериментальные инфекции, вызванные вирусом вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота
12. Иммунология вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота
12.1. Иммуносупрессивное действие нецитопатогенных и цитопатогенных биотипов вируса вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота
12.2. Подавление врожденного иммунитета с последующим установлением персистентной инфекции
13. Роль вирусов инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи-болезни слизистых в развитии респираторных болезней молодняка крупного рогатого скота
13.1. Влияние вирусов на клетки эпителия респираторных путей
13.2. Влияние вирусов на иммунные механизмы 67
14. Применение противовирусных препаратов при инфекционном ринотрахеите и вирусной диарее болезни слизистых крупного рогатого скота
15. Заключение по обзору литературы 80
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 84
1. Материалы и методы 84
2. Результаты исследований 100
2.1. Усовершенствование методики постановки реакции нейтрализации для серологической диагностики вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота
2.2. Распространение инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота в хозяйствах Сибири
2.3. Спектр возбудителей инфекционных заболеваний, выделенных от больных телят, в неблагополучных по инфекционному ринотрахеиту крупного рогатого скота хозяйствах
2.4. Выделение и характеризация изолятов вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота от животных в Сибири
2.5. Выделение и характеризация изолятов вируса вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота от животных в Сибири
2.6. Разработка диагностической ПЦР для выявления вируса ИРТКРС
2.7. Сравнительная эффективность полимеразной цепной реакции, молекулярной гибридизации и метода выделения вируса в культуре клеток в диагностике ИРТКРС
2.8. Типирование Российских штаммов и изолятов вируса ИРТ КРС при помощи ГЩР-ПДРФ-анализа
2.9. Сравнительное изучение патогенности штаммов и изолятов вируса ИРТ КРС на естественно восприимчивых животных
2.10. Патогенность изолятов вируса вирусной диареи- болезни слизистых крупного рогатого скота для естественно восприимчивых животных в зависимости от их интерферон индуцирующей активности
2.11. Смешанная экспериментальная инфекция телят, вызванная вирусами инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота
2.12. Противовирусная активность препаратов различных классов в опытах in vitro в отношении вирусов инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота
2.13. Лечебно-профилактическая эффективность препарата 1-фенил-2,3-диметил-4-йодпиразолон в опытах на животных с использованием экспериментального заражения вирусами инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота
ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 223
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 256
Введение к работе
Актуальность проблемы. Среди многообразия вирусных агентов, вызывающих патологию у крупного рогатого скота (КРС), вирусы инфекционного ринотрахеита (ИРТ) и вирусной диареи-болезни слизистых (ВД-БС) занимают особое место в связи с многообразием клинических проявлений и тяжестью течения болезней, вызываемых ими (Н.Н. Крюков и соавт. 1984; К.П. Юров и соавт., 2003; W.D.G. Yates, 1984; D. Deregt et al, 1995; A.L.E. Lindberg, 2003).
Многие исследователи отводят первичную этиологическую роль в возникновении массовых респираторных болезней молодняка КРС этим вирусам, т.к. инфицированные ими животные становятся восприимчивыми к развитию секундарной микрофлоры и осложнению инфекционного процесса (Н.Н. Крюков и соавт, 1984; Е.В. Андреев, 1984; W.D.G. Yates, 1984; L.A. Babiuk et al, 1991; RW. Fulton et al, 2004). Роль вирусов заключается в разрушении клеток эпителия респираторных путей (V.Fainstein et al, 1980), понижении активности бактериостатических механизмов в легких, воздействии на макрофаги и полиморфно-ядерные нейтрофилы, лейкоциты и Т4+-лимфоциты и изменении их функций (G. J. Jakab, 1983; Н. B.Ohmann et al, 1985; L.A. Babiuk et al, 1988; M. T. Winkler, 1999).
ИРТ и ВД-БС КРС регистрируются во многих регионах РФ и странах СНГ и причиняют значительный экономический ущерб мясному и молочному скотоводству (П.А. Красочко, 1991; О.Г. Петрова и соавт, 1999; А.Г. Высокопоясный и соавт, 2000; Н.И. Закутский, 2000; В.А. Мищенко и соавт, 2001; Н.Ю. Басова, 2002; К.П. Юров и соавт, 2003).
Латентная и персистентная формы у этих болезней осложняют проведение профилактических мероприятий, т.к. приводят к неконтролируемому распространению возбудителя во внешней среде, где немаловажную роль играют животные-вирусоносители (Е.А. Андреев, 1984; А.Г. Глотов, 1999; G. Van Shchaik, 1998). Учитывая длительную персистенцию возбудителя на уровне популяции крупного рогатого скота, определение вирулентности изолятов вирусов вызывает большой научно-практический интерес исследователей всего мира (М. Ackennann, 2001).
В настоящее время необходима разработка и внедрение простых, высокочувствительных и специфичных методов, выявляющих возбудителя на любой стадии заболевания, основанных на определении в биоматериале нуклеиновых кислот (молекулярная гибридизация и полимеразная цепная реакция).
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) становится одним из важных диагностических тестов в ветеринарной вирусологии (S.Belak. et al.,1993). Метод имеет явные преимущества в скорости и чувствительности по сравнению с традиционными вирусологическими методиками, а при высокой специфичности его значение для ветеринарной практики возрастает.
В качестве мишеней амплификации выбирались гены гликопротеинов (М. Fuchs et al., 1999; С. Ros et al, 1999), тимидинкиназы (S. Moore et al., 2000), использовалась или стратегия гнездовой ПЦР, или ПЦР в комбинации с блот-гибридизацией (F.S. Kibenge et al., 1993; R.S.Kataria, 1997).
С введением в практику ветеринарной вирусологии метода рестрикционного анализа появилась возможность дифференцировать вирус ИРТ КРС (BHV-1) на подтипы (1.1, 1.2 а/в и 1.3), различающиеся по вирулентности (М. Engels et. al., 1981; A. Metzler, et. al., 1985). Впоследствии штаммы BHV-1.3, были реклассифицированы в отдельный тип BHV-5 (В. Roizman et al., 1995). Метод имеет ограниченное диагностическое значение, но успешно используется при эпизоотологических исследованиях. К сожалению, он обладает некоторыми недостатками, главным из которых является необходимость наработки большого количества вирусной ДНК.
Существование геномных вариантов вируса необходимо учитывать при разработке диагностических ПЦР-тест-систем (C.Ros, S.Belak, 1999). Для дифференциации между вариантами различных вирусов широко используются методы оценки полиморфизма ДНК, в частности, ПЦР-ПДРФ анализ (С. Херрингтон и соавт, 1999).
Актуальным в настоящее время представляется изучение возможности использования противовирусных препаратов различных классов для профилактики и лечения больных животных (М.М. Зубаиров, 1998).
Противовирусные препараты с успехом используются при лечении герпесвирусных инфекций человека (И.Ф. Баринский и соавт., 1986, Е. De Clerq, 2001). Данных о применении их для профилактики и терапии ИРТ и, особенно, ВД-БС у крупного рогатого скота недостаточно.
Возбудитель ВД-БС КРС представлен 2 биотипами, цитопатогенным и нецитопатогенным (A.L.E. Lindberg, 2003). Клинические проявления болезни у КРС зависят от биотипа вируса и определяются наличием интерферона (ИФН) 1 типа и его активности. Формирование персистентной формы болезни у плода происходит в период его внутриутробного развития до 150 дней нецитопатогенным вариантом вируса за счет ингибирования синтеза этого белка (М. Schweizer et al., 1999; N. Grandvaux et al., 2002). Цитопатогенные штаммы вируса, напротив, индуцируют выработку интерферона в организме животных в высоких титрах, что, по мнению C.R. Rinaldo et al. (1976) и SJ.Skidmore (1987), является косвенным свидетельством их патогенности.
Цель и задачи исследований. Цель работы: разработка способов диагностики, изучение молекулярно-биологических свойств возбудителей и научное обоснование применения противовирусных препаратов при инфекционном ринотрахеите и вирусной диарее крупного рогатого скота. Для достижения указанной цели были поставлены задачи: 1 .Усовершенствовать методику постановки реакции нейтрализации в культуре клеток микрометодом для ретроспективной серологической диагностики ВД-БС КРС. Изучить распространение ИРТ и ВД-БС КРС в Сибири, установить роль вирусов в этиологии массовых респираторных болезней молодняка КРС и выявить ассоциации вирусов, возникающие при вспышках массовых респираторных болезней;
2. Разработать ПЦР для выявления вируса ИРТ КРС и изучить ее сравнительную диагностическую эффективность, а также способ типирования и дифференциации штаммов и изолятов вируса при помощи ПЦР-ПДРФ-анализа;
3. Изучить некоторые молекулярно-биологические свойства штаммов и изолятов вирусов, выделенных от больных и инфицированных животных. В условиях контролируемых экспериментов определить их сравнительную патогенность для естественно восприимчивых животных в зависимости от генотипа и интерфероногенной активности, а также воспроизвести острую смешанную бронхопневмонию вирусной этиологии и изучить ее клинические проявления;
4. Изучить противовирусную активность препаратов различных классов, а также экзогенного интерферона в отношении вирусов ИРТ и ВД-БС КРС в опытах in vitro, а наиболее эффективных из них в экспериментах in vivo.
1. Усовершенствована методика постановки реакции нейтрализации в культуре клеток микрометодом для ретроспективной серологической диагностики ВД-БС КРС. Установлено широкое распространение ИРТ и ВД-БС КРС в Сибири и подтверждена ведущая роль вирусов в возникновении массовых респираторных болезней телят вирусной этиологии в крупных хозяйствах племенного и молочного направления. Установлена взаимосвязь между концентрацией поголовья, серопозитивностью и частотой выделения вирусов от больных животных. Изучены ассоциации вирусов, возникающие при массовых вспышках респираторных болезней молодняка крупного рогатого скота.
2. Разработана ПЦР для выявления вируса ИРТ КРС и изучена ее сравнительная диагностическая эффективность, а также способ типирования и дифференциации вируса при помощи ПЦР-ПДРФ-анализа. Проведено типирование штаммов и изолятов вируса, разработан способ дифференциации аттенуированного вакцинного штамма ТК-А от полевых штаммов и изолятов вируса.
3. Изучены некоторые молекулярно-биологические свойства изолятов вирусов ИРТ и ВД-БС КРС, выделенных от больных и инфицированных животных. В условиях контролируемых экспериментов показана взаимосвязь генотипа вируса ИРТ КРС и интерфероногенной активности вируса ВД-БС КРС с их патогенностью для естественно восприимчивых животных, а также воспроизведена острая смешанная вирусная болезнь и показано усиление патогенных свойств вируса ИРТ КРС на фоне размножения вируса ВД-БС КРС.
4. Установлена противовирусная активность препаратов различных классов в отношении вирусов ИРТ и ВД-БС КРС в опытах in vitro. Показана профилактическая эффективность 1-фенил-2,3-диметил-4 йодпиразолона в контролируемых опытах на экспериментально зараженных телятах 4-6-месячного возраста.
Теоретическая и практическая значимость работы. Материалы диссертации использованы при составлении:
Результаты исследований представляют теоретическую и практическую ценность, создают перспективы использования ПНР не только в диагностике ИРТ КРС, но и в молекулярной эпизоотологии болезни и могут быть использованы для оптимизации противоэпизоотических мероприятий с целью дифференциации аттенуированного вакцинного штамма от полевых штаммов и изолятов вируса. Полученные данные также дают возможность расширить научные знания относительно роли вирусов в возникновении массовых респираторных болезней телят и могут быть использованы при дальнейшем изучении иммунологии и патогенеза инфекций, вызванных герпес- и пестивирусами. Результаты исследований открывают перспективы применения противовирусных препаратов для профилактики вирусных инфекций и могут быть использованы в практике при разработке оздоровительно-профилактических мероприятий.
Основные положения, выводы и практические предложения, изложенные в диссертации, обсуждены и одобрены Подсекцией инфекционной патологии при ИЭВСиДВ (прот. № 5, 20.10.2005) и Ученым Советом ГНУ ИЭВСиДВ (прот. № 9, 20.10.2005).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 320 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, приложения. Работа иллюстрирована 35 рисунками и 20 таблицами. Список литературы включает 515 источников, в том числе 364 зарубежных.
Основные положения, выносимые на защиту:
- Модифицированный метод серологической диагностики ВД-БС КРС, распространение и особенности эпизоотической ситуации при ИРТ и ВД-БС КРС в Сибири;
- Молекулярно-биологические свойства изолятов вирусов ИРТ и ВД- БС КРС, выделенных от больных и инфицированных вирусами животных и их сравнительная патогенность для естественно восприимчивых животных в зависимости от генотипа и интерфероногенной активности;
- Противовирусная активность препаратов различных классов в отношении вирусов ИРТ и ВД-БС КРС в опытах in vitro и in vivo.
Теоретический анализ, обобщение результатов, экспериментальные исследования выполнены автором самостоятельно.
Читайте также: