Как красить мазок крови на пироплазмоз

Обновлено: 28.03.2024

Использование: в области медицины и ветеринарии и может применяться для диагностики протозойных заболеваний. Сущность изобретения: мазки фиксируют и окрашивают опусканием их по 4-5 раз в течение одной секунды в растворы анионового красителя - 0,5%-ного раствора эозина, а затем в катионовые красители - 0,5%-ный раствор азура и отдельно в 0,5%-ный раствор метиленового синего. Способ позволяет ускорить окраску мазков и повысить качество мазков для микроскопического исследования.

Формула изобретения

Способ окраски мазков крови, включающий фиксацию мазка метиловым спиртом и окраску с растворах эозина, азура и метиленового синего, отличающийся тем, что мазки опускают по 4 5 раз по одной секунде вначале в анионовый краситель 0,5% -ный раствор эозина, а затем в катионовые красители 0,5%-ный раствор азура и отдельно в 0,5%-ный раствор метиленового синего также по 4 5 раз по одной секунде.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и ветеринарии и может быть использовано для диагностики протозойных заболеваний человека и животных.

Известны способы окраски мазков периферийной крови по Романовскому-Гимзе и генцианвиолетом для диагностики протозойных заболеваний, включающие приготовление мазков крови, их фиксацию и окрашивание в растворе краски в течение одного часа (см. Б.И. Антонов и др. Лабораторные исследования в ветеринарии. Справочник, М. "Агропромиздат", 1986).

Недостатком является то, что в указанном способе исключено предварительное приготовление смеси красок, способ отнимает много времени и не обеспечивает чистоту мазков, которые содержат осадок частиц красок и другие частицы.

Цель изобретения повышение эффективности диагностики за счет ускорения окраски мазков и повышения качества мазков для микроскопического исследования.

Существо способа заключается в следующем. Для окрашивания мерозоитов саркоцист, анаплазм и пироплазмид мазки готовят из периферийной крови овец и крупного рогатого скота, а для окрашивания цистозоитов саркоцист готовят мазки-отпечатки (кляч-препараты) из содержимого саркоцист. Приготовленные мазки фиксируют. Окрашивание проводят в течение 15.20 с. Приготовленные мазки крови на предметных стеклах опускают поочередно по четыре-пять раз в реагенты: метиловый спирт (фиксатор), 0,5%-ный раствор эозина, 0,5%-ный раствор азура и 0,5% -ный раствор метиленового синего. Затем мазки ополаскивают в дистиллированной воде и обезвоживают. Мазки готовы к микроскопированию.

Необходимым условием является дискретное помещение мазков в растворы и реагенты, то есть не выдержка четыре-пять секунд, а выдержка по одной секунде несколько раз. Дело в том, что авторами взята на вооружение практика окрашивания тканей (в литературе мы источника не нашли возможно это народный прием), когда ткань не выдерживают в красителе, а несколько раз окунают и вынимают с выдержкой некоторого времени на воздухе. Возможно составляющие воздух газы способствуют более интенсивному окрашиванию.

Эффективность окрашивания также повышается за счет того, что применение красителя имеют разную природу: эозин (эозин К, эозин N, эозин ) анионовый краситель, азур (азур АБ, азур А) и метиленовый синий катионовые красители.

Предложенный способ позволяет за короткий промежуток времени (15.20 с против одного часа в известном способе) окрасить мазок и выявить инвазированность животного. Это экономически выгодно при массовых обследованиях и диспансеризации.

При сравнении предложенного способа окраски мазков с ранее известными (по Романовскому-Гимзе и генцианвиолетом) установлено, что новый способ не только сокращает срок диагностики заболеваний, но и повышает качество мазков они не содержат осадка красок и других частиц, выявляемых при известных способах.

Еще одним преимуществом нового способа является то, что, в отличие от известных способов, при которых растворы готовятся перед использованием и не хранятся долго, приготовленные растворы красок не теряют свойства окрашивать мазки в течение 5.6 дней.

Пример 1. Окрашивали мазок крови от больной пироплазмозом лошади. Мазок высушили на воздухе. Зафиксировали в метиловом спирте. Стекло с мазком крови опускали в 0,5%-ный раствор эозина по одной секунде четыре раза. Дали стечь краске и опускали стекло в 0,5%-ный раствор азура также четыре раза по одной секунде. Затем также опускали четыре раза в 0,5%-ный раствор метиленового синего. Мазок ополоскали в дистиллированной воде, просушили фильтровальной бумагой. Под микроскопом мазок выглядит чистым, нет посторонних включений, пироплазмы четко выделяются на розовом фоне.

Пример 2. Использовали для окраски мазков крови сложный краситель, приготовленного тщательным растиранием с глицерином и метиловым спиртом, взятых в количестве по 250 мл, азура 0,8 г и эозина 3 г, смесь выдерживают в термостате 5 дней, фильтруют. Перед использованием в 1 мл дистиллированной воды вносили 3 капли указанного раствора. Окрашивали мазки в течение 1 ч, краску слили, мазок высушили. Включение в мазок частиц краски несколько затрудняет просмотр мазка под микроскопом.

Сравнивая известный и предложенный способы пришли к выводу, что известный способ более трудоемкий в исполнении, качество препарата намного хуже, чем при предложенном способе, время на приготовление краски и окрашивание мазка во много раз больше.

Использование предложенного способа позволяет получать экономический эффект, обусловленный снижением трудоемкости способа, сокращением затрат времени и повышением качества препаратов, что способствует эффективной диагностике и своевременному лечению.


Бабезиоз широко распространен среди собак в разных природно-географических зонах и достаточно часто протекает в тяжелой форме [4].

В Российской Федерации данное заболевание регистрируется во многих регионах, от Калининградской области, Северного Кавказа до Сибири, причем последние десятилетия имеет место тенденция к увеличению заболеваемости [6].

Пироплазмоз (бабезиоз) собак – трансмиссивное природно-очаговое заболевание, протекающее остро, реже – хронически, и сопровождающееся повышением температуры до 41ºС, анемией видимых слизистых оболочек, желтушностью, гемоглобинурией, гемоглобинемией, расстройством функции сердечнососудистой, пищеварительной и нервной систем [5]. Переносчиком пироплазмоза собак на территории Российской Федерации являются клещи Dermacentor marginatus и Dermacentor pictus [2].

Целью нашего исследования явилось подробное изучение методов диагностики пироплазмоза собак.

Исследования проводились на базе кафедры инфекционных болезней, зоогигиены и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВО Башкирский ГАУ и ветеринарной клиники г. Уфа.

Объектом исследования являлись собаки, больные пироплазмозом, или подозреваемые в данном заболевании.

Диагноз на пироплазмоз ставится комплексно, с учетом анамнестических и эпизоотологических данных, клинических признаков, результатов лабораторной диагностики (микроскопия мазка периферической крови, общий анализ крови, общий анализ мочи, биохимический анализ крови и др.).

Учитываются сезон года (весна–лето–осень) и эпизоотическая ситуация (отмечались ли случаи пироплазмоза в данной местности ранее). При сборе анамнестических данных уточняют, не снимали ли клещей с собаки в течение предыдущих 1-3 недель [7].

Клинические признаки. Инкубационный период болезни продолжается 6-10 сут. Заболевание характеризуется повышением температуры тела до 41-42 °С. Собаки становятся апатичными, отказываются от корма, дыхание тяжелое, учащенное. Слизистые оболочки ротовой полости и глаз гиперемированы, а затем становятся анемичными, с желтушным оттенком. Пульс слабый, нитевидный, дыхание учащенное, затруднено (до 36-48 движений в минуту). На 2-5-е сутки появляется гемоглобинурия. Животному тяжело двигаться, особенно ослабевают задние конечности, могут наступить парез и паралич. Указанные признаки регистрируют в течение 3-7 сут. Затем температура снижается до субнормальной 35-36 °С и болезнь заканчивается летально.

Хроническое течение болезни наблюдается у собак с повышенной резистентностью организма, беспородных и ранее переболевших пироплазмозом. Температура тела повышается до 40-41 °С только в первые дни болезни, затем нормализуется. Животные вялые, быстро утомляются, аппетит ухудшается. Улучшение состояния сменяется депрессией. Характерные признаки — прогрессирующая анемия и кахексия. Болезнь продолжается 3-6 нед. Выздоровление наступает медленно [1, 5].

Окончательный диагноз на пироплазмоз ставится только при обнаружении парных грушевидных форм паразита при микроскопическом исследовании мазков периферической крови [1].

При микроскопии мазков Babesia canis может иметь различную форму: грушевидную, овальную, округлую, амебовидную, парную грушевидную. Все формы могут различно ассоциироваться в одном эритроците.

При постановке диагноза на пироплазмоз также проводят биохимический анализ крови и общий анализ мочи.

Общий анализ мочи указывает на наличие билирубина, белка, эритроцитов, а в тяжелых случаях в моче обнаруживают кетоны и лейкоциты, изменение рН и плотности мочи.

Во всех пробах мочи был обнаружен билирубин, что свидетельствует о поражении печени. Обнаружение эритроцитов в моче является характерным признаком пироплазмоза (при этом моча окрашивается в красно-коричневый цвет). Содержание лейкоцитов в моче отражает степень тяжести заболевания. У тяжелобольных собак в моче были обнаружены кетоновые тела, что свидетельствует о токсическом воздействии пироплазм на организм. Белок в моче является показателем нарушения функционирования почечных канальцев. Сдвиг pH в кислую сторону обусловлен распадом гемоглобина и др. белков.

Биохимическое исследование крови. У всех собак с диагнозом пироплазмоз увеличивается количество билирубина в сыворотке крови, что связано с распадом эритроцитов и высвобождением большого количества гемоглобина, распадающегося в печени до билирубина. Также в сыворотке повышаются показатели АЛТ и АСТ, что указывает на разрушение клеток печени.

У собак, больных бабезиозом, наблюдается повышение уровня мочевины в сыворотке крови, что свидетельствует о нарушении мочевинообразовательной функции в гепатоцитах. Также это указывает на уменьшение способности почек к экскреции из организма мочевины [3].

Повышение уровня креатинина в сыворотке крови больных бабезиоз собак указывает на нарушение фильтрационной способности почечных клубочков, поскольку после фильтрации в них он не реабсорбируется в почечных канальцах. Согласно этим данным у собак, больных пироплазмозом, присутствует и гепаторенальный синдром [3].

Результаты исследования. Для постановки диагноза на пироплазмоз собак необходимо провести полноценное исследование животного (клинический осмотр с обязательной термометрией, микроскопия мазков периферической крови).

Дополнительные методы диагностики – общий и биохимический анализ крови, общий анализ мочи, УЗИ и др. помогают не только поставить точный диагноз, но и определить степень интоксикации организма, повреждение тех или иных внутренних органов.

Важно помнить, что окончательный диагноз на пироплазмоз ставится только при обнаружении бабезий в эритроцитах при микроскопическом исследовании мазков периферической крови.

Библиографический список

1. Акбаев, М.Ш. Паразитология и инвазионные болезни животных [Текст]: учебник / М.Ш. Акбаев [и др.]. – М.: КолосС, 2008. – 776 с.

2. Белименко, В.В. Бабезиоз собак в Российской Федерации. [Текст] / В.В. Белименко, В.Т. Заблоцкий, П.И. Христиановский // Journal of Small Animal Practice .- 2013.- Том 4 №6.

4. Мазитова, О. Распространение бабезиоза собак в Рязани и комплексная терапия [Текст] / О. Мазитова // Ветеринария сельскохозяйственных животных. – 2015. - № 11. – С. 7.

5. Практикум по диагностике инвазионных болезней животных [Текст]: практикум / М.Ш. Акбаев [и др.]. – М.: КолосС, 2006. – 536 с.

6. Темичев, К. Инвазированность клещей-переносчиков бабезиями собак [Текст] / К. Темичев // Ветеринария сельскохозяйственных животных. – 2015. - № 6. – С. 4.

7. Христиановский, П.И. Бабезиоз собак (обзор научной литературы) [Текст] / П.И. Христиановский // Инновации в сельском хозяйстве. – 2017. - № 1. – С. 7.


ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА И ЛЕЧЕНИЕ ПИРОПЛАЗМОЗА СОБАК

Текст работы размещён без изображений и формул.
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF

В республике Башкортостан в последние годы собаководство активно развивается. Экологические факторы способствуют увеличению количества иксодовых клещей, что приводит к ухудшению эпизоотической ситуации по пироплазмозу среди собак.

Целью наших исследований являлась изучение эпизоотической картины по пироплазмозу, применение лабораторных методов диагностики, выбор оптимальной схемы лечения.

Материал и методы исследований. Материалом для исследований служили 20 животных, принадлежавших жителям г. Уфа, обратившихся в ветеринарную клинику с подозрениями на пироплазмоз. Для постановки окончательного диагноза на бабезиоз проводили микроскопию мазков крови собак, окрашенных экспресс-методом. Для этого использовали краски ДИАХИМ-ДИФФКВИК – набор для быстрого дифференциального окрашивания биопрепаратов. Испытание пироплазмицидных препаратов в комплексе с препаратами для симптоматического лечения проводили на спонтанно зараженных бабезиозом собаках. Использовали 2 схемы лечения, в каждой группе по 10 собак. Во время лечения у животных ежедневно определяли клинический статус, проводили исследование мазков периферической крови. Группы животных подбирались по принципу аналогов.

Таблица 1 Схема лечения первой группы

Количество собак в группе

Витамин В12 (цианокобаламин)

Таблица 2 Схема лечения второй группы.

Количество собак в группе

Результаты исследований. За весенне-осенний период с апреля по октябрь месяцы 2016 г. в ветеринарную клинику обращались по поводу укуса собак клещами в 30 случаях, у 28 из которых подтвердился диагноз пироплазмоз лабораторными исследованиями мазков крови. Зараженность собак пироплазмозом составила 93,3%. При обращении в ветеринарную клинику на 2-3 день после укуса клеща у собак отмечались следующие клинические признаки: вялость, слабость, повышение температуры до 40-42ºС. Иногда состояние животных было значительно хуже. Наблюдали отказ от еды, моча темного цвета, красно-коричневого или зеленовато-коричневого цвета, вплоть до черной. Слизистые оболочки бледные или с признаками желтухи, отмечали понос или рвоту.

Для постановки окончательного диагноза и назначения лечения необходимо было исследование мазков крови на обнаружение возбудителя. Под микроскопом мы обнаружили пораженные бабезиями эритроциты.

Так же при постановке диагноза проводили общий анализ крови (таб. 3)

Таблица 3. Результаты общего анализа крови

Содержание в норме

Содержание у больных животных

Таким образом, резкое снижение количества эритроцитов коррелирует с появлением выраженной гемоглобинурии. При хроническом течении, во время и после рецидива, также отмечается значительное снижение количества эритроцитов. При пироплазмозе собак происходят выраженные изменения и в лейкоцитарной формуле.

У собак первой группы период лечения длился 3 дня. На второй день после назначения лечения у них появился аппетит, но сохранялась повышенная жажда и температура. Моча чуть посветлела. На 3-ий день у собак нормализовалась температура, аппетит и жажда. Моча приобрела характерный желтый цвет.

У собак второй группы (с использованием азидина) лечение длилось 5 дней. На 2-ой день после назначения лечения у собак появился незначительный аппетит, но продолжалась рвота. Температура понизилась, моча красного или светло-коричневого цвета. На 3-ий день рвота прекратилась, появился аппетит, но собаки малоактивны. Моча стала темно-желтого цвета. Температура нормализовалась. На 5-й день все физиологические показатели нормализовались.

Таким образом, схема лечения с использованием пиростопа в качестве специфического препарата в комплексе с этиотропным лечением дала наилучший терапевтический результат. Вторая схема лечения с применением азидина в качестве противопротозойного препарата также имеет высокий терапевтический индекс при комплексном подходе к лечению пироплазмоза собак.

Так же при постановке диагноза делали общий анализ крови. При пироплазмозе мы наблюдаем увеличение лейкоцитов, пониженное содержание лимфоцитов, эритроцитов, уровня гемоглобина и гематокрита (см. таб. 1).


МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МАЗКОВ КРОВИ НА КРОВЕПАРАЗИТОЗЫ НЕПРОДУКТИВНЫХ ЖИВОТНЫХ

Текст работы размещён без изображений и формул.
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF

Актуальность. Кровепаразитозы относятся к группе трансмиссивных инвазий, т.е. болезней, передаваемых через кровососущих членистоногих. Этот фактор определяет ряд биологических и эпизоотологических особенностей этой группы болезней. Одной из важнейших биологических особенностей этих болезней является длительное, иногда пожизненное, сохранение паразитов в организме переболевших животных. Такие животные являются основным резервуаром инвазии в природе и постоянно заражают членистоногих – переносчиков, в организме которых паразиты выживают относительно недолго. А те, в свою очередь, создают природный неблагополучный очаг и распространяют болезни среди восприимчивых животных.

Кровепаразиты, в частности, пироплазмоз непродуктивных животных до настоящего времени остается проблемой для Алматы и его пригородов и вызывает интерес у исследователей, что приведено в работе А.А. Ибраимовой, Д.М.Хусаинова, Г.С.Шабдарбаевой ( 2016) [1].

Роль и важность своевременной и надежной диагностики кровепаразитозов в комплексе мер борьбы с ними не вызывают сомнений, особенно с учетом того, что на сегодняшний день разработаны достаточно эффективные методы и средства стерилизации организма животных от кровепаразитозов.

Многие исследователи при диагностике кровепаразитозов использовали эпизоотологические, клинические, микроскопические, серологические методы диагностики, спленэктомию, которая провоцирует острое течение болезни, ксенодиагностику, метод исследования клещей-переносчиков на инвазированность кровепаразитами и патолого-анатомический метод. Так в Казахстане имеются работы Н.А.Ефремова (1987); М.К.Жантуриева, Б.М.Жантуриева, (1998), в которых впервые упоминается о пироплазмозе собак на территории республики [2,3]. Позже ряд исследователейизучали распространение кровепаразитов животных на юго-востоке Казахстана; иксодофауну и особенности эпизоотологии пироплазмоза собак; исследовали иксодид на зараженность кровепаразитами; разработали пути совершенствования диагностики пироплазмоза, его лечение и профилактику: Г.С. Шабдарбаева Г.С., А.И.Балгимбаева (2005; 2006; 2008; 2009); Г.С. Шабдарбаева Г.С., А.И.Балгимбаева, А.С.Ибажанова (2009; 2010); Е.Крылова, Г.С. Шабдарбаева (2018) [4,5,6,7,8,9,10].

Эффективность диагностических исследований при кровепаразитозах непродуктивных животных до сих остается актуальной.

Цель исследований. Изучить различные методы окраски и обогащения мазков крови от непродуктивных животных для усовершенствования диагностики кровепаразитозов.

При изучении клинических параметров отмечали общее состояние животного, температурную реакцию, состояние видимых слизистых оболочек, наличие или отсутствие гемоглобинурии.

Исследовали подозрительных в заболевании кровепаразитозами собак несколькими лабораторными методами: методом приготовления тонких мазков крови из периферических сосудов при окрашивании традиционным методом Романовского-Гимза; метод ускоренной окраски мазков крови по Романовскому; методом Лейшмана; методом Нохта [11].

Всего исследованы мазки крови от 31 собаки. Микроскопирование приготовленных разными методами мазков крови и дифференциацию кровепаразитов проводили с помощью тринокулярного м икроскопа с компьютером KARL ZEISS с фотографированием наиболее характерных мазков и форм паразитов, пользуясь описанием морфологии кровепаразитов, их рисунками и фото.

Результаты и обсуждение.

Нами в сравнительном аспекте были использованы следующие методы исследования мазков крови:

1. Метод окрашивания мазков по Романовскому-Гимза - мазки крови готовили от температурящих животных на обезжиренных предметных стеклах с помощью шлифованного стекла, высушивали при комнатной температуре, фиксировали 96º этиловом спирте и красили методом Романовского-Гимза, экспозиция – 40 минут. Смывали краску дистиллированной водой, высушивали мазки и просматривали их под иммерсионной системой микроскопа по линии Меандра на наличие кровепаразитов. Всего просматривали по 50 полей зрения (п.з.) микроскопа.

3. Метод Лейшмана – нефиксированный мазок крови покрывали фильтровальной бумагой и на нее наносили пипеткой 10-15 капель готовой краски Лейшмана, приготовленной на основе метиленового спирта, обладающего фиксирующими свойствами. Через 3 минуты нанесенную краску разбавляли 10-15 каплями дистиллированной воды, смешивая ее на мазке пипеткой. Еще через 3 минуты краску сливали, мазок обмывали дистиллированной водой, просушивали фильтровальной бумагой и просматривали под иммерсионной системой по линии Меандра на наличие кровепаразитов в 50 п.з. микроскопа.

4. Метод Нохта – готовили раствор эозина и раствор азура ІІ по отдельности на дистиллированной воде в концентрации 1:1000, хранили их в сухом темном месте. Далее для окраски мазков готовили рабочие растворы на дистиллированной воде нейтральной реакции из расчета 2 мл основного раствора красок на 4 мл воды. Затем краски смешивали и полученной смесью окрашивали мазки методом подслаивания. Через 40 минут мазки обмывали водой, высушивали и исследовали под иммерсионной системой микроскопа по линии Меандра на наличие кровепаразитов в 50 п.з. микроскопа.

Результаты исследования мазков крови плотоядных животных различными вариантами приведены в таблице 1.

Таблица 1 – Оценка различных методов исследования мазков крови непродуктивных животных на наличие кровепаразитов

Читайте также: