Как хранится сыворотка при исследовании на вич

Обновлено: 28.03.2024

Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.

Напоминаем вам, что самостоятельная интерпретация результатов недопустима, приведенная ниже информация носит исключительно справочный характер.

Антитела к ВИЧ-1/2 и антиген ВИЧ-1/2 (HIV Ag/Ab Combo): показания к назначению, правила подготовки к сдаче анализа, расшифровка результатов и показатели нормы.

ВИЧ-инфекция - инфекционная болезнь, развивающаяся в результате многолетнего персистирования (постоянного пребывания) в лимфоцитах, макрофагах и клетках нервной ткани вируса иммунодефицита человека (далее - ВИЧ), характеризующаяся медленно прогрессирующим дефектом иммунной системы, который приводит к гибели больного от вторичных поражений, описанных как синдром приобретенного иммунодефицита (далее - СПИД).

ВИЧ (Вирус Иммунодефицита Человека) – вирус, относящийся к семейству ретровирусов (семейство РНК-содержащих вирусов, заражающих преимущественно позвоночных), который поражает клетки иммунной системы человека. Через несколько недель с момента заражения начинают вырабатываться антитела к ВИЧ.

вирус.jpg

Показания на проведение исследования

Показаниями для назначения анализа является подготовка к госпитализации и плановому оперативному вмешательству. В профилактических целях следует провести исследование при подозрении на заражение при половом контакте. В первую очередь это касается лиц групп риска: употребляющих наркотики, вводимые внутривенно, часто меняющих половых партнеров и не использующих средств защиты.

Вирус иммунодефицита человека размножается в организме человека достаточно медленно, и количественный результат в отношении антигенов и антител к вирусу можно получить, как правило, не ранее чем через 3-6 недель после инфицирования. При этом клинические симптомы заболевания еще отсутствуют.

прогрессирование.jpg

Через три месяца антигены ВИЧ и антитела к вирусу определяются практически у всех заболевших. Благодаря появлению новых комбинированных тест-систем четвертого поколения получение точного результата качественного анализа на ВИЧ-инфекцию возможно уже через две недели с момента попадания вируса в организм. При этом исследовании выявляют антиген р24 ВИЧ – белок вирусного капсида (внешней оболочки вируса).

Анализ на антитела к ВИЧ 1/2 и антиген ВИЧ 1/2 назначают на этапе планирования и при ведении беременности, когда возможна передача вируса плоду. Анализ проводят и после родов, поскольку ребенок ВИЧ-положительной матери может быть инфицирован во время прохождения через родовые пути и при кормлении грудью.

пути передачи.jpg

Лихорадка, потеря веса без объективных причин, повышенная утомляемость, увеличение регионарных лимфатических узлов, потливость, особенно в ночное время, длительный кашель, диарея – эти устойчивые клинические симптомы неясного происхождения, отмечаемые в течение 2-3 недель, также служат показанием к проведению исследования на антитела к ВИЧ 1/2 и антиген ВИЧ 1/2.

Кожные проявления также могут быть симптомом ВИЧ-инфекции, поскольку развиваются на фоне ослабления иммунитета. К их числу относится рецидивирующая герпетическая сыпь, поражающая обширные участки кожи, полость рта, половые органы. Герпес поражает и глубокие слои кожи с развитием язвенно-некротической формы. Образуются язвы и эрозии с последующим образованием рубцов, которых не бывает при обычном герпесе.

Еще один характерный симптом ВИЧ-инфекции – волосатая лейкоплакия, которая связана с активацией латентной инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр (что свидетельствует об иммуносупрессии). Заболевание проявляется нитевидными образованиями белого цвета с дальнейшим ороговением пораженных участков языка и слизистой оболочки рта.

Обширные грибковые поражения (в первую очередь дрожжевыми грибками рода Candida) также служат типичным признаком, сопровождающим ВИЧ-инфекцию. Сначала кандидоз поражает слизистую оболочку рта и пищевода, затем распространяется на слизистые желудочно-кишечного и мочеполового тракта. При этом формируются обширные очаги, характеризующиеся болезненностью и склонностью к изъязвлению.

ВИЧ-инфекция может сопровождаться развитием обширного папилломатоза. У ВИЧ-инфицированных женщин папилломы цервикального канала склонны быстро вызывать рак шейки матки.

СПИД-индикаторным заболеванием служит саркома Капоши – многоочаговая сосудистая опухоль, которая поражает кожные покровы и слизистые оболочки. Ее очаги в виде красноватых или буроватых узелков и бляшек сливаются, быстро распространяясь по всему телу. Со временем они образуют опухолевые поля, которые изъязвляются и нагнаиваются.

К числу патологических состояний, которые почти у всех пациентов сопровождают ВИЧ-инфекцию, относят полиаденопатию (увеличение лимфатических узлов). Как правило, в первую очередь увеличиваются под- и надключичные, подбородочные, околоушные и шейные лимфоузлы. В дальнейшем к ним может присоединяться увеличение паховых и бедренных лимфатических узлов. Они могут быть мягкими или плотными на ощупь, безболезненными и подвижными. Иногда несколько лимфоузлов сливаются, образуя своеобразный конгломерат. Воспаление двух и более групп лимфоузлов считают признаком генерализованной лимфаденопатии. Поражение лимфатических узлов может наблюдаться в течение нескольких лет, при этом периоды обострения сменяются ремиссией.

К легочным заболеваниям, сопровождающим ВИЧ-инфекцию, относят туберкулез и пневмонию.

Анализ на антигены и антитела к ВИЧ рекомендуют сделать, если у пациента выявлены заболевания, передаваемые половым путем (сифилис, хламидиоз, гонорея, генитальный герпес, бактериальный вагиноз).

Мы проводим исследования крови на:

Преаналитический этап

1

При исследовании на инфекционные маркеры необходимо соблюдать все правила преаналитического этапа, который включает в себя комплекс мероприятий, выполняемых от назначения на инфекционные маркеры до осуществления лабораторных измерений взятого биоматериала.

Преаналитический этап-это условия, в которых находится пациент перед взятием у него биоматериала, его первичной обработки, хранения и доставки в лабораторию. Соблюдение правильного проведения преаналитического этапа важно, так как до 60% погрешностей в КДЛ по России приходится на преаналитический этап.

Преаналитический этап включает:

  • правильное взятие биоматериала
  • хранение
  • транспортировка

При исследовании в цельной крови, сыворотке или плазме образец крови берут чаще всего из локтевой вены. При плановом назначении лабораторного теста кровь для его выполнения следует брать натощак (после примерно 12ч. голодания и воздержания от приема алкоголя и курения), при минимальной физической активности непосредственно перед взятием (в течение 20-30 мин), в положение пациента лежа или сидя.

Взятие венозной крови облегчается применением вакуумных пробирок. Под влиянием вакуума кровь из вены быстро поступает в пробирку, что упрощает процедуру взятия и сокращает время наложения жгута.

В зависимости от назначенного вида исследования образец крови должен собираться при наличии строго определённых добавок. Для получения плазмы кровь собирают с добавлением антикоагулянтов: этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), цитрата, оксалата, гепарина. Для исследований системы свертывания крови применяется только цитратная плазма. В большинстве гематологических исследований используют венозную кровь с солями этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА, К2 или К3-ЭДТА). Взятие биоматериала для иммуносупрессантов (такролимус и циклоспорин) проводят в пробирке с ЭДТА, К2 до верхней метки, содержимое пробирки незамедлительно, с осторожным переворачиванием 5-10 раз, перемешать.

1

Для предупреждения контаминации (механический перенос инфекционного агента из одного образца в другой) необходимо строго соблюдать правила забора биоматериала и его транспортировки.

Доставка образцов крови происходит с соблюдением всех этапов холодовой цепи. Холодовая цепь – это соблюдение температурного режима от момента взятия биоматериала до лабораторного тестирования.

Пробирки с образцами крови после оседания эритроцитов или оседания сгустка крови (не ранее чем через 30мин. после взятия крови) подвергаются центрифугированию. Кровь для получения сыворотки или плазмы центрифугируют в течение 10-15 мин при 800-1600 х g .

Несоблюдение правил преаналитического этапа приводит к возникновению неспецифических реакций.

Общие правила по подготовке к исследованиям на ВИЧ-инфекцию, вирусный гепатит В (HbSAg), вирусный гепатит С, сифилис.

  1. кровь сдавать утром натощак;
  2. исключить физические нагрузки в течение 24 часов;
  3. накануне избегать пищевых нагрузок;
  4. исключить курение минимум за 2 часа до исследования;
  5. исключить приём алкоголя накануне исследования;
  6. при себе иметь паспорт или заменяющий его документ с фотографией

Вич-инфекция

1

ВИЧ-инфекция - болезнь, вызванная вирусом иммунодефицита человека-антропонозное инфекционное хроническое заболевание, характеризующееся специфическим поражением иммунной системы, приводящим к медленному ее разрушению до формирования синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД).

Возбудитель ВИЧ-инфекции - вирус иммунодефицита человека - относится к семейству ретровирусов. Вирус преимущественно поражает клетки иммунной системы-Т-лимфоциты, называемые СD4 Т-клетками. СD4 Т-клетки - это субпопуляция лимфоцитов, которая выполняет важнейшие функции в регуляции и осуществлении иммунного ответа организма против бактерий, вирусов и других микроорганизмов. В клетке человека вирус образует участок ДНК, встраивает его в геном хозяина. Пораженная вирусом клетка производит материалы для построения вирусных частиц, на ее поверхности появляются антигены вируса. При делении дочерние клетки получают вирусную ДНК.

К антигенам вируса, расположенным на поверхности клеток, вырабатываются антитела, которые используются для диагностики инфекции. В настоящее время известны 2 типа вируса: ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Считают, что ВИЧ-2 имеет меньшую способность к распространению и медленнее разрушает иммунную систему.

1

Источником ВИЧ-инфекции является человек. Почти во всех биологических жидкостях инфицированного человеческого организма (кровь, сперма, грудное молоко, влагалищный и цервикальный секрет) в различной концентрации обнаруживаются вирусные частицы.

Основным методом лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции является обнаружение антител к вирусу с помощью иммуноферментного анализа. Антитела к ВИЧ появляются у 90-95% зараженных в течение 3-х месяцев после заражения, у 5-9% - через 6 месяцев от момента заражения и у 0,5-1 %- в более поздние сроки. Наиболее ранний срок обнаружения антител-2 недели от момента заражения.

В терминальной стадии СПИД количество антител может значительно снижаться, вплоть до полного их исчезновения. Серологическая диагностика инфекции ВИЧ на первом этапе строится на выявлении суммарного спектра антител против антигенов ВИЧ с помощью твердофазного анализа. На втором этапе методом иммунного блотинга проводится определение антител к отдельным белкам вируса.

1

Гепатит С

1

Гепатит С - вирусное заболевание , характеризующееся поражением печени и аутоиммунными нарушениями, часто имеющее первично-хроническое и латентное течение. Протекает в желтушной (5%) или безжелтушной (95%) формах. Вирус гепатита С относится к семейству флавивирусов, представляет собой небольшой(40-50нм в диаметре), покрытый оболочкой вирус, достаточно устойчивый во внешней среде. Его геном представлен одноцепочечной РНК, которая кодирует 3 структурных и 5 неструктурных белков вируса. К структурным относятся нуклеокапсидный белок(С-core) и гликопротеины оболочки(Е1-Е2). Неструктурную область представляет комплекс белков с ферментативной активностью(NS1,NS2, NS3, NS4,NS5).

Протекая бессимптомно, долгие годы остающейся нераспознанной, именно ВГС-инфекция является основной причиной формирования всей группы хронических болезней печени - хронического гепатита, цирроза, гепатоцеллюлярной карциномы.

Источниками ВГС являются больные всеми формами острого и хронического гепатита С. Вирус попадает в кровь при любых парентеральных манипуляциях: гемотрансфузии, инъекциях, при посещении стоматолога и гинеколога, оперативных вмешательствах, зондовом обследовании и т.д. К группе риска относятся больные, находящиеся на гемодиализе, страдающие гемофилией и другими заболеваниями крови, получающие плазму, гемоконцентраты, иммуноглобулины. Наркоманы, употребляющие наркотики внутривенно. Медицинские работники, имеющие контакт с кровью. Относительно меньшее значение имеют половой, бытовой и вертикальный пути передачи, что связано с низкой виремией ВГС.

1

Инкубационный период длится в среднем 6-8 недель с возможными колебаниями от 2-4-х недель до 4-6 месяцев больше. В конце инкубационного периода повышаются уровни печеночных трансаминаз (превышают норму в 5-30раз). Сероконверсия наступает через 15-20 недель от момента заражения. На 3-4 недели раньше анти-ВГС-IgG обнаруживается анти-ВГС-IgM. РНК вируса с помощью ПЦР определяется через 1-3 недели после инфицирования.

Лабораторная диагностика гепатита С основана на обнаружении в образцах сывороток крови человека специфических маркеров вируса гепатита С: антител к антигенам ВГС, относящихся к иммуноглобулинам классов G и M, а так же нуклеиновой кислоты возбудителя (РНК ВГС).

1

Гепатит В

1

Гепатит В (ГВ) - является одним из самых распространенных и опасных вирусных инфекционных заболеваний человека, что обусловлено высокой устойчивостью возбудителя во внешней среде и широким спектром клинико-эпидемиологических особенностей.

Вирусный гепатит В- инфекционное заболевание, которое характеризуется тяжелым воспалительным поражением печени. Источниками возбудителя инфекции являются больные острыми и хроническими формами болезни, а также лица с субклиническим течением инфекционного процесса и здоровые носители.

ГВ передается через кровь и контактным, преимущественно половым путем. Большому риску подвергаются медики, имеющие контакты с кровью. Вирус может передаваться от матери к ребенку во время беременности или непосредственно при родах.

Лабораторная диагностика ГВ основана на выявлении специфических для ГВ антигенов и соответствующих антител в крови, а также вирусных нуклеиновых кислот, основными из которых являются:

  • HBsAg
  • анти-НВs
  • анти-НВс класса IgM и IgG
  • HВe-Ag-антиНВе
  • ДНК | ВГВ

В диагностике ГВ наиболее широко используется определение HBsAg. HBsAg – поверхностный антиген вируса гепатита В, основной маркер острого и хронического гепатита В- представляет собой белковую молекулу, ответственную за адсорбцию вируса на поверхности гепатоцитов. После встраивания вируса в геном печеночных клеток они начинают продуцировать вирусную ДНК и белки, и новые молекулы HBsAg поступают в кровь.

1

Данный антиген выявляется как при остром, так и при хроническом заболевании. При остром ГВ поверхностный антиген вируса обнаруживается через 3-5 недель от момента инфицирования, то есть задолго до появления клинических признаков болезни и в этих случаях является единственным серологическим маркером.

Обнаружение поверхностного антигена вируса гепатита В в крови больше 6 месяцев от начала болезни указывает на затяжное или хроническое течение болезни, и позволяет предположить хроническое носительство вируса. Элиминация HBsAg и появление антител к нему является непременным условием выздоровления. Серологическими маркерами репликации ВГВ являются- анти-НВс класса IgM, НвеAg, ДНК и ДНК-полимераза, которые обнаруживаются при остром ГВ с первых дней клинических проявлений или при обострении. HВcAg выявляется в ткани печени и не определяется в сыворотке крови. Опосредованно его присутствие в организме отражают циркулирующие антитела- анти-НВс класса IgM и IgG. В острый период ГВ наличие анти-НВс класса IgM является дополнительным маркером этого заболевания. Наличие в сыворотке крови только анти-НВс класса IgG наблюдается в период между исчезновением HBsAg и образованием анти-HBs. Сочетанное выявление анти-НВс класса IgG в низком титре с анти-НВs указывает на перенесенную ГВ-инфекцию и наличие иммунитета. Тестирование НВеАg проводят в сыворотках крови только с наличием HBsAg и позитивный результат данного маркера свидетельствует об активном процессе - либо подтверждает диагноз острого ГВ, либо свидетельствует об обострении хронического ГВ. Наличие ДНК-ВГВ( наиболее чувствительный маркер продолжающейся репликации ВГВ) в сыворотке крови указывает на высокую инфекционность данного образца и активное размножение вируса в организме. Высокая активность аминотрансфераз сыворотки отражает воспалительное повреждение ткани печени. Сероконверсия HBsAg в анти-HBs происходит у 90-95% больных с острым ГВ в стадии разрешения инфекционного процесса и, является показателем иммунитета к вирусу ГВ, то есть наличие анти-HBs свидетельствует о перенесенной инфекции и наличии иммунитета к этой инфекции. Лица, имеющие эти антитела в защитной концентрации(10МЕ и более), не болеют ГВ и не нуждаются в вакцинации.

Сифилис

1

Сифилис – хроническое инфекционное заболевание, вызываемое Treponemapallidum (бледная трепонема), характеризуется полиорганным поражением и стадийным течением.

Treponemapallidum относится к семейству Spirochaetaceae, роду Treponema. Имеет спиралевидную форму с завитками, грамотрицательный анаэроб. Сифилис , как правило передается половым путем, а важнейшим фактором проникновения бледных трепонем в организм и его инфицирования является нарушение целостности кожных и слизистых покровов и большое количество вирулентных возбудителей. Трансплацентарное заражение или инфицирование новорожденных через родовые пути больных сифилисом матерей, а также при кормлении грудью представляет серьезную опасность и диктует необходимость обследования.

Инкубационный период длится 3-4 недели, первичный серонегативный -1 месяц, затем первичный серопозитивный -1 месяц, затем вторичный период-2-4 года, далее третичный период. В первичном периоде возникает твердый шанкр( безболезненная язва в месте проникновения бледной трепонемы), сопровождающийся регионарным лимфаденитом. В конце первичного периода шанкр самостоятельно заживает, а лимфаденит переходит в полиаденит и сохраняется до пяти месяцев. Началом вторичного периода являются генерализованные высыпания ( пятнистые, папулезные, пустулезные сифилиды). На втором полугодии вторичного сифилиса исчезает полиаденит. Появление третичных сифилидов (бугорков и гумм) знаменует начало третичного периода, который наступает у 40% нелеченных и неполноценно леченных больных. Волны третичного периода разделены более продолжительными периодами латентного течения инфекции. В третичных сифилидах содержится крайне мало трепонем, поэтому они практически не заразны. Передача сифилиса потомству наиболее вероятна в первые три года заболевания. В результате возникают поздние выкидыши (на 12-16 неделе), мертворождение. Ранний и поздний врожденный сифилис. Проявления раннего врожденного сифилиса возникают сразу после рождения и аналогичны проявлениям вторичного сифилиса.

Диагноз сифилиса должен быть подтвержден лабораторными исследованиями, однако, при отрицательном результате скринингового теста обследование пациента с существующим риском недавнего заражения сифилисом следует повторить через 1-2 недели. Образцы, давшие положительный результат в тест-системе для выявления суммарных антител, необходимо проанализировать в системах, выявляющих конкретные классы иммуноглобулинов(JgG и IgM). Положительный результат на JgG и IgM является подтверждением положительного результата, полученного в скрининговом тесте, и свидетельствует о наличии специфических антитрепонемных антител.















ПРАВА ПАЦИЕНТОВ




к приказу департамента

здравоохранения и фармации

от 21.07.2009 г. № 834

МЕТОДИЧЕСКОЕ ПИСЬМО

ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ВИЧ-ИНФЕЦИИ

Стандартным методом диагностики ВИЧ-инфекции служит определение антител к ВИЧ с помощью ИФА. Метод широко используется для скрининга на наличие антител к ВИЧ, обладает высокой чувствительностью (более 99,5%) и пригоден для исследования большого числа образцов. Принцип иммуноферментного анализа основан на выявлении комплекса антиген-антитело с помощью фермента (пероксидаза, щелочная фосфатаза и др.) по изменению окраски специфического субстрата.

Новое поколение комбинированных ИФА-тестов одновременно выявляет антиген и антитела. Их преимуществом является сокращение времени, необходимого для анализа, снижение трудозатрат и большая экономичность по сравнению с тем, когда каждый из анализов выполняется индивидуально.

Быстрые тесты

Быстрые тесты для определения специфических антител к ВИЧ – это тесты, которые можно выполнить менее чем за 30 минут. При правильном использовании быстрые тесты на антитела к ВИЧ являются точными и имеют широкое распространение:

- трансплантология (перед забором материала),

- эпидемиологический надзор (обследование труднодоступных групп населения);

- обследование крови в случае экстренного переливания препаратов крови и отсутствия обследованной на антитела к ВИЧ крови;

- тестирование на ВИЧ, если требуется немедленное начало медикаментозной профилактики ВИЧ в случае аварийной ситуации;

- тестирование беременных женщин с неизвестным ВИЧ-статусом в предродовом периоде.

Виды быстрых тестов:

- Мембранные устройства для концентрации иммунного материала.

- Иммунохроматографический метод (латеральная диффузия).

Иммунный блот

Иммунный блот (ИБ) представляет собой наиболее широко применяемый подтверждающий метод для выявления антител к ретровирусам. Принцип метода заключается в выявлении антител к определенным белкам вируса, иммобилизованным на нитроцеллюлозную мембрану.

Сбор, хранение и транспортировка образцов для проведения исследования

Диагностический алгоритм тестирования на наличие антител к ВИЧ Обнаружение антител к ВИЧ включает два этапа:

I этап (скриниговая лаборатория) - выявление суммарного спектра антител против антигенов ВИЧ с использованием различных тестов (иммуноферментных, агглютинационных, комбинированных, гребеночных, мембранно-фильтрационных или мембранно-диффузных).

Если получен положительный результат, анализ проводится последовательно еще 2 раза с той же сывороткой и в той же тест-системе. Если при этом был получен еще хотя бы один положительный результат (два положительных результата из трех постановок в ИФА) сыворотка считается первичноположительной и направляется в референс-лабораторию для дальнейшего исследования.

II этап (референс-лаборатория). В референс-лаборатории первичноположительная сыворотка повторно исследуется в ИФА в другой (второй) тест-системе, выбранной для подтверждения. При получении положительного результата анализа и во второй тест-системе сыворотку необходимо исследовать в ИБ.

При получении отрицательного результата анализа и во второй тест-системе сыворотка повторно исследуется в третьей тест-системе. В случае получения отрицательного результата анализа во второй, и в третьей тест-системе выдается заключение об отсутствии антител к ВИЧ. При получении положительного результата в третьей тест-системе сыворотка направляется на исследование в ИБ.

Результаты, полученные в подтверждающем тесте (ИБ), интерпретируются как:

- положительные (позитивные) – это пробы, в которых обнаруживаются антитела к 2 или 3 гликопротеинам ВИЧ. При получении положительного результата делается заключение о наличии в исследуемом материале антител к ВИЧ.

- отрицательные (негативные) – это пробы, в которых не обнаруживается антител ни к одному из антигенов (белков) ВИЧ или имеется слабое реагирование с белком р18. При получении отрицательного результата выдается заключение об отсутствии в исследуемом материале антител к ВИЧ.

- неопределенные (сомнительные) – пробы, в которых обнаруживаются антитела к одному гликопротеину ВИЧ и/или каким-либо протеинам ВИЧ. При получении неопределенного результата проводятся повторные исследования на антитела к ВИЧ в зависимости от белкового профиля.

При возможности используют дополнительные методы диагностики (определение р24 антигена или ПЦР исследования). Если был выявлен антиген р24 или ДНК/РНК ВИЧ, повторное обследование на наличие антител проводится через 2 недели и далее через каждые 2 недели до получения положительного результата в подтверждающем тесте.

ПЕРЕЧЕНЬ КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРИЙ, ПРОВОДЯЩИХ ИММУНОФЕРМЕНТНЫЕ АНАЛИЗЫ (ИФА) НА ВИЧ И ПРИКРЕПЛЕННЫХ К НИМ ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ УЧРЕЖДЕНИЙ

ЛПУ, прикрепленные к лаборатории

Клинико-диагностическая лаборатория ГУЗ ЯО Центр СПИД

ЛПУ г. Ярославля, областные лечебно-профилактические учреждения, Ярославская ЦРБ

Ярославская ЦРБ, Большесельская ЦРБ,

Борисоглебская ЦРБ, Гаврилов-Ямская ЦРБ,

Даниловская ЦРБ, Любимская ЦРБ,

Некоузская ЦРБ, Некрасовская ЦРБ,

Пречистенская ЦРБ, Пошехонская ЦРБ,

Иммунологическая лаборатория диагностики СПИД Ростовская ЦРБ

Клинико-диагностическая лаборатория диагностики ВИЧ-инфекции МУЗ Угличская ЦРБ

Угличская ЦРБ, Брейтовская ЦРБ,

Клинико-диагностическая лаборатория диагностики ВИЧ-инфекции Городской больницы города Переславля-Залесского

Городская больница города Переславля-Залесского, Переславский муниципальный район

Донорская кровь, заготовленная в выездных условиях и в стационарах Ярославской области, а также от отделений заготовки крови и её компонентов (ОЗК) №1, №2, №3

Данный материал взят из книги “Диагностические тест-системы: Радиоиммунный и иммуноферментный методы диагностики” Таранова Анатолия Григорьевича и размещен на сайте с любезного разрешения автора.

ТЕХНИКА ЛАБОРАТОРНЫХ РАБОТ

2.1. Условия взятия и хранения биологического материала

Подготовка к проведению лабораторных исследований содержит два основных момента: необходимость соблюдения стандартных условий взятия биологического материала и предотвращение деградации биологически активного вещества в образцах.

Перед получением образца крови медицинскому работнику необходимо знать следующее:
1) некоторые биологические вещества, например гормоны, после приема пищи могут иметь повышенную концентрацию; ,
2) содержание ряда веществ подвержено влиянию циркадных (суточных) колебаний;

3) множество лекарственных веществ способны влиять на определяемые вещества, повышая или понижая их уровень в крови;

4) взятие исследуемого образца у пациентов в горизонтальном, в вертикальном положении или после физической нагрузки изменяет уровень биологически активных веществ иногда более чем на 10 %.

Желательно, чтобы кровь, предназначенная для исследования, забиралась в однотипные центрифужные пробирки. Такие пробирки должен готовить (мыть, высушивать, добавлять коагулянт или ингибитор ферментов) один сотрудник. Кровь без добавок отстаивают, а с добавками центрифугируют, полученную сыворотку или плазму разливают в такое количество мелких пластмассовых или стеклянных пробирок (стекло не всегда выдерживает низкую температуру), которое равно или превышает число разных типов тестирования.

В биохимической деятельности организма большую роль играют биологические ритмы. Пульсирующий характер секреции многих веществ от нескольких минут до суток - все это должно быть учтено при взятии биологического материала. Вне связи с временным фактором и конкретным физиологическим состоянием не существует абсолютных нормативных показателей вещества. Если не преследуется специальная цель исследовать циркадный ритм биологической активности, периферическую венозную или капиллярную кровь у пациентов желательно брать утром натощак в одно и то же время, в условиях физиологического покоя, что особенно важно при исследовании веществ, секреция и метаболизм которых протекает в течение суток неодинаково.

Во время процедуры взятия крови следует избегать гемолиза, который некоторым возможен при длительном венозном застое, энергичной аспирации крови шприцем, попадании в просвет иглы воды и детергентов, действии на кровь высокой и низкой температур.

2.1.1. Получение сыворотки или плазмы крови

Цельная кровь (капиллярная и венозная) используется в основном в биохимических исследованиях (определение глюкозы, показателей КЩР, определение концентрации электролитов в эритроцитах) и гематологии (исследование LE-клеток, гематокрита, на малярию, проведение стандартного клинического анализа крови). Для радиоиммуиных и иммуноферментных методов получают сыворотку или плазму.

Вопрос о том, что лучше брать для анализа - плазму или сыворотку - не имеет однозначного ответа. Некоторые исследователи предпочитают сыворотку, так как стероиды, например, из нее экстрагируются легче и полнее, чем из плазмы. Кроме того, плазма нередко образует эмульсию с органическими растворителями во время экстракции, а после замораживания и оттаивания в ней появляются хлопья фибрина, мешающие определению. Для биохимических исследований чаще используется сыворотка венозной крови, полученной у пациента при определенных условиях.

При выборе вида материала следует учитывать следующее:

1) При получении сыворотки крови возникает опасность того, что при отстаивании крови из эритроцитов интенсивно освобождаются протеолитические ферменты, которые могут разрушить определяемое вещество и повредить его меченый аналог во время инкубирования. Поэтому для определения содержания белковых соединений предпочтительно готовить плазму крови.

2) При получении плазмы часто используют гепарин или цитрат. Первый блокирует связывание антитела с антигеном, второй существенно изменяет кислотность среды, к которой чрезвычайно чувствительны некоторые вещества. Поэтому в сухую центрифужную пробирку желательно насыпать 50 мг ЭДТА на 5 мл крови (1:100). Сразу же после забора кровь перемешать с ЭДТА и отцентрифугировать. ЭДТА является слабым антикоагулянтом, блокатором протеолитических ферментов и составной частью многих буферных смесей.

2.1.2. Обработка крови для лабораторных исследований

Полученная и доставленная в лабораторию кровь должна быть быстро обработана, или подвергнута исследованию. Длительное стояние сыворотки над эритроцитами может привести к сдвигам концентраций составляющих, поэтому время стояния сыворотки над сгустком должно быть ограничено. Кроме того, биологический полураспад некоторых исследуемых веществ настолько мал, что стояние сыворотки при высокой комнатной температуре может полностью исказить полученные результаты исследования.

В начале обработки чистой сухой стеклянной палочкой сгусток крови осторожно отделяется от стенок пробирки, пробирка взвешивается и подготавливается к центрифугированию.
Подавляющее количество лабораторных образцов для исследований рекомендуется центрифугировать при +4 °С, со скоростью вращения 500 - 1000 g (1500 - 3000 об/мин) не более 15 - 20 минут. Высокая скорость вращения, как правило, приводит к гемолизу сыворотки или плазмы.

Полученную сыворотку (плазму) необходимо быстро отделить от форменных элементов крови и плотно закрыть пробирки крышкой. Если получена липемическая или гемолизированная сыворотка, образец, как правило, выбрасывается.

2.1.3. Хранение крови (плазмы, сыворотки)

Для определения большинства биологического материала считается возможным хранение его при комнатной температуре не более 6-8 часов.

Некоторые образцы разрешается хранить в течение недели при + 4°С. При необходимости хранения сыворотки (плазмы) более суток, образец рекомендуется замораживать при -20°С, что позволяет проводить исследования, например, спустя несколько месяцев - раковые маркеры, мочевину, холестерин, большинство гормонов и т.д.

При работе с кровью общим правилом должно являться немедленное отделение плазмы или сыворотки от форменных элементов, так как некоторые вещества могут поглощаться и инактивироваться эритроцитами и лейкоцитами. Но даже в простых водных растворах они спонтанно окисляются (например, кортизол превращается в 21-дезоксикортизол).

Большинство веществ биологического происхождения при низкой температуре более стабильны, чем при комнатной, поэтому их обычно хранят в замороженном состоянии. В пробах крови после ее взятия происходит огромное количество процессов. Быстро размножающиеся бактерии и ферментативный гидролиз могут кардинально изменять состояние и содержание всех компонентов. Наиболее эффективным средством замедления и предотвращения таких изменений являются замораживание и быстрое центрифугирование. Однако, даже при –20 °С биологическая система не стабильна, поскольку активность многих ферментов при этом не изменяется. Естественным следствием этого является снижение концентрации веществ при длительном хранении при - 40, -70°С. На примере АКТГ видно, что температурный режим и физико-химические параметры среды имеют решающее значение для сохранности вещества. При хранении АКТГ в течение 18 месяцев при –17 °С его активность, измеряемая биологическим методом, не изменяется. При 37 °С через 45 минут гормон инактивируется на 64 %, через один день при комнатной температуре - на 85%, при 3°С - на 58%. Но кортикотропная активность кислого экстракта аденогипофиза, полученного гомогенизацией ткани в 0,1 % соляной кислоте, сохраняется при 2°С не менее 39 дней.

Плазму или сыворотку непосредственно после получения запаивают в стеклянные ампулы или помещают во флакончики с плотно закрывающимися крышками, замораживают и хранят при температуре не выше -20°С. При таких условиях образцы пригодны для анализа в течение нескольких месяцев, иногда до года. При повторном замораживании и оттаивании происходит частичная деградация белковых веществ (соединений), в то время как для веществ с малым молекулярным весом (например, стероидные гормоны) эти процедуры не столь опасны.

Образцы крови необходимо хранить в хорошо закрытых пробирках, так как потеря в образце влаги в замороженном состоянии может привести к концентрированию исследуемого вещества и получению в итоге ошибочного результата.

По экономическим соображениям важно до госпитализации и до любых терапевтических вмешательств взять образцы плазмы или сыворотки и поместить их в банк сывороток. После установления диагноза, если нет нужды в исследовании биологического материала, и образец не нужен для исследований, он может быть изъят из банка сывороток или плазм, однако, в наличия патологического процесса (особенно опухоли) возможно повторное определение уровня исследуемых веществ или их комбинаций. Кроме того, исследуемый образец рекомендуется оставлять в банке сывороток с тем, чтобы при модификации наборов фирмой-поставщиком, можно было корректно продолжить мониторинг больного. Этот подход также может оказаться полезным, если появится новый маркер, отличающийся более высокой чувствительностью и специфичностью.

При медленном замораживании образуются кристаллы льда, которые разрывают молекулы, особенно белковые, поэтому для оптимальной стабильности вещества необходимо быстрое замораживание. Лучше всего замораживание проводить с самого начала в жидком азоте - в этой среде процесс замораживания идет намного быстрее и не сопровождается разрушением охлаждаемых веществ. Нет общих правил относительно размораживания, однако эксперименты показывают, что следует избегать теплового шока образцов. Размораживание следует производить медленно и постепенно. Некорректно переносить образец сразу же из –20 °С в комнатную температуру, особенно учитывая сезонные различия температур помещения. Важно избегать повторного замораживания образца, лучше предварительно разделить его на несколько пробирок, чтобы не было проблем в случае повтора анализа.

Размораживание и повторное замораживание повреждает практически все биологические пробы. Существует ошибочное мнение о том, что такое воздействие не влияет на тиреоидные и стероидные гормоны. Действительно, структура молекул этих гормонов лучше сохраняется в таких ситуациях. Однако следует помнить, что основной пул стероидных и тиреоидных гормонов циркулирует под “защитой” транспортных белков, которые, как и все другие белки, не выдерживают температурных перепадов и, разрушаясь, перестают “защищать” гормоны. Последние, освобождаясь, немедленно включаются в метаболическую цепь, что, в конечном итоге, ведет к искажению истинной картины.

Химическое окружение, в котором находится препарат, также является важным фактором. При хранении белков в растворах концентрация этих белков всегда должна быть больше 1 мг/мл. Известно, например, что разбавленная антисыворотка теряет активность намного быстрее, чем неразбавленная. Молекулы некоторых веществ биологического происхождения особенно легко разрушаются при окислении, поэтому их надо хранить в присутствии какого-нибудь восстановителя или в атмосфере, не содержащей кислорода.

Учитывая высокую скорость разрушения биологически активных веществ в органах и тканях, извлечение их и приготовление навесок анализа необходимо проводить в условиях постоянного охлаждения, хранить образцы только в замороженном состоянии. Предварительная обработка материала позволяет значительно увеличить его срок хранения. Например, после обработки гипофиза ацетоном первоначальный уровень гонадотропной активности сохраняется в нем при хранении в холодильнике без замораживания не менее года. Экстракты гормонов и чистые препараты сохраняются гораздо дольше, чем нативные образцы.

Известно, например, что в тканях гипоталамуса рилизинг-фактор к лютеинизирующему гормону подвергается сравнительно быстрому метаболическому разрушению. В то же время при хранении в стерильных условиях растворов синтетического ЛГ-рилизинг-гормонов в течение 18 месяцев при 40 °С он полностью сохранял свою биологическую активность и иммунореактивные свойства.

2.1.4. Получение, обработка и хранение мочи

Сбор мочи для определения биологически активных веществ проводят в течении заданных интервалов времени, чаще всего за сутки. На протяжении суток скорость образования и экскреции вещества с мочой колеблется весьма значительно, но эти колебания нивелируются при исследовании суточной порции мочи. В последнее время появляется возможность определять не в суммарной суточной моче и не суммарные вещества, а конкретные вещества и в любое время суток. Например, определение андрогена надпочечникового происхождения дегидроэпиандростерона-сульфата, или 17-окси-прегненолона, предназначенного для выявления адреногенитального синдрома.

Из рациона человека, по меньшей мере, за трое суток до сбора мочи
необходимо исключить продукты и лекарственные препараты, влияющие на
секрецию и метаболизм ряда веществ. Присутствие в моче некоторых
веществ эндогенного и экзогенного происхождения может искажать
результаты определения веществ. Сбор мочи производят в сосуды из дифферентного материала (стекла, пластмассы) во избежание разрушения вещества.

При сборе мочи также соблюдают определенные предосторожности, ли моча не содержит стабилизаторов, как, например, при определении стероидов и их метаболитов, она должна храниться до анализа в замороженном виде (как правило, не более 10 дней). Замороженную мочу со стабилизатором, предназначенную для определения катехоламинов, допускается хранить не более трех дней.

2.1.5. Получение экссудатов и транссудатов

Перед сбором экссудатов и транссудатов в посуду для сбора рекомендуется добавить 2 капли гепарина или на кончике ножа сухого цитрата натрия для предотвращения свертывания. Жидкость собирается в чистую сухую посуду и немедленно доставляется в лабораторию.

2.1.6. Сбор и хранение кала

Для исключения возможных погрешностей в диагностике запрещено доставлять кал после использования клизм, введения свечей, приема внутрь касторового и вазелинового масел и красящих веществ. Кал, взятый для исследования на дисбактериоз, должен быть срочно доставлен в лабораторию, или поставлен в холодильник при 4°С. При исследовании на простейшие запрещено сохранять кал в термостате или теплой воде, поскольку при этом происходит гибель и регенеративные изменения простейших.

2.1.7. Сбор и хранение мокроты

Мокроту рекомендуется собирать при кашле в сухую чистую посуду не более суток, так как при длительном хранении происходит разложение флоры и аутолиз элементов мокроты. Кратковременное хранение ее рекомендуется проводить в холодильнике при 4°С. Для бактериологических исследований мокрота не должна стоять более 4 часов с момента получения.

2.1.8. Сбор и хранение ликвора

Спинномозговая жидкость (ликвор), полученная при люмбальной пункции или пункции желудочков мозга, собирается в сухую чистую посуду и доставляется в лабораторию немедленно, так как при хранении в связи с разрушением клеточных элементов результат исследования может быть недостоверным.

2.2. Обработка лабораторной посуды

В специальных пособиях приводится много советов по тех лабораторных работ, поэтому мы ограничимся лишь некоторыми рекомендациями, имеющими существенное значение для постановки реакции и получения высококачественного результата в радиоиммунных и иммуноферментных методах диагностики. При работе с буферными системами, органическими растворителями и другими веществами, применяемыми для постановки реакции, особое внимание нужно обращать на чистоту реактивов. Вода для буферного раствора должна быть бидистиллированной и деионизированной. Органические растворители, как правило, подлежат очистке (например, эфир пропускается через колонку с оксидом алюминия) и двойной перегонке с дефлегматором (напр., при получении абсолютного этанола).

Лабораторная посуда должна быть тщательно обрабатывается механическими и химическими способами.

Приготовление моющего раствора:

на 1 л дистиллированной воды 20 г порошка типа "Лотос".

Приготовление хромовой смеси:

в фарфоровом стакане растворяют 50 г бихромата калия (K 2 Cr 2 O 7 ) в 100 мл воды. Раствор сливают в сосуд большего размера и добавляют (очень осторожно) 1 л серной кислоты (концентрированной).

Внимание! Добавлять серную кислоту в раствор, но не наоборот!

2.2.1. Обработка посуды с низкой радиоактивностью

Флаконы - снять надписи с крышек ватой, смоченной в спирте, снять крышки в коробку с надписью “грязные крышки”, слить из флаконов сцинтилляционную жидкость в сосуд для жидких радиоактивных отходов, под струей горячей воды прополоскать флаконы от толуола (до исчезновения запаха), загрузить в бак с моющим раствором, оставить на ночь. На следующий день промыть флаконы сначала под струей холодной воды (налить-вылить 10-15 раз), затем также под струей горячей воды и окончательно под струей дистиллированной воды. Сушить в сушильном шкафу при температуре 150-200 °С вниз горлышком.

Пробирки - снять надписи ватой, смоченной спиртом, промыть под струей горячей воды (налить-вылить 10-15 раз), высушить в термостате или сушильном шкафу при температуре до 150 °С, дать остыть и загрузить в (хромовую смесь на 2-3 часа, (БУДЬТЕ ПРЕДЕЛЬНО ОСТОРОЖНЫ!) , вынуть их из хромовой смеси и промыть как флаконы (см. выше).

Крышки - тщательно протираются ватой, смоченной спиртом (два тампона на крышку), высушиваются при комнатной температуре и хранятся в коробке с надписью “чистые крышки”.

2.2.2. Обработка посуды с высокой радиоактивностью

Флаконы - обрабатывать 96° спиртом: заполнить флакон спиртом, перелить спирт во второй флакон, затем в третий, . в десятый, слить в сосуд для жидких радиоактивных отходов. Процедуру повторить. Последующая обработка флаконов аналогична обработке флаконов с низкой активностью. Крышки загрузить в сосуд, залить ацетоном или 96° спиртом с полным погружением крышек, перемешать 3-5 мин, стеклянной палочкой, жидкость слить в емкость для радиоактивных отходов. Процедуру повторить. Разложить на фильтровальной бумаге в один слой и сушить в вытяжном шкафу. Хранить в коробке с надписью “чистые пробирки”.

Все вышеописанные работы проводить только в вытяжном шкафу при полном отсутствии открытого огня.

Для выполнения биохимических исследований в лаборатории посуда проходит определенный цикл обработки в соответствии с требованиями санитарно-гигиенических и противоэпидемических служб. При выполнении в лабораториях коагулологических исследований или проведения исследований определения ряда пептидных гормонов биологическими методами помимо обычной чистой стеклянной посуды используют силиконированную посуду для взятия и хранения крови и плазмы.

2.2.3. Силиконирование посуды

Силиконирование посуды осуществляют для предотвращения контаминации исследуемого образца со стеклом, в котором проводят химическую реакцию. Силиконирование тормозит активацию свертывания крови, предохраняя распад некоторых веществ (например, пептидных гормонов) при инкубации их со встряхиванием.

Стекло покрывается мономолекулярной пленкой силикона:

5% раствор дихлордиметилсилана в толуоле. Чистая сухая посуда заполняется раствором и сразу же выливается. Силиконирование проводят в вытяжном шкафу, затем проводят сушку посуды в сушильном шкафу 180°С в течение часа.

Раствор для силиконирования хранят в посуде с притертой пробкой
в вытяжном шкафу.

Использовать силиконированную посуду не более 5 раз, затем силиконирование необходимо повторить.

Читайте также: