Кольцевая проба с молоком на бруцеллез

Обновлено: 23.04.2024

НАСТАВЛЕНИЕ ПО ДИАГНОСТИКЕ БРУЦЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ

Руководитель Департамента ветеринарии Е.А.Непоклонов 29 сентября 2003 г. N 13-5-02/0850

1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

1.1. Бруцеллез - инфекционная, хронически протекающая болезнь животных.

Возбудитель - бактерии из рода бруцелла, в который входят шесть самостоятельных видов: мелитензис (овец и коз), абортус (крупного рогатого скота), суис (свиней), канис (собак), овис (баранов и овец) и неотома (кустарниковых крыс).

Микроорганизмы первых четырех видов вызывают бруцеллез животных, а пятого вида - инфекционный эпидидимит баранов (ИЭ).

От животных, больных бруцеллезом, могут заражаться люди, для которых наиболее опасен возбудитель бруцеллеза овец и коз.

1.2. Диагноз на бруцеллез у животных ставят на основании результатов бактериологического, серологического, молекулярно-генетического и аллергического исследований с учетом эпизоотологических данных и клинических признаков болезни, руководствуясь при этом санитарными и ветеринарными правилами по профилактике и борьбе с заразными болезнями, общими для человека и животных.

1.2.1. При установлении диагноза на бруцеллез необходимо учитывать следующее:

- различные виды возбудителя являются патогенными, в основном, для животных соответствующего вида. Бруцеллы видов мелитензис, абортус и суис могут мигрировать на животных других видов;

- клинические признаки бруцеллеза у животных не характерны. Наиболее часто клиническое проявление болезни у маточного поголовья - аборт, у свиноматок наблюдается мумификация плодов.

При абортах отмечается утолщение плодовых оболочек, образование на них фибринозных или гнойных хлопьев. Бруцеллез сопровождается нередко поражением суставов (артриты), синовиальной системы (тендовагиниты, бурситы), половой системы (у самок - эндометрит, вагинит, у самцов - орхит, эпидидимит);

- патологоанатомическая картина при бруцеллезе не имеет характерных особенностей, позволяющих использовать их для диагностики этой болезни. Только у свиней на слизистой оболочке матки иногда находят желтовато-гнойные или казеозные узелки величиной с просяное зерно, так называемый "милиарный бруцеллез матки";

- у баранов, больных бруцеллезом, в семенниках и придатках обнаруживают некротические или гнойные очаги различной величины; отмечают заполнение полости мошонки серозно-гнойным транссудатом, разрастание фиброзной ткани, сращение придатка с семенником и общей влагалищной оболочкой, иногда атрофию семенников.

1.3. Диагностика бруцеллеза включает лабораторные (бактериологическое, серологическое и молекулярно-генетическое) исследования материала и аллергическое исследование свиней в хозяйствах.

Плановые серологические исследования являются основным методом выявления больных и подозрительных по заболеванию животных.

Бактериологическую диагностику проводят в случае аборта или при появлении у животных других признаков (бурситы, гигромы, орхиты, эпидидимиты и прочие), вызывающих подозрение на данное заболевание. Одновременно проводят серологическое исследование сывороток крови этих животных.

Молекулярно-генетическое исследование (ПЦР) проводят в случае аборта и при появлении у животных других клинических признаков, вызывающих подозрение на бруцеллез, а также при получении положительных и сомнительных результатов серологического исследования на бруцеллез животных, не иммунизированных противобруцеллезными вакцинами, из хозяйств, благополучных по данному заболеванию.

1.4. При взятии проб крови, молока и патологического материала, а также проведении лабораторных исследований необходимо соблюдать меры, предупреждающие заражение людей и обсеменение объектов внешней среды, руководствуясь при этом действующими правилами и инструкциями.

2. ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА ОТ ЖИВОТНЫХ И ПЕРЕСЫЛКА ЕГО ДЛЯ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Материал для лабораторных исследований отбирают от каждого животного в отдельности.

2.2. Для бактериологического исследования на бруцеллез направляют абортированный плод с плодовыми оболочками (от свиноматок берут не менее трех плодов) или селезенку, печень, желудок плода с содержимым, перевязанный со стороны пищевода и двенадцатиперстной кишки, и околоплодную жидкость.

Для прижизненной диагностики бруцеллеза от животных берут кровь, молоко, содержимое гигром (бурситов) и абсцессов. При диагностическом убое - дополнительно селезенку, печень, подчелюстные, заглоточные, предлопаточные, надколенные, подколенные, надвыменные, парааортальные, тазовые лимфатические узлы и половые органы. Жидкий материал берут в стерильную посуду (пробирки, банки).

При взятии содержимого гигром, бурс в области поражения выстригают шерсть, кожный покров дезинфицируют 70%-ным спиртом и смазывают настойкой йода. Затем стерильным шприцем с иглой большого диаметра делают пункцию, отсасывают содержимое гигромы (бурсы) и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой.

Перед взятием проб молока у коров вымя обмывают теплой водой, соски обрабатывают 70%-ным спиртом. Для исследования из каждой доли вымени берут последние порции молока в количестве 10-15 мл в отдельные стерильные пробирки с резиновыми пробками.

У овец и коз пробы молока берут путем пункции цистерны вымени. Для этого животное фиксируют в боковом положении, вымя у основания соска протирают 70%-ным спиртом и смазывают настойкой йода. Стерильным шприцем с иглой делают пункцию у основания соска и после попадания иглы в цистерну (о чем судят по свободному движению конца иглы) набирают в шприц молоко и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой.

Молоко должно быть доставлено в лабораторию и исследовано в день взятия пробы. Если это невозможно, молоко консервируют сухой борной кислотой (0,1 г на 10 мл) или генцианвиолетом (0,4 мл 1%-го спиртоводного раствора краски на 10 мл молока). Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 10 дней.

2.2.1. Отобранные для бактериологического исследования пробы упаковывают в целлофан или пергаментную бумагу, помещают в непроницаемую тару (ящик, банка, полиэтиленовый пакет) и в этот же день направляют в лабораторию. От абортировавшего животного одновременно с патологическим материалом направляют кровь (сыворотку крови) для серологического исследования на бруцеллез. Если в течение 24-30 ч взятый материал доставить в лабораторию не представляется возможным, его консервируют стерильным 30%-ным водным раствором химически чистого глицерина. Материал заливают консервирующей жидкостью в количестве, превышающем его объем в 4-5 раз. Крупные плоды направляют в неконсервированном виде.

2.3. Для серологического исследования в лабораторию направляют кровь (сыворотку крови) и молоко.

2.3.1. Кровь у животных берут из яремной вены (у свиней - из яремной, ушной или хвостовой; у собак - головной предплечья или латеральной подколенной голени; у лисиц и песцов - из бедренной вены; у норок путем отсечения подушечки среднего пальца задней лапы или кончика хвоста в стерильные пробирки по 5-7 мл (от пушных зверей по 1-2 мл). Пробирки нумеруют и составляют опись проб.

Консервирование сывороток проводят:

- добавлением 0,05 мл (1 капля) 5%-го раствора фенола на каждый миллилитр сыворотки при тщательном перемешивании;

- сухой борной кислотой (2-4% к объему сыворотки) до получения насыщенного раствора и образования на дне пробирки небольшого осадка;

- путем однократного замораживания.

Неконсервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 6 сут со дня взятия крови при условии хранения их при 4-8 °С.

Сыворотки, консервированные фенолом или борной кислотой, пригодны для исследования в течение 30 сут; замороженные сыворотки - в течение 3 сут после однократного оттаивания.

Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки исследованию на бруцеллез не подлежат.

2.3.2. Для исследования на бруцеллез в кольцевой реакции пробу цельного свежего молока от коровы (буйволицы) берут сборную из каждой доли вымени одного удоя в одну стерильную пробирку в количестве 10-15 мл. При этом, если молоко берут перед дойкой, то первые порции молока сдаивают. Пробы молока на рынках берут из каждой отдельной посуды (бидон, фляга и проч.) после тщательного его перемешивания. Пробирки нумеруют и составляют опись проб.

Молоко исследуют свежее (охлажденное до 4-10 °С или неохлажденное) или консервированное добавлением в каждую пробу одной капли 10%-го раствора формалина на 5 мл молока. Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 2-3 сут. Перед исследованием молоко необходимо тщательно перемешать для равномерного распределения сливок.

При массовом исследовании молока работу по отбору проб и постановке кольцевой реакции можно проводить непосредственно на ферме в специально отведенном помещении.

Не разрешается исследовать в кольцевой реакции молоко от коров (буйволиц), больных маститом или болезнями, сопровождающимися повышением температуры тела, а также молоко животных в первые две недели после родов. Молоко, имеющее повышенную кислотность (30° по Тернеру и выше), исследованию не подлежит, т.к. антиген обесцвечивается.

2.4. На направляемый в лабораторию материал заполняют сопроводительный документ установленной формы.

3. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА

3.1 Бактериологическую диагностику бруцеллеза проводят в случае аборта или при появлении у животных других признаков (бурситы, гигромы, орхиты, эпидидимиты и прочие), вызывающих подозрение на данное заболевание.

3.2 Бруцеллы обнаруживают бактериоскопией мазков из патологического материала, выделением культуры бруцелл на питательных средах и, при необходимости, путем постановки биологической пробы на морских свинках.

3.3 Бактериоскопическое исследование

Из доставленного на исследование патологического материала делают по два мазка из каждого объекта. При исследовании абортированных плодов мазки готовят из содержимого желудка, жидкости брюшной и грудной полостей, печени, селезенки, а также котиледонов плодовых оболочек. Из паренхиматозных органов, котиледонов и другого плотного материала делают мазки-отпечатки, жидкий материал наносят на предметные стекла пипеткой.

Мазки, фиксированные над пламенем горелки, окрашивают по Граму и одному из следующих специальных методов: по Стампу (модифицированный метод Циль-Нильсена), Козловскому или Шуляку-Шину (см. Прил. N 1, п.1). При микроскопии мазков учитывают, что бруцеллы - мелкие, грамотрицательные, расположенные отдельно, попарно или кучно коккобактерии, окрашивающиеся по Стампу, Козловскому или Шуляку-Шину в красный цвет.

3.4. Бактериологическое исследование

3.4.1 Для культивирования бруцелл используют мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ), печеночный глюкозо-глицериновый бульон (ПГГБ), мясо-пептонный печеночно-глюкозо-глицериновый агар (МППГГА), печеночный глюкозо-глицериновый агар (ПГГА), картофельный агар, эритрит-агар, сывороточно-декстрозный агар, печеночно-сывороточный агар и печеночно-аминопептидный агар, (см. Прил. N 1, п.2) и другие питательные среды, предназначенные для этой цели.

3.4.2 Перед посевом материала кожу абортированного плода с поверхности по белой линии протирают тампонами, смоченными 5%-ным раствором фенола. Стерильными ножницами вскрывают брюшную стенку и грудную клетку плода, содержимое грудной и брюшной полостей набирают пастеровскими пипетками и высевают в 1 пробирку с бульоном и 2 пробирки с агаром, а содержимое желудка - в 2 пробирки с бульоном и не менее 5 пробирок с агаром.

Из печени и селезенки вырезают кусочки размером не менее 2,0х1,5х2,5 см, увлажняют их спиртом, обжигают с поверхности и растирают в стерильной ступке с песком. Затем в ступку добавляют равное количество стерильного физиологического раствора и вновь растирают. Полученную взвесь пастеровской пипеткой по 0,1-0,2 мл высевают на поверхность предварительно подсушенных плотных сред (в пробирках или чашках). Допускается высев материала пастеровской пипеткой из органов (место прокола органа предварительно прижигают раскаленным шпателем). Из каждого органа делают посев на 1 пробирку с бульоном и 2 пробирки с агаром.

Если в лабораторию доставлен только желудок плода, высев проводят не менее чем на 10 пробирок агара.

При поступлении нескольких плодов от одного животного посевы делают из органов и тканей каждого плода отдельно.

Из плодовых оболочек и плаценты вырезают кусочки тканей с утолщенными ворсинками и стенками, наличием на поверхности фибрина или гнойного экссудата (выбирают менее загрязненные участки без некротических изменений).

Для уничтожения посторонней микрофлоры кусочки плаценты помещают в чашку Петри и заливают 3%-ным раствором гидроокиси калия на 30 мин. Затем их обмывают стерильным физиологическим раствором, готовят из этого материала суспензию в ступке со стерильным песком и делают посев пастеровской пипеткой на чашки со средой, содержащей бактериостатические препараты: генцианвиолет 1:200000 (0,1 мл 0,5%-го спиртоводного раствора на 100 мл среды) или кристаллвиолет 1:100000, генцианвиолет и малахитовую зелень в концентрации каждой краски 1:200000, уксуснокислый натрий из расчета 12,5 мг на 100 мл среды и др.

Содержимое бурс, гигром высевают на 3-4 чашки с плотной питательной средой, содержащей бактериостатические препараты.

Пробы молока центрифугируют 30 мин при 3000 об./мин. Верхний слой (сливки) и осадок набирают в пастеровскую пипетку и по 0,1-0,2 мл вносят на 3-4 чашки с агаром, содержащим бактериостатические препараты. Молоко, консервированное генцианвиолетом или другими консервантами, высевают на среды без бактериостатических веществ.

3.4.3. Для выращивания культур посевы помещают в термостат при 37-38 °С.

При исследовании материала от крупного рогатого скота половину засеянных пробирок и чашек культивируют в обычных условиях, другую - в атмосфере с повышенным содержанием углекислого газа (10-15%) в -инкубаторе или эксикаторе (микроанаэростате). Аналогичные условия можно создать в пробирках, закрытых резиновыми пробками или залитых парафином.

Перед парафинированием пробирки закрывают ватными пробками, пронося последние над пламенем горелки. Затем верхнюю часть пробки обрезают, а оставшуюся часть углубляют на 0,5-1,0 см внутрь пробирки и заливают расплавленным парафином.

Необходимое содержание углекислого газа в эксикаторе можно получить путем:

- заполнения части объема углекислым газом из баллона или аппарата Киппа;

- внесения бикарбоната натрия и серной или соляной кислоты (0,48 г бикарбоната натрия и 5 мл 25%-го раствора кислоты или 0,4 г бикарбоната натрия и 0,35 мл концентрированной соляной кислоты на 1 л объема);

- сжигания ваты, смоченной спиртом. При этом пробирки и чашки с посевами должны занимать не более половины объема эксикатора. Для определения концентрации углекислого газа в эксикаторе можно использовать химический метод (см. Прил. N 1, п.3).

3.4.4. Посевы выдерживают в термостате при 37-38 °С в течение 30 сут. Первичный осмотр посевов проводят через 24-48 ч. Пробирки с агаром и бульоном, заросшие посторонней микрофлорой, обезвреживают путем автоклавирования при 1,5 атм. в течение 1 ч.

В дальнейшем для обнаружения роста бруцелл посевы просматривают каждые 3-4 сут визуально, при необходимости через лупу или малом увеличении микроскопа. При отсутствии роста часть поверхности агара орошают посевным материалом.

При значительном росте посторонней микрофлоры (80% и более засеянных пробирок) бактериологическое исследование прекращают.

При просмотре посевов обращают внимание на характер роста микробов. На поверхности агара бруцеллы образуют мелкие, блестящие, выпуклые, с ровными краями и гладкой поверхностью просвечивающиеся колонии, имеющие в отраженном свете голубоватый оттенок, в падающем свете - сероватый. С возрастом колонии мутнеют и приобретают более темную окраску, что связано с появлением пигмента.

В бульоне бруцеллы образуют равномерное помутнение и пристеночное кольцо, возвышающееся над уровнем бульона, а в дальнейшем небольшой осадок на дне пробирки. В отраженном свете пристеночное кольцо имеет голубоватый оттенок.

При обнаружении роста на жидких средах и отсутствии характерного роста на агаре из каждой пробирки готовят мазки, которые окрашивают одним из специальных методов, и делают пересев на чашки с плотной средой для выделения чистой культуры. Пересевы на чашках культивируют так же, как и высевы из патологического материала.

Выделенные культуры идентифицируют по тинкториальным (окраска мазков по Граму и одним из специальных методов - по Стампу, Козловскому или Шуляку-Шину), морфологическим, культуральным свойствам и в реакции агглютинации на стекле с использованием набора компонентов для серологической дифференциации бруцелл.

Для постановки пластинчатой реакции агглютинации на стекле необходимы следующие компоненты: испытуемая культура, набор для серологической дифференциации бруцелл (выпускается биопредприятием), 0,5%-ный фенолизированный физиологический раствор рН 7,0-7,2.

Бруцеллез – хронически протекающая болезнь животных и человека, вызываемая бактериями, объединёнными под общим названием Brucella. По классификации (2015 г.) Объединенного Комитета экспертов ФАО/ВОЗ по бруцеллезу род Brucеlla состоит из 11 видов, которые подразделяются на ряд биоваров: Brucella melitensis (мальтийская), Brucella abortus (Brucella bovis, бычья), Brucella suis (свиная) и Brucella canis (собачья).

Бруцеллез различных видов встречается на всех континентах, включая и Антарктиду. К бруцеллезу восприимчивы 60 видов позвоночных животных, 30 видов кровососущих клещей, двух блох, двух видов комаров, а также домовые мухи, рептилии, амфибии, дельфины, киты, каланы и рыбы.

Важным звеном в ликвидации бруцеллеза животных является своевременная диагностика. Диагноз бруцеллез устанавливают на основании результатов бактериологического, серологического, молекулярно-генетического и аллергического исследований с учетом эпизоотических данных, а также клинических и патологоанатомических признаков болезни.

Наиболее информативный метод прижизненной диагностики бруцеллеза является серологический метод, основанный на иммунологических реакциях, в основе которых лежат специфические взаимосвязи между антителом и антигеном.

Через неделю после развития заболевания в крови появляются иммуноглобулины класса М (IgM), концентрация которых достигает максимального значения в течение первых нескольких недель, а затем постепенно снижается (острая фаза заболевания), и на 2-3 неделе образуются сывороточные IgG и немногим позже – IgA. Для хронического бруцеллеза характерно отсутствие специфического IgM, в крови возможно циркуляция IgA и IgG или одного из них.

В настоящее время в РФ применяются 14 диагностических (серологических) тестов на бруцеллез (РА, РСК, РНГА, РИД с О-ПС антигеном, РБП, КР с молоком, ИФА и др.). Часто практические специалисты задают вопросы, почему такое количество серологических реакций и нельзя ли меньшим количеством реакций получить максимальный достоверный результат?

В связи с тем, что бруцеллез протекает своеобразно почти у каждого в отдельности взятого животного, в зависимости от возраста, пола, беременности, физиологического состояния, вирулентности возбудителя и др., то в одном и том же неблагополучном стаде при возникновении инфекции наблюдаются индивидуумы, резко отличающие по времени и напряжению продукции антител. Поэтому показания одной и той же реакции выраженно колеблются в зависимости от давности течения болезни и степени ее патологического проявления. Так, недавно инфицированные животные реагируют в РА в большем проценте, чем длительно болеющие. Истощенные животные могут не реагировать, либо реагировать очень слабо по всем реакциям.

Поэтому считается общепризнанным, что при постановке двух, трех, четырех и более серологических реакций выявляется больных животных больше, чем при одной какой-либо реакции.

Однако, ориентировочный (требующий подтверждения) диагноз на бруцеллез у животных можно установить с помощью простых серологических тестов: роз бенгал пробы (РБП) и кольцевой реакции (КР) с молоком, не требующих лабораторных условий, выполняемых непосредственно на фермах.

Роз бегал проба (РБП)

По сравнению с другими методами серологической диагностики бруцеллеза РБП обладает следующими преимуществами: высокой чувствительностью, способностью в короткие сроки после заражения выявлять специфические бруцеллезные антитела (широкий набор классов и подклассов IgM, IgG, IgA) и благодаря кислой реакции антигена ингибировать проявления неспецифических антител, а также стабильностью показаний, технической простотой постановки, требующей небольшой затраты труда и времени, четкостью и быстротой получаемых результатов.

Сущность метода заключается в выявлении специфических антител в сыворотке крови животных, основанном на способности антител сыворотки агглютинировать бруцеллезный антиген, результатом чего является формирование выраженной агглютинации окрашенных бруцелл антигена в виде крупных или мелких хлопьев розового цвета.

РБП применяют как экспресс-метод диагностики бруцеллеза у не иммунизированного противобруцеллезными вакцинами крупного рогатого скота, яков, буйволов, зебу, коз, овец, лошадей, верблюдов, северных оленей (маралов), свиней и собак.

Перед постановкой реакции антиген и исследуемые сыворотки выдерживают 30-40 минут при комнатной температуре. Антиген тщательно встряхивают.

Реакцию проводят на чистых эмалированных пластинах или изразцовых плитках с лунками при температуре не ниже 18°С. Исследуемые сыворотки крови в дозе 0,03 мл вносят на дно лунки шприцом – полуавтоматом или микропипеткой. При исследовании сыворотки крови крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов в каждую лунку рядом с сывороткой при помощи пипетки для антигена или микропипетки вносят 0,03 мл (2 капли) антигена, а при исследовании сывороток крови овец, коз, северных оленей (маралов), свиней, собак - 0,015 мл (1 каплю) антигена. Затем антиген в каждой лунке тщательно смешивают с сывороткой активными движениями ручного смесителя до получения однородной жидкости, распределяя ее при этом по всей поверхности лунки. Пластинку с сыворотками и антигеном покачивают осторожными вращательными движениями или при помощи аппарата, предназначенного для этой цели. Реакцию учитывают невооруженным глазом в течение 4 минут после смешивания сыворотки с антигеном при слегка наклоненном положении пластинки. При положительной реакции в течение 4 минут появляются мелкие или крупные хлопья агглютината розового цвета. Агглютинацию, которая происходит позже 4 минут, не учитывают.

В начале работы ставят контроль антигена с негативной и позитивной бруцеллезной сыворотками в тех дозах, а также антигена на спонтанную агглютинацию (к 0,03 мл физиологического раствора добавляют 0,03 мл антигена).

Реакцию считают отрицательной при отсутствии агглютинации (смесь гомогенна равномерно окрашена).

В благополучных по бруцеллезу хозяйствах все сыворотки крови от животных, с которыми получена положительная РБП, в тот же день или на другой день исследуют в РА РСК (РДСК) или РА И РИД.

При получении положительных, отрицательных или сомнительных результатов в РА и РСК (РДСК) или РА и РИД их оценку проводят в соответствии с действующими санитарными и ветеринарными правилами.

Кольцевая реакция (КР) с молоком

Высокую оценку КР с молоком получила как в нашей стране, так и за рубежом. Все исследователи отмечают выраженную чувствительность, доступность и быстроту метода. С помощью этой реакции обследуют молочные фермы не менее 3-4 раз в год и рыночное молоко, при этом пробы молока отбирают прямо от коров при доении из бидонов любого объема.

Сущность реакции состоит в выявлении антигеном специфических антител в молоке больных бруцеллезом или иммунизированных агглютиногенными противобруцеллезными вакцинами коров. Положительная реакция проявляется в образовании синего кольца в верхнем слое сливок.

Комитет экспертов ФАО/ВОЗ по бруцеллезу (шестой доклад, 1986) считает, что в молоке, как и в сыворотке крови крупного рогатого скота, присутствуют в различных сочетаниях изотипы IgG_1, IgG₂ и IgA. Причем IgA, являющийся секреторным иммуноглобулином, в молоке находится в значительном большем количестве, чем в сыворотке крови и, следовательно, играет главную роль в кольцевой реакции.

Методика постановки КР с молоком достаточна проста. В пробирки (лучше Флоринского) вносят 2 см 3 молока пипеткой или дозатором. Антиген вносят по 0,1 см 3 в каждую пробирку с пробой молока. При исследовании каждой партии молока ставят контрольные пробы:

- молоко от здоровой коровы (буйволицы);

- смесь молока здоровой коровы (буйволицы) с бруцеллезной сывороткой (0,1 см 3 сыворотки на см 3 молока).

После внесения антигена пробирки встряхивают и выдерживают на водяной бане при температуре 37-38°С в течение 1 часа или в термостате в течение 2 часов.

Результаты реакции учитывают визуально через 30-40 минут после извлечения штативов из водяной бани (термостата) и оценивают в крестах по следующей схеме:

- (+++) три креста - четко выраженное синее кольцо в верхней части столбика молока в слое сливок, остальная часть молока остается белой;

- (++) два креста - четко выраженное синее кольцо в верхней части столбика молока в слое сливок, остальная часть молока имеет синеватый цвет;

- (+) один крест - синее кольцо в слое сливок выражено слабо и весь столбик молока имеет синий цвет;

- (-) минус - столбик молока остается равномерно окрашенным в первоначальный синий цвет, который был получен сразу после смешивания с антигеном, а слой сливок белого или слегка желтоватого цвета.

Все пробы молока с оценкой в (+++) три креста и (++) два креста считают положительными, (+) один крест - сомнительным.

При получении отрицательных результатов КР по всему стаду его считают благополучным по бруцеллезу.

Сыворотку крови животных стада, в котором выявлены особи, сомнительно или положительно реагирующие в КР с молоком, исследуют на бруцеллез в РБП или в РА и РСК (РДСК), или в РА и РИД, или в РНГА, или в ИФА. При этом проводят клинический осмотр животных и исключают их заболевание маститами.

При получении положительных результатов исследуемых сывороток крови на бруцеллез с животными стада поступают в соответствии с действующими санитарными и ветеринарными правилами.

Таким образом две серологические реакции: роз бенгал проба (РБП) и кольцевая реакция (КР) с молоком являются прижизненными предварительными экспресс - диагностическими тестами бруцеллеза животных в благополучных стадах. Эти серологические реакции просты в использовании и выполняются в полевых условиях.

Николай Иванович Зенов, д.в.н., советник директора по производству ФКП "Щелковский биокомбинат",

Марина Сергеевна Чумакова, ветеринарный врач, специалист по продвижению биопрепаратов ФКП "Щелковский биокомбинат"

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА

Animals. Laboratory diagnostics of brucellosis. Serological methods

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГБУ "ВГНКИ")

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 7 июня 2017 г. N 99-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Минэкономики Республики Армения

Госстандарт Республики Беларусь

Госстандарт Республики Казахстан

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 июня 2017 г. N 582-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34105-2017 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2018 г.

5 ВЗАМЕН ГОСТ 25385-91 в части серологических методов диагностики

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на все виды млекопитающих животных и устанавливает следующие методы серологической диагностики бруцеллеза:

- реакция агглютинации с S- и R-бруцеллезными антигенами;

- пластинчатая реакция агглютинации с антигеном, окрашенным бенгальской розовой (роз бенгал проба);

- реакция связывания комплемента;

- реакция длительного связывания комплемента на холоде;

- реакция непрямой гемагглютинации;

- реакция иммунодиффузии в геле агара с олигополисахаридным антигеном;

- реакция иммунодиффузии в геле агара с R-бруцеллезным антигеном;

- кольцевая реакция с молоком;

Примечание - Методы применимы ко всем видам бактерий рода Brucella.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.0.004-2015 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.4.011-89 Система стандартов безопасности труда. Средства защиты работающих. Общие требования и классификация

ГОСТ 1625-2016 Формалин технический. Технические условия

ГОСТ 2651-78 Натрия бихромат технический. Технические условия

ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия

ГОСТ 4220-75 Реактивы. Калий двухромовокислый. Технические условия

ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 5962-2013 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 16445-2012 Сыворотка гемолитическая для реакции связывания комплемента. Технические условия

ГОСТ 16446-2012 Комплемент сухой для реакции связывания комплемента. Технические условия

ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ 17206-96 Агар микробиологический. Технические условия

ГОСТ 18704-78 Кислота борная. Технические условия

ГОСТ 23519-93 Фенол синтетический технический. Технические условия

ГОСТ 25134-2013 Бруцеллин ВИЭВ. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 25794.1-83 Реактивы. Методы приготовления титрованных растворов для кислотно-основного титрования

ГОСТ 29230-91 (ИСО 835-4-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 4. Пипетки выдувные

ГОСТ 33675-2015 Животные. Лабораторная диагностика бруцеллеза. Бактериологические методы

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины, определения и сокращения

3.1 В настоящем стандарте применены термины с соответствующими определениями по ГОСТ 33675.

3.2 В настоящем стандарте применены следующие сокращения:

- РА - реакция агглютинации;

- РСК - реакция связывания комплемента;

- РБП - пластинчатая реакция агглютинации с бруцеллезным роз бенгал антигеном;

- РДСК - реакция длительного связывания комплемента;

- РИД - реакция иммунодиффузии;

- ЛПС - липополисахаридный антиген;

- О-ПС - олигополисахаридный антиген;

- РНГА - реакция непрямой гемагглютинации;

- КР с молоком - кольцевая реакция с молоком;

- ИФА - иммуноферментный анализ;

- ИХА - иммунохроматографический анализ;

- PKг-G - раствор конъюгата, конъюгированного с пероксидазой;

- ФСБ-Т - фосфатно-солевой буферный раствор с твином;

- РБР-С - разводящий буферный раствор для сывороток;

- К+ - инактивированная сыворотка крови животных, содержащая специфические антитела класса G к бактериям рода Brucella (положительный контрольный образец);

- К- - инактивированная сыворотка крови животных, не содержащая специфических антител к бактериям рода Brucella (отрицательный контрольный образец).

Возникновение и развитие бруцеллезного процесса, формирование его патогенетических фаз сопровождается иммунологической перестройкой организма. Феномены иммунологической перестройки при бруцеллезе послужили основанием для создания различных методов диагностики. Значение своевременной диагностики и сложность ее при бруцеллезе уже давно осознаны.

Наименее достоверным является клинический метод диагностики, т.к. клинические признаки болезни дают основание лишь подозревать у животных наличие бруцеллеза, ибо аналогичные симптомы заболевания могут появляться и при ряде других причин инфекционного и неинфекционного характера.

Наиболее точным методом диагностики является бактериологический- выделение культуры бруцелл от больного животного или из абортированного плода. Однако и в этом случае о точности можно говорить лишь при нахождении возбудителя; отрицательный же результат исследования еще не является убедительным доказательством отсутствии бруцеллеза. Кроме того, этим методом трудно провести массовую проверку скота.

Порядок исследования патологического материала:

1.Учет эпизоотологических данных (что не всегда удается).

2.Вскрытие плода для бактериологического исследования.

3.Посевы на питательные среды с последующим выделением чистой культуры. Часть посевов выращивают в атмосфере углекислого газа.

4.Микроскопия мазков, окрашенных по Грамму или Козловскому.

5.Биопроба. Заражение лабораторных животных, чаще морских свинок.

6.Микроскопия мазков из выделенных культур.

7.РА на стекле с выделенными культурами.

Работами многих исследователей подтверждена высокая специфичность и чувствительность аллергического метода диагностики бруцеллезной инфекции. Но есть недостаток. Аллергическая реакция появляется в более поздние периоды развития инфекции, а в борьбе с бруцеллезом имеет большое значение ранняя диагностика заболевания. Чем раньше будут выделены больные животные и, следовательно, чем раньше будут приняты соответствующие меры борьбы, тем большая гарантия быстро ликвидировать очаг инфекции.

Этому требованию более удовлетворительно отвечают серологические способы исследования в сравнении с методами бактериологической и аллергической диагностики.

Из серологических способов диагностики бруцеллеза наиболее широко применяется реакция агглютинации,предложенная в 1897 г. Райтом и Семплом. Под названием реакции Райта она вошла в широкую практику вследствие простоты постановки, легкости учета и большой диагностической ценности.

РА основана на специфическом взаимодействии сыворотки больного бруцеллезом животного с бруцеллезным антигеном. Эта реакция зависит от наличия в сыворотках крови специфических антител.

Сущность РА заключается в том, что при добавлении к исследуемой сыворотке антигена (взвеси гомологичных микробов) постепенно происходит скучивание микробов с образованием комочков, оседающих на дно пробирки в виде зонтика. Процесс агглютинации протекает в 2 фазы: в первой фазе микробы соединяются с агглютининами (специфическая фаза). Во 2-й фазе происходит скучивание микробов и выпадение их в осадок под влиянием электролитов, нарушающих равновесие этой взвеси (неспецифическая фаза). Этот осадок называется агглютинатом.

Пластинчатая реакция агглютинации с роз-бенгал антигеном (РБП).Антиген для РБП представляет собой суспензию бруцелл, окрашенных бенгальским розовым в розовый цвет. При соединении бруцелл с антителами образуются комочки красного цвета. Ставится реакция на эмалированных белых пластинках с луночками.

Кольцевая проба с молоком. В молоке также имеются агглютинины. К 2 мл. молока добавляют 1-2 капли антигена, окрашенного гемотоксилином в синий цвет. При наличии в молоке бруцеллезных антител окрашенный антиген соединяется с ними и с капельками жира. На поверхности молока образуется кольцо синего цвета, а толща молока белая. При отрицательной реакции молоко остается равномерно окрашенным.

Для диагностики бруцеллеза в практике широко применяется также реакция связывания комплемента (РСК).

Сущность РСК состоит в том, что при соединении антигена со специфическим антителом образуется комплексное вещество (антитело + антиген), обладающее способностью адсорбировать (связывать) на своей поверхности комплемент. РСК протекает в 2 фазы. Вначале соединяют испытуемую сыворотку с антигеном и вводят в эту систему оттитрованное количество комплемента (бактериолитическая система). Если взяты специфические компоненты, например, бруцеллезная сыворотка и бруцеллезный антиген, то произойдет их соединение и адсорбция комплемента. Следовательно, в системе не останется свободного комплемента, т.к. он целиком будет адсорбирован комплексом антиген + антитело. Если в сыворотке крови не имелось специфических антител, комплемент остается в системе в свободном состоянии. Это первая фаза реакции.

Чтобы узнать произошла ли адсорбция комплемента в первой фазе или он остался свободным, вводят в реакцию вторую, так называемую гемолитическую систему, всегда специфическую, состоящую из эритроцитов барана (антиген) и специфической гемолитической сыворотки (антитело). Это вторая фаза.

Гемолитическая сыворотка обладает способностью разрушать, лизировать эритроциты барана в присутствии свободного комплемента. Поэтому вторая фаза является индикатором процессов, происходящих в первой фазе реакции.

Если в первой фазе реакции были соединены неспецифические компоненты и не наступило адсорбции комплемента, то свободный комплемент присоединится к гемолитической системе, произойдет лизис эритроцитов. Это будет указывать на отрицательный результат реакции в первой фазе.

Наоборот, если в первой фазе будут взяты специфические компоненты, то произойдет их соединение и одновременно адсорбция комплемента. Тогда, в силу отсутствия свободного комплемента во второй фазе реакции, лизис эритроцитов не наступит. Реакция положительная.

С 2006 г. для диагностики бруцеллеза утверждена реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). Сущность. На эритроциты адсорбируется бруцеллезный антиген и этот эритроцитарный диагностикум добавляется к разведениям сыворотки. Если в сыворотке крови есть бруцеллезные антитела, то происходит агглютинация, выпадает осадок в виде зонтика. Если реакция отрицательная, то эритроциты осядут на дно в виде пуговки.

С 80-х годов 20-го столетия в стране появилось много работ, посвященных, разработке иммуноферментного анализа (ИФА) для диагностики бруцеллеза. Принцип метода. Как и все иммунологические методы ИФА базируется на реакции взаимодействия антитела с антигеном. ИФА основан на выявлении комплекса антиген-антитело, образуемого адсорбированным на поверхности лунок полистироловых планшетов для иммунологических реакций антигеном с находящимся в испытуемом материале (сыворотках) специфическими антителами. Образованный комплекс вступает в реакцию с меченым пероксидазой иммуноглобулином антивидовой гипериммунной сыворотки.

Образовавшийся специфический комплекс выявляют посредствам добавления субстратной смеси, включающей в себя субстрат пероксидазы – перекись водорода и вещество, которое окисляясь, дает окрашенный продукт. Величина оптической плотности продукта ферментативной реакции пропорциональна содержанию антител в испытуемом материале.

Регистрацию и учет реакции проводят визуально или спектрофотометрически.

В 2003 году в ветеринарную практику был принят метод молекулярно-генетической диагностики бруцеллеза – полимеразная цепная реакция (ПЦР). ПЦР предназначена для выявления ДНК бактерий рода Brucella (B. melitensis, B. abortus, B. suis, B. ovis, B. canis) в биологическом материале от животных, не иммунизированных противобруцеллезными вакцинами, в случае аборта или проявления у них других признаков (бурситы, гигромы, орхиты, эпидидимиты), вызывающих подозрение на бруцеллез и (или) при получении положительных и сомнительных результатов серологического исследования.

ПЦР-анализ состоит из 3-х этапов: 1. Выделение ДНК из исследуемого материала. 2. Собственно ПЦР – амплификация специфического участка ДНК бруцелл. 3. Электрофоретический анализ продуктов ПЦР и учет результатов ПЦР-анализа.

Диагностика бруцеллеза осложняется еще тем, что от животных, отрицательно реагирующих со стандартными антигенами из типичных S-форм бруцелл, выделяются атипичные диссоциированные штаммы в R-форме. В этих случаях для успешной ликвидации бруцеллеза необходимо применять такой антиген, который разработан, апробирован и внедрен бруцеллезный R-антиген ВНИВИ, который улавливает только R-антитела. Применяется для дифференциальной диагностики бруцеллеза в стадах, где животных прививают вакциной из штамма 82.

УКАЗАНИЯ
ПО ДИАГНОСТИКЕ БРУЦЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ

Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР 30 декабря 1982 г. N 115-6a

1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

1.1. Бруцеллез - инфекционная, хронически протекающая болезнь животных.

Возбудитель - бактерии из рода бруцелла, в который входят шесть самостоятельных видов: мелитензис (козье-овечий), абортус (крупного рогатого скота), суис (свиней), овис (бараний), канис (собачий) и неотома (кустарниковых крыс).

Микроорганизмы первых трех видов вызывают бруцеллез; бруцеллы вида овис - заболевание, называемое инфекционным эпидидимитом баранов (ИЭ).

1.2. Диагноз на бруцеллез у животных ставят на основании результатов бактериологических, серологических и аллергических исследований с учетом эпизоотологических данных и клинических признаков болезни, руководствуясь при этом Инструкцией о мероприятиях по профилактике и ликвидации бруцеллеза животных.

1.2.1. При установлении диагноза на бруцеллез необходимо учитывать следующее:

различные виды возбудителя являются патогенными, в основном, для животных соответствующего вида, однако бруцеллы видов мелитензис и абортус могут мигрировать и на животных других видов;

клинические признаки бруцеллеза у животных не характерны. Наиболее частое клиническое проявление болезни у маточного поголовья - аборт, у свиноматок наблюдается мумификация плодов. При абортах отмечается утолщение плодовых оболочек, образование на них фибринозных или гнойных хлопьев. Бруцеллез нередко сопровождается поражением суставов (артриты), синовиальной системы (тендовагиниты, бурситы), половой системы (у самок - эндометрит, вагинит, у самцов - орхит, эпидидимит);

патологоанатомическая картина при бруцеллезе не имеет характерных особенностей, позволяющих использовать их для диагностики этой болезни. Только у свиней на слизистой оболочке матки иногда находят желтовато-гнойные или казеозные узелки величиной с просяное зерно (так называемый "миллиарный бруцеллез матки").

1.2.2. У баранов, больных инфекционным эпидидимитом, в семенниках и придатках обнаруживают воспалительно-некротические или гнойные очаги различной величины; отмечают заполнение полости мошонки серозно-гнойным транссудатом, разрастание фиброзной ткани, сращение придатка с семенником и общей влагалищной оболочкой, иногда атрофию семенника.

1.3. Диагностика бруцеллеза включает лабораторные (бактериологическое и серологическое) исследования материала и аллергические исследования животных в хозяйствах.

Плановые серологические и аллергические исследования являются основными методами выявления больных и подозрительных по заболеванию животных.

Бактериологическую диагностику проводят в случае аборта или при появлении у животных других признаков (бурситы, гигромы, орхиты, эпидидимиты и проч.), вызывающих подозрение на данное заболевание. Одновременно проводят серологическое исследование сывороток крови этих животных.

1.4. При отборе проб крови, молока и патологического материала, а также при проведении лабораторных исследований необходимо соблюдать меры, предупреждающие заражение людей и обсеменение объектов внешней среды, руководствуясь при этом действующими правилами и инструкциями по данному вопросу.

2. ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА ОТ ЖИВОТНЫХ И ПЕРЕСЫЛКА ЕГО ДЛЯ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Материал для лабораторных исследований отбирают от каждого животного в отдельности.

2.2. На бактериологическое исследование на бруцеллез в лабораторию направляют абортированный плод с плодовыми оболочками (от свиноматок берут не менее 3 плодов) или желудок плода с содержимым (желудок перевязывают со стороны пищевода и со стороны двенадцатиперстной кишки), а также кусочки печени и селезенки.

При взятии содержимого гигром, бурс в области поражения выстригают шерсть, кожный покров дезинфицируют 70-градусным спиртом и смазывают настойкой йода. Затем стерильным шприцем с иглой большого диаметра делают пункцию, отсасывают содержимое гигромы (бурсы) и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой.

Перед взятием проб молока у коров вымя обмывают теплой водой, соски обрабатывают 70-градусным спиртом. Для исследования из каждой доли вымени берут последние порции молока в количестве 10-15 мл в отдельные стерильные пробирки с резиновыми пробками.

У овец и коз пробы молока берут путем пункции цистерны вымени. Для этого животное фиксируют в боковом положении, вымя у основания соска протирают 70-градусным спиртом и смазывают настойкой йода. Стерильным шприцем с иглой делают пункцию у основания соска и после попадания иглы в цистерну (о чем судят по свободному движению конца иглы) набирают в шприц молоко и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой.

Молоко должно быть доставлено в лабораторию и исследовано в день взятия пробы. Если это невозможно, молоко консервируют сухой борной кислотой (0,1 г на 10 мл) или генцианвиолетом (0,4 мл 1-процентного спиртово-водного раствора краски на 10 мл молока). Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 10 дней.

2.2.1. Для исследования на инфекционный эпидидимит в лабораторию направляют: от баранов - семенники с придатками; от овцематок - абортированные плоды с плодовыми оболочками, выделения из половых путей, взятые в первые 5 дней после аборта.

2.2.2. Отобранные для бактериологического исследования пробы упаковывают в целлофан или пергаментную бумагу, помещают в непроницаемую тару (ящик, банка, полиэтиленовый пакет) и в тот же день направляют в лабораторию. От абортировавшего животного одновременно с патологическим материалом направляют кровь на серологическое исследование на бруцеллез.

Если в течение 24-30 часов взятый материал доставить в лабораторию не представляется возможным, его консервируют стерильным 30-процентным водным раствором химически чистого глицерина.

Материал заливают консервирующей жидкостью в количестве, превышающем его объем в 4-5 раз. Крупные плоды направляют в неконсервированном виде.

2.3. На серологическое исследование в лабораторию направляют кровь (или сыворотку крови) и молоко.

2.3.1. Кровь у животных берут из яремной вены (у свиней - из ушной или хвостовой, у лисиц и песцов - из бедренной вены, у норок - путем отсечения подушечки среднего пальца задней лапы или кончика хвоста) в стерильные пробирки по 5-7 мл (от пушных зверей по 1-2 мл). Пробирки нумеруют и составляют опись проб.

Сыворотку крови получают методом отстоя. Для свертывания крови и отстаивания сыворотки пробирки с кровью выдерживают 30-60 мин при 20-30 °С, сгусток крови от стенок отделяют стальной спицей, а затем пробирки выдерживают при 4-10 °С. Через 20-24 часа отстоявшуюся сыворотку сливают в сухие стерильные пробирки (лучше в пробирки Флоринского) и направляют на исследование в лабораторию в свежем или консервированном виде.

Консервирование сывороток проводят:

добавлением 0,05 мл (1 капля) 5-процентного раствора фенола на каждый миллилитр сыворотки при постоянном перемешивании;

сухой борной кислотой (2-4% к объему сыворотки) до получения насыщенного раствора и образования на дне пробирки небольшого осадка кристаллов;

путем однократного замораживания.

Неконсервированная сыворотка пригодна для исследования в течение 6 дней со дня взятия крови с сохранением ее при 4-8 °С.

Сыворотки, консервированные фенолом или борной кислотой, пригодны для исследования в течение 30 дней; замороженные сыворотки - в течение 3 дней после однократного оттаивания.

Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки исследованию на бруцеллез не подлежат.

2.3.2. Для исследования на бруцеллез в кольцевой реакции пробу (10-15 мл) цельного свежего молока берут из одного удоя от коровы (буйволицы) в стерильную пробирку. Пробы молока на рынках берут из каждой отдельной посуды (бидон, фляга и проч.) после тщательного его перемешивания. Пробирки нумеруют и составляют опись проб.

При направлении молока на исследование в лабораторию каждую пробу консервируют добавлением одной капли 10-процентного раствора формалина на 5-10 мл молока. Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 2-3 суток. Перед исследованием его необходимо тщательно перемешать для равномерного распределения сливок.

При массовом исследовании молока работу по отбору проб и постановке кольцевой реакции следует проводить непосредственно на ферме в специально отведенном помещении.

Не разрешается исследовать в кольцевой реакции молоко от коров (буйволиц), страдающих маститом или болезнями, сопровождающимися повышением температуры тела, а также молоко животных в первые 2 недели после родов.

2.4. На направляемый в лабораторию материал заполняют сопроводительный документ установленной формы.

3. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА

3.1. Бактериологическую диагностику бруцеллеза проводят в случае аборта или при появлении у животных других признаков (бурситы, гигромы, орхиты, эпидидимиты и проч.), вызывающих подозрение на данное заболевание.

3.2. Бруцеллы обнаруживают тремя методами: бактериоскопией мазков из патологического материала, выделением культуры бруцелл на питательных средах и, при необходимости, путем постановки биологической пробы на морских свинках.

3.3. Бактериоскопическое исследование.

Из доставленного на исследование патологического материала делают по 2 мазка из каждого объекта. При исследовании абортированных плодов мазки готовят из содержимого желудка, жидкости брюшной и грудной полостей, печени, селезенки, а также котиледонов плодовых оболочек. Из паренхиматозных органов, котиледонов и другого плотного материала делают мазки-отпечатки, жидкий материал наносят на предметные стекла пипеткой.

Мазки, фиксированные на пламени, окрашивают по Граму и одному из следующих специальных методов: по Стампу (модифицированный метод Циль-Нильсена), Козловскому или Шуляку-Шин (см. Приложение N 1, п.1). При микроскопии мазков учитывают, что бруцеллы - мелкие, грамотрицательные, расположенные отдельно, попарно или кучно кокко-бактерии, окрашивающиеся по Стампу, Козловскому или Шуляку-Шин в красный цвет.

3.4. Бактериологическое исследование.

3.4.1. Для культивирования бруцелл используют мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ), печеночно-глюкозно-глицериновый бульон (ПГГБ), мясо-пептонный печеночно-глюкозно-глицериновый агар (МППГГА), печеночно-глюкозно-глицериновый агар (ПГГА), картофельный агар, эритрит-агар или сывороточно-декстрозный агар (см. Приложение N 1, п.2).

Культивирование возбудителя инфекционного эпидидимита баранов (бруцелла овис) проводят на плотных или полужидких печеночно-сывороточном или печеночно-аминопептидном агарах, а также на сывороточно-декстрозном агаре (см. Приложение N 1, п.2).

3.4.2. Перед посевом материала кожу абортированного плода с поверхности по белой линии протирают тампонами, смоченными 5-процентным раствором фенола. Стерильными ножницами вскрывают брюшную стенку и грудную клетку плода, содержимое грудной и брюшной полостей набирают пастеровскими пипетками и высевают в 1 пробирку с бульоном и 2 пробирки с агаром, а содержимое желудка - в 2 пробирки с бульоном и не менее 5 пробирок с агаром.

Из печенки и селезенки вырезают кусочки размером не менее 2,0х1,5х2,5 см, увлажняют их спиртом, обжигают с поверхности и растирают в стерильной ступке с песком. Затем в ступку добавляют равное количество стерильного физиологического раствора и вновь растирают. Полученную взвесь пастеровской пипеткой по 0,1-0,2 мл высевают на поверхность предварительно подсушенных плотных сред (в пробирках или чашках). Допускается высев материала пастеровской пипеткой непосредственно из органов (место прокола органа предварительно прижигают раскаленным шпателем). Из каждого органа делают посев на 1 пробирку с бульоном и 2 пробирки с агаром.

Если в лабораторию доставлен только желудок плода, высев проводят не менее чем на 10 пробирок агара.

Из плодовой оболочки, плаценты вырезают кусочки тканей с утолщенными ворсинками и стенками, наличием на поверхности фибрина или гнойного экссудата (выбирают менее загрязненные участки без некротических изменений). Для уничтожения посторонней микрофлоры кусочки плаценты помещают в чашку Петри и заливают 3-процентным раствором гидроокиси калия на 30 минут. Затем их обмывают стерильным физиологическим раствором, готовят из этого материала суспензию в ступке со стерильным песком и делают посев пастеровской пипеткой на чашки со средой, содержащей бактериостатические препараты: генцианвиолет 1:200000 (0,1 мл 0,5-процентного спиртового раствора на 100 мл среды) или кристаллвиолет 1:100000, генцианвиолет и малахитовую зелень в концентрации каждой краски 1:200000, уксуснокислый натрий из расчета 0,125 мг на 1 мл среды.

Пробы молока центрифугируют 30 минут при 3000 оборотов в минуту. Верхний слой (сливки) и осадок набирают в пастеровскую пипетку и по 0,1-0,2 мл вносят на 3-4 чашки с агаром, содержащим бактериостатические препараты. Молоко, консервированное генцианвиолетом, высевают на среды без бактериостатических веществ.

3.4.3. Для выращивания культур посевы помещают в термостат при 37-38 °С.

При исследовании материала от крупного рогатого скота половину засеянных пробирок и чашек инкубируют в атмосфере с повышенным содержанием углекислого газа (10-15%), другую - в обычных атмосферных условиях.

Для выделения возбудителя инфекционного эпидидимита баранов (бруцелла овис) все посевы инкубируют в атмосфере, содержащей 10-15% углекислого газа.

Для создания атмосферы с повышенным содержанием углекислого газа засеянные пробирки заливают парафином или помещают в эксикатор (микроанаэростат).

Перед парафинированием пробирки закрывают горящими ватными пробками, пронося последние над пламенем горелки. Затем верхнюю часть пробки обрезают, а оставшуюся часть углубляют на 0,5-1 см внутрь пробирки и заливают расплавленным парафином.

Необходимое содержание углекислого газа в эксикаторе можно получить путем:

заполнения части объема углекислым газом из баллона или аппарата Киппа;

внесения бикарбоната натрия и серной или соляной кислоты (0,48 г бикарбоната натрия и 5 мл 25-процентного раствора серной кислоты или 0,4 г бикарбоната натрия и 0,35 мл концентрированной соляной кислоты на 1 л объема);

сжигания ваты, смоченной спиртом. При этом пробирки и чашки с посевами должны занимать не более половины объема эксикатора.

Для определения концентрации углекислого газа в эксикаторе можно использовать химический метод (см. Приложение N 1, п.3).

В дальнейшем для обнаружения роста бруцелл посевы просматривают каждые 3-4 дня визуально, при необходимости через лупу или при малом увеличении микроскопа. При отсутствии роста часть поверхности агара орошают конденсационной жидкостью.

При просмотре посевов обращают внимание на характер роста микробов. На поверхности агара бруцеллы образуют мелкие, блестящие, выпуклые, с ровными краями и гладкой поверхностью просвечивающиеся колонии, имеющие в отраженном свете голубоватый оттенок, в падающем - сероватый. С возрастом колонии мутнеют и приобретают более темную окраску, что связано с появлением пигмента.

При обнаружении роста на жидких средах и отсутствии характерного роста на агаре из каждой пробирки готовят мазки, которые окрашивают одним из специальных методов и делают пересев на чашку с плотной средой для выделения чистой культуры. Пересевы на чашках культивируют так же, как и высевы из патологического материала.

Выделенные культуры идентифицируют по тинкториальным (окраска мазков по Граму и одним из специальных методов), морфологическим, культуральным свойствам и в реакции агглютинации на стекле с позитивной бруцеллезной сывороткой.

Читайте также: