Контроль питательных сред на холеру

Обновлено: 27.03.2024

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Лабораторная диагностика холеры

Дата введения 2002-04-01

1. РАЗРАБОТАНЫ сотрудниками Министерства здравоохранения Российской Федерации Ю.М.Федоровым, Н.Я.Жилиной; Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института Ю.М.Ломовым, Б.Н.Мишанькиным, Л.С.Подосинниковой, Л.Г.Воронежской, И.Я Черепахиной, Т.А.Кудряковой, Б.Л.Мазрухо, Л.М.Смоликовой, И.В.Рыжко, Р.И.Цураевой, Э.А.Москвитиной, Б.П.Голубевым; Противочумного Центра Минздрава России А.А.Кюрегяном, С.М.Ивановой, Ю.С.Королевым; Российского научно-исследовательского противочумного института "Микроб" А.К.Адамовым, З.В.Малыхиной, Т.В.Бугорковой, Н.И.Смирновой, Л.Ф.Ливановой; Иркутского научно-исследовательского противочумного института А.С.Марамовичем, В.С.Ганиным, Л.Я.Урбанович, В.И.Погореловым; Ставропольского научно-исследовательского противочумного института В.Н.Савельевым; Причерноморской противочумной станции Г.В.Гальцевой; Государственного Центра по антибиотикам С.В.Сидоренко; Российской медицинской академии последипломного образования Е.А.Ведьминой; ГИСК им.Л.А.Тарасевича Минздрава России Т.И.Анисимовой, Л.В.Саяпиной.

2. УТВЕРЖДЕНЫ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 15 января 2002 г.

3. ВВЕДЕНЫ ВЗАМЕН "Инструкции по организации и проведению противохолерных мероприятий" утв. МЗ и МП РФ от 09.06.95 N 01-19/50-11.

1. Область применения

1.1. Настоящие методические указания разработаны для внедрения и применения санитарно-эпидемиологических правил СП 3.1.1086-02 "Профилактика холеры. Общие требования к эпидемиологическому надзору" в части, касающейся организации и проведения лабораторной диагностики холеры.

1.2. Настоящие методические указания предназначены для специалистов бактериологических лабораторий центров госсанэпиднадзора, лечебно-профилактических и противочумных учреждений.

2. Нормативные ссылки

2.1. Санитарные правила по безопасности работ с микроорганизмами СП 1.2.006-93*. Ч.I: Порядок выдачи разрешения на работу с микроорганизмами I-IV групп патогенности и рекомбинантными молекулами ДНК.

2.2. Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности: СП 1.2.011-94*.

* На территории Российской Федерации действует СП 1.3.1285-03. Здесь и далее по тексту. - Примечание изготовителя базы данных.

2.3. Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности: СП 1.2.036-95.

2.4. Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами: СП 1.2.731-99.

2.7. Профилактика холеры. Организационные мероприятия. Оценка противоэпидемической готовности медицинских учреждений к проведению мероприятий на случай возникновения очага холеры: МУ 3.1.1096-02.

3. Характеристика возбудителя холеры

Холера - острая инфекционная болезнь из группы карантинных инфекций, с диарейным синдромом, фекально-оральным механизмом передачи возбудителя, водным, пищевым и контактно-бытовым путями распространения инфекции.

Холерные вибрионы относятся к виду V. cholerae, который включает как патогенные, способные вызывать заболевания, склонные к эпидемическому и пандемическому распространению, так и свободноживущие в воде вибрионы, безопасные для человека или обусловливающие спорадические случаи диарей и инфекций с внекишечной локализацией возбудителя. Известно около 200 О-серологических групп холерных вибрионов, из которых лишь холерные вибрионы О1 серогруппы до последнего десятилетия являлись возбудителями грозной инфекции. С 1993 г. по решению ВОЗ как холеру регистрируют заболевания, вызываемые холерными вибрионами О139 серогруппы. Таким образом, к настоящему времени известны три варианта возбудителя холеры: холерные вибрионы О1 серологической группы - классические и эльтор (варианты Огава, Инаба, Гикошима) и холерные вибрионы новой О139 серогруппы.

Наличие гена холерного токсина (ctx AB), независимо от его экспрессии, отличает токсигенные (эпидемические) от свободноживущих холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп; кроме того, в геноме токсигенных эпидемически значимых вариантов присутствует ряд генов, кодирующих синтез белка ТОХ Т, передающего сигналы запуска синтеза холерного токсина (СТ), токсинкорегулируемых пилей адгезии (TCP) и фактора колонизации (ACF). Известно, что свободноживущие атоксигенные холерные вибрионы О1 чрезвычайно редко имеют tcp ген в своей хромосоме.

Характеристика генома выделенных штаммов молекулярно-биологическими методами может быть использована для эпидемиологического анализа и решения вопросов заноса, распространения и укоренения инфекции.

Известно многообразие фенотипических изменений атоксигенных холерных вибрионов, выделенных на свободных от холеры территориях, а также распространение эпидемически значимых фагорезистентных вариантов холерных вибрионов и штаммов с множественной лекарственной устойчивостью.

4. Организация лабораторных исследований

Диагностические исследования на холеру в регламентированном объеме могут проводить:

- бактериологические лаборатории территориальных центров госсанэпиднадзора, лечебно-профилактических учреждений и ведомственных служб, имеющие разрешение на работу с микроорганизмами III группы патогенности;

- лаборатории особо опасных инфекций центров госсанэпиднадзора в субъектах федерации (республиканских, краевых, областных, городских), ведомственных учреждений, имеющие разрешение на проведение диагностических исследований на холеру;

- лаборатории противочумных учреждений, имеющие разрешение на проведение диагностических исследований на холеру и на работу с возбудителем холеры.

Организация и выполнение диагностических исследований на холеру в лабораториях должны осуществляться в соответствии с требованиями, регламентирующими:

- безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами - для бактериологических лабораторий центров госсанэпиднадзора, лечебно-профилактических учреждений и ведомственных служб;

- безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности - для лабораторий особо опасных инфекций центров госсанэпиднадзора ведомственных и противочумных учреждений;

- порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности.

Порядок получения лабораториями разрешения на работу с микроорганизмами I-IV групп патогенности определяется действующими нормативными документами о порядке выдачи разрешений на эти виды работ.

Все диагностические лаборатории, выполняющие работы с микроорганизмами I-IV групп патогенности, должны иметь лицензию на деятельность, связанную с использованием возбудителей инфекционных заболеваний.

В условиях осложнения эпидемиологической обстановки временное разрешение на проведение диагностических исследований на холеру бактериологическим лабораториям центров госсанэпиднадзора, включенным в состав лабораторной службы очага, в случае расширения их функциональных обязанностей, предоставляется решением медицинского штаба очага.

4.1. При осуществлении эпидемиологического надзора

4.1.1. Бактериологические лаборатории центров госсанэпиднадзора в городах и районах, учреждений лечебно-профилактических и ведомственных служб:

- проводят плановые диагностические исследования на холеру материала от больных острыми кишечными инфекциями, определенного контингента здоровых лиц и проб из объектов окружающей среды в объеме, предусмотренном для соответствующего типа территорий по эпидпроявлениям холеры. Исследования ведут до установления отрицательного результата анализа или до выделения культуры с характерным для вибрионов ростом на агаровой и полиуглеводной средах и положительной реакцией на оксидазу. Культуры проверяют на чистоту в мазке, окрашенном по Граму, на подвижность и в реакции агглютинации на стекле (далее слайд-агглютинации) с холерными сыворотками О1, Огава, Инаба, РО и О139.

При положительном результате слайд-агглютинации немедленно сообщают в территориальный центр госсанэпиднадзора, культуру для окончательной идентификации немедленно доставляют в специализированную лабораторию в установленном порядке.

При отрицательном результате слайд-агглютинации:

- культуру, выделенную от людей, направляют для дальнейшей идентификации в специализированную лабораторию;

- неагглютинирующиеся культуры, выделенные из объектов окружающей среды, идентифицируют на месте или по согласованию передают в территориальный центр госсанэпиднадзора.

4.1.2. Лаборатории особо опасных инфекций центров госсанэпиднадзора в республиках, краях, областях, городах и ведомственных учреждений:

- выполняют диагностическое исследование материала от больных и умерших с подозрением на холеру и проб из объектов окружающей среды;

- идентифицируют культуры вибрионов, выделенных в территориальных и ведомственных лабораториях, определяя их таксономическую принадлежность, а также определяют эпидемическую значимость (токсигенность) и антибиотикочувствительность холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп по регламентированным для лабораторий тестам;

- осуществляют (или организуют) бактериологический контроль качества питательных сред и других диагностических препаратов, используемых в территориальных лабораториях;

- представляют оперативную информацию о выделении культур холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп;

- в установленном порядке немедленно передают в территориальное противочумное учреждение культуры холерных вибрионов, таксономическая принадлежность или токсигенность которых имеющимися средствами диагностики не определяется;

- в течение 5 дней после окончания идентификации передают в территориальное противочумное учреждение или головной по проблеме "Холера" противочумный институт все культуры холерных вибрионов О1, О139, независимо от объекта обследования, и других серогрупп при выделении от больных;

- контролируют деятельность территориальных лабораторий, оказывают им методическую помощь по всем вопросам лабораторного обеспечения эпидемиологического надзора за холерой.

4.1.3. Лаборатории противочумных учреждений:

- проводят исследования материала от больных и умерших с подозрением на заболевание холерой, а также проб из объектов окружающей среды;

- подтверждают таксономическую принадлежность культур холерных вибрионов, выделенных на курируемой территории;

- идентифицируют все атипичные культуры холерных вибрионов с использованием дополнительных методов серологической, биохимической и других видов идентификации с целью уточнения таксономической принадлежности;

- определяют эпидемическую значимость (токсигенность) и антибиотикочувствительность культур;

- осуществляют методическое руководство по всем вопросам лабораторного обеспечения эпидемиологического надзора за холерой на курируемой территории;

- в установленном порядке передают с паспортами выделенные культуры холерных вибрионов в территориальный противочумный институт, в головной по проблеме "Холера" - Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт. Кроме того, паспорта на эти же культуры направляют в Противочумный центр Минздрава России.

Лабораторное обеспечение эпидемиологического надзора за холерой осуществляют в соответствии с планом противохолерных мероприятий, действующими нормативными и методическими документами. Профилактические исследования на холеру проводят в пределах рабочего дня с использованием соответствующих питательных сред, диагностические исследования материала от подозрительных на холеру больных (трупов) - в условиях круглосуточного режима работы лаборатории.

4.2. При проведении противоэпидемических мероприятий

Организация и регламентирование деятельности лабораторий, а также формирование лабораторной службы в очаге холеры осуществляется в соответствии с действующими методическими указаниями по вопросам профилактики холеры, организации мероприятий и оценки противоэпидемической готовности медицинских учреждений к проведению мероприятий на случай возникновения очага холеры.

5. Бактериологическое исследование

В системе противохолерных мероприятий значительное место занимает бактериологический анализ, от правильности и своевременности проведения которого зависит характер и объем профилактических и противоэпидемических мероприятий.

Исследования проводят с целью:

- выявления больных холерой и вибриононосителей;

- установления окончательного диагноза при вскрытии трупов лиц, умерших от подозрительного на холеру заболевания;

- обоснования выбора средств этиотропной терапии холеры;

- бактериологического контроля эффективности лечения больных холерой и вибриононосителей;

- бактериологического контроля объектов окружающей среды, в т.ч. поверхностных водоемов;

- бактериологического контроля эффективности обеззараживания в очаге инфекции.

5.1. Отбор и доставка материала на исследование

Материалом для бактериологического анализа могут служить испражнения, рвотные массы, желчь, трупный материал (отрезки тонкого кишечника и желчный пузырь); предметы, загрязненные испражнениями (постельное и нательное белье и др.); вода, ил, гидробионты, сточные воды, содержимое выгребных туалетов; смывы с объектов окружающей среды, пищевые продукты, мухи и др.

Материал от больного забирает медицинский персонал лечебного учреждения немедленно после выявления больного и до начала лечения антибиотиками. Руководитель несет ответственность за правильность отбора, хранения и доставки проб в лабораторию.

Необходимо учитывать высокую чувствительность холерных вибрионов к дезинфицирующим средствам и кислотам, возможность антагонистического действия сопутствующей микрофлоры и предполагаемую концентрацию возбудителя в исследуемом материале. Если в материале от больных алгидной формой холеры концентрация возбудителя достигает 10-10 м.к./мл, то в испражнениях больных легкой формой и леченных антибиотиками, реконвалесцентов и носителей количество холерных вибрионов обычно не превышает 10-10 м.к./г.

3.3.2. МЕДИЦИНСКИЕ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ

Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям
для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза

Дата введения: с момента утверждения

1. РАЗРАБОТАНЫ: Российским научно-исследовательским противочумным институтом "Микроб" (И.А.Дятлов, И.В.Шульгина, Т.Н.Донская, О.П.Плотников, Г.Ю.Куляш, А.К.Никифоров); Государственным научно-исследовательским институтом стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича (Л.В.Саяпина, Т.И.Анисимова); Ростовским научно-исследовательским противочумным институтом (Л.С.Подосинникова, Г.Д.Харабаджахян, Н.Р.Телесманич, А.Б.Мазрухо); Иркутским научно-исследовательским противочумным институтом (Э.С.Каретникова, О.Г.Татарникова).

2. РЕКОМЕНДОВАНЫ К УТВЕРЖДЕНИЮ Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол N 2 от 11.07.06).

3. УТВЕРЖДЕНЫ И ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 17 августа 2006 г.

4. ВВЕДЕНЫ ВЗАМЕН "Инструкции по бактериологическому контролю диагностических питательных сред для холерного вибриона" (утв. ГУКИ МЗ СССР 02.02.83), "Инструкции по бактериологическому контролю диагностических питательных сред для чумного микроба" (утв. ГУКИ МЗ СССР 07.09.83), "Инструкции по бактериологическому контролю диагностических питательных сред для туляремийного микроба" (утв. в Иркутском НИ противочумном институте Сибири и Дальнего Востока 08.10.82).

1. Область применения

Методические указания по контролю диагностических питательных сред по биологическим показателям предназначены для контроля питательных сред лабораторного и промышленного изготовления, используемых при диагностике особо опасных инфекций (ООИ), по биологическим показателям.

Настоящими методическими указаниями необходимо руководствоваться бактериологам лабораторий противочумных учреждений, отделов особо опасных инфекций центров гигиены и эпидемиологии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, специализированных лабораторий учреждений здравоохранения.

2. Нормативные ссылки

* Документ в информационных продуктах не содержится. За информацией о документе Вы можете обратиться в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

2.3. Положение о государственной регистрации сертификации и государственном контроле за качеством медицинских иммунобиологических препаратов в Российской Федерации: Постановление ГК СЭН от 03.07.94 N 5*.

* Документ в информационных продуктах не содержится. За информацией о документе Вы можете обратиться в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

2.5. Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами: СП 1.2.731-99.

2.6. Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности: СП 1.2.036-95.

2.7. Медицинские иммунобиологические препараты. Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов: СП 3.3.2.561-96.

3. Общие положения

3.1. Питательные среды по своему назначению подразделяются на диагностические и среды для выращивания биомассы при производстве различных медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП).

3.2. Диагностические среды включают: среды накопительные и для культивирования; для выделения конкретного возбудителя (элективные и селективные); дифференциальные (содержащие индикаторы, красители и т.д.); для идентификации, позволяющие по отдельным признакам (отношение к углеводам, мочевине, подвижности и т.п.) проводить идентификацию микроорганизмов.

3.3. Исследования по контролю качества питательных сред организуют и проводят в соответствии с санитарными правилами СП 1.3.1285-03 и СП 1.2.731-99.

4. Биологические показатели, применяемые для оценки питательных сред

4.1. Чувствительность определяют по максимальному разведению культуры, при котором на всех засеянных чашках (пробирках) наблюдается рост. По этому показателю оценивают диагностические среды для выделения и дифференциальные.

4.2. Показатель прорастания - по проценту выросших колоний микроорганизмов от числа засеянных клеток. По этому показателю оценивают питательные среды для культивирования.

4.3. Эффективность - по выходу микробных клеток с 1 мл питательной среды. По этому показателю контролируют питательные среды для культивирования и среды, используемые в производстве МИБП.

4.4. Показатель стабильности основных свойств микроорганизмов при выращивании на испытуемой среде - по отношению числа атипичных по морфологии, биохимическим, серологическим, фаголизабельным и другим свойствам колоний к числу выросших на агаровых пластинках колоний тест-штаммов. Определяют для всех сред.

4.5. Дифференцирующие свойства - по выраженности отличительных видовых и других признаков микроорганизмов определяют для сред дифференциальных и идентификации.

4.6. Показатель ингибиции - по степени подавляющего воздействия на постороннюю микрофлору; выражается количеством микробов-ассоциантов, которое не растет на среде или числом сформировавшихся колоний микробов-ассоциантов, не препятствующих выделению возбудителя. Контролируют среды для выделения, дифференциальные и для накопления.

4.7. Показатель скорости роста - по минимальному времени вырастания культуры, для диагностических сред.

5. Организация проведения контроля

Для лабораторной диагностики возбудителей особо опасных инфекций используют питательные среды, имеющие сертификат производства и лицензию на производство, хранение и распространение, или среды, приготовленные по рецептуре, изложенной в методических руководствах и нормативных документах.

5.1. Качество питательных сред проверяют противочумные учреждения, применяя тест-штаммы I-IV групп патогенности, предусмотренные для контроля конкретных питательных сред. Лаборатории отделов особо опасных инфекций проводят контроль питательных сред с использованием тест-штаммов III-IV групп патогенности.

5.2. Для лицензированных питательных сред бактериологическому контролю подлежит первая варка и по одной варке ежегодно от каждой серии, а также все варки серии при изменении условий ее хранения или приготовления.

5.3. Для нелицензированных питательных сред, приготовленных по утвержденной рецептуре, контролируют каждую варку.

5.4. На контроль направляют по 200 мл плотных и по 100 мл жидких питательных сред. На этикетке указывают предприятие-изготовитель, название питательной среды, номер серии, дату приготовления, срок годности. Упаковка должна исключать возможность боя посуды и загрязнение среды при транспортировании.

5.5. Ингибиторы (теллурит калия, генцианвиолет и др.), среды с ингибиторами и стимуляторами роста (гемолизированная кровь и др.) проверяют противочумные учреждения.

5.6. Препаратами сравнения (контроль) должны быть ранее проверенные качественные питательные среды (аналоги по назначению).

5.7. Срок годности готовых питательных сред определен в нормативной документации и инструкциях по применению каждой конкретной среды.

6. Проведение контроля и оценка качества питательных сред


6.1. Контроль питательных сред для выделения, культивирования
и идентификации возбудителя чумы

6.1.1. Тест-штаммы

Для бактериологического контроля питательных сред, предназначенных для культивирования и выделения возбудителя чумы, используют штаммы Yersinia pestis EV, Yersinia pestis P-1680 - Закавказского горного очага и Yersinia pestis И-2377 - Горно-Алтайского очага.

В качестве тест-штамма при контроле ингибиторов посторонней микрофлоры используют Escherichia coli 18, Bacillus cereus 8 и Proteus vulgaris HX 19 N 222. Тест-штаммы получают из ГИСК им. Л.А.Тарасовича через Государственную коллекцию патогенных бактерий "Микроб".

При бактериологическом контроле сред для идентификации чумного и псевдотуберкулезного микробов по признаку ферментации мочевины и углеводов (ЦДС) используют тест-штаммы Yersinia pestis EV и Yersinia pseudotuberculosis И-199, который получают из Иркутского НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока.

6.1.2. Порядок, хранения тест-штаммов

Пересевы культур проводят не менее 1 раза в 3 мес., но не более четырех раз. По истечении этого срока для работы вскрывают новую ампулу с культурой.

6.1.3. Требования к тест-штаммам

Тест-штаммы Y. pestis EV, Р-1680 и И-2377 должны обладать типичными культурально-морфологическими и биохимическими свойствами, лизироваться чумным бактериофагом Л-413С. По морфологии - должны быть грамотрицательными палочками, на агаре образовывать колонии R-формы, в бульоне - рыхлый осадок с прозрачной надосадочной жидкостью. Биохимические свойства - должны ферментировать глюкозу, маннит и мальтозу, штамм Y. pestis EV не должен разлагать глицерин и рамнозу; штаммы Р-1680 и И-2377 должны ферментировать рамнозу и глицерин. Штамм Y. pestis EV при температуре выращивания (28±1) °С нуждается в аминокислотах - фенилаланине, метионине, треонине и цистеине; Y. pestis И-2377 - в фенилаланине, цистеине, аргинине и лейцине; Y. pestis Р-1680 - в фенилаланине, метионине и тиамине (витамин В). При работе с тиаминзависимыми штаммами Р-1680 Закавказского горного очага в питательные среды следует добавлять витамин В (0,0001 мг на 100 мл среды) или среду 199 (3 мл на 100 мл среды).

Тест-штамм Y. pseudotuberculosis И-199 должен быть типичным по культурально-морфологическим и биохимическим свойствам, лизироваться псевдотуберкулезным бактериофагом. На агаровых средах при температуре (28±1) °С тест-штамм псевдотуберкулезного микроба растет в виде бугристых хромогенных колоний, в бульоне - равномерное помутнение; в мазках - грамотрицательные палочки. Тест-штамм должен ферментировать глюкозу, арабинозу, маннит, рамнозу, мочевину; не должен расщеплять лактозу, сахарозу; должен обладать подвижностью.

6.1.4. Подготовка тест-штаммов

Для посева на испытуемые среды используют культуры тест-штаммов не более 3-4 пассажей на питательных средах.

6.1.5. Определение показателя прорастания и чувствительности плотных
и жидких питательных сред и скорости роста на них возбудителя чумы

Контроль жидких сред. Культуру из разведении 10(1х10 м.к./мл) и 10(1х10 м.к./мл) вносят по 0,1 мл в 3 пробирки с 10 мл жидкой питательной среды. Контролем служит заранее отконтролированный бульон.

Контроль плотных сред. Культуру из разведения 10(1х10 м.к./мл) и 10(1х10 м.к./мл) наносят по 0,1 мл на 3 свежеприготовленные и хорошо подсушенные агаровые пластинки. Взвесь распределяют по поверхности агара покачиванием чашки Петри. Контролем должен служить заранее отконтролированный агар.

Учет результатов. Учет результатов проводят через 24 и 48 ч инкубации при температуре (28±1) °С. Жидкие питательные среды считают пригодными для использования в диагностических целях, если через 24 ч в бульоне появляется видимый рост культуры, а через 48 ч - интенсивный рост чумного микроба во всех пробирках при высеве 1х10 м.к. на 10 мл среды (разведение 10) и в одной из пробирок при посеве 1х10 м.к. на 10 мл среды (разведение 10).

Плотные питательные среды должны обеспечивать рост чумного микроба через 48 ч инкубации на всех агаровых пластинках при высеве 10 м.к., показатель прорастания при высеве 100 м.к. должен быть не менее 50%. Начальный рост чумного микроба ("кружевные платочки") должен быть через 24 ч инкубации; типичные колонии диаметром не менее 1 мм - через 48 ч. Морфология микробов - грамотрицательные биполярные полиморфные палочки.

6.1.6. Определение показателя эффективности

Жидкие питательные среды. Из суточной агаровой культуры Y. pestis EV готовят взвесь из разведений 10(1х10 м.к./мл) и 10(1х10 м.к./мл). По 1 мл взвеси из каждого разведения вносят в 3 пробирки с 10 мл жидкой испытуемой среды. Исходное число засеянных клеток чумного микроба в 1 мл среды будет составлять соответственно 1х10 и 1х10 м.к. Параллельно делают высев по 0,1 мл взвеси из разведения 10 на 3 агаровые пластинки в чашках Петри для определения числа жизнеспособных клеток в посевной дозе (). Через 48 ч инкубации посевов при температуре (28±1) °С из каждой пробирки производят высев по 0,1 мл на чашки с питательным агаром (). В случае обильного роста культуры в жидкой среде ее перед высевом на чашки разводят. Степень разведения учитывают при обсчете результатов. Прирост () числа микроорганизмов после инкубации посевов проводят по формуле (%):


2%-й раствор поваренной соли: 20 г хлорида натрия и 0,1 г едкого натрия растворяют в 1 л дистиллированной воды; жидкость пропускают через бумажный фильтр, разливают по 10 мл в пробирки и стерилизуют в автоклаве 20 мин. при 0,7 атм.

а) Основной раствор пептона готовят по следующей прописи:

Пептон сухой - 100,0

Натрия хлорид - 50,0

Калия нитрат - 10,0

Натрия карбонат - 25,0

Дистиллированная вода - 1 л

В холодную дистиллированную воду погружают пептон, хлорид и карбонат натрия. Смесь кипятят при постоянном помешивании до полного растворения пептона, не допуская его пригорания, затем добавляют нитрат калия. Проверяют реакцию среды, если нужно, рН доводят до 8,5 +/- 0,1. Раствор фильтруют через миткалевый или бумажный фильтр, разливают в посуду и стерилизуют в автоклаве 20 мин. при 1 атм.

Основной раствор пептона сохраняется до 2 лет.

б) 1%-я пептонная вода.

Для получения 1%-й пептонной воды концентрированный раствор разводят в 10 раз дистиллированной водой. После установления рН 8,5 +/- 0,1 разливают в пробирки или во флаконы и стерилизуют 20 мин. при давлении 0,7 атм.

Можно готовить 1%-ю пептонную воду и непосредственно из отдельных компонентов, взяв навески в 10 раз меньше указанных в рецепте основного пептона. Технология приготовления такая же, как и основного пептона.

в) Пептонная вода с теллуритом калия.

В 1%-ю пептонную воду (рН 8,5 +/- 0,1) после автоклавирования добавляют теллурит калия в конечном разведении 1:100000 или 1:200000. Предварительно готовят рабочий 0,1%-й раствор теллурита калия (1:1000). Срок хранения рабочих растворов 7 дней.

Плотные среды для выделения холерных вибрионов

Щелочной мясопептонный агар:

Мясная вода - 1 л

Натрия хлорид - 5,0

В мясную воду вносят пептон и хлорид натрия. Смесь перемешивают и подщелачивают 20%-м раствором едкого натра до рН 8,3 +/- 0,1. Затем добавляют агар-агар и содержимое помещают в автоклав для варки среды в начале текучим паром в течение 30 - 40 мин., а затем при 1 атм. 20 мин. Если мясопептонный агар варят на плите, среду кипятят до полного расплавления агар-агара при постоянном помешивании.

Для получения прозрачной агаровой среды ее после варки с целью отстоя на 2 - 3 ч оставляют в автоклаве или помещают в термостатную комнату при температуре (43 +/- 2) °С, лучше время отстоя продлить до 18 - 20 ч. Отстоявшийся агар осторожно, не взбалтывая, сливают с осадка на плотный ватно-марлевый фильтр. В фильтрате уточняют реакцию среды, если требуется, подкисляют ее, но подщелачивать агар на данном этапе не рекомендуется во избежание выпадения осадка при стерилизации готовой среды. Профильтрованный агар разливают в посуду и стерилизуют при 1,0 атм. 20 мин.

Рекомендуется использовать питательную среду для выделения холерных вибрионов элективно-дифференциальную сухую (СЭДХ).

Среда обладает выраженными элективными свойствами, обеспечивая ингибицию сопутствующей микрофлоры (энтеробактерий, протея, кокков и др.) и практически не влияет на рост вибрионов. Холерные вибрионы О1 и не О1 групп через 12 - 18 ч формируют на этих средах плоские прозрачные колонии желтого цвета за счет ферментации сахарозы диаметром 1,0 - 2,0 мм; V. parahaemolyticus - мелкие, голубоватые (цвета среды) с уплотненным центром; V. alqinolyticus - крупные, желтые; колонии Pseudomonas, Aeromonas - голубые, Enterobacteriaceae - очень мелкие, плотные или полупрозрачные, иногда окрашены в желтый цвет; колонии протея, как правило, не роятся.

Среды для идентификации вибрионов

а) Среды с углеводами для отбора колоний:

Натрия хлорид - 5,0

Индикатор Андреде - 40 мл

Вода дистиллированная - 1 л

Среду варят, фильтруют, разливают по 5 - 7 мл в стерильные пробирки и стерилизуют при давлении 0,5 атм. 20 мин. Готовую среду после стерилизации скашивают так, чтобы получить столбик и косяк. Среда светлая.

Среду можно готовить на 1,0 - 1,3%-м питательном агаре, добавляя к нему в соответствующих концентрациях углеводы и индикатор Андреде.

Готовится как и среда Ресселя, но вместо глюкозы берут сахарозу в том же количестве.

1,5 - 1,7%-й мясопептонный агар или другой

слабощелочной питательный агар - 1 л

2%-й раствор серно-кислого закисного железа - 10,0 мл

0,8%-й раствор тиосульфата натрия - 10,0 мл

0,4%-й раствор сульфата натрия - 10,0 мл

1%-й раствор фенолового красного - 24,0 мл

Вначале в расплавленном питательном агаре (рН 7,7 +/- 0,1) растворяют углеводы, затем к нему добавляют свежеприготовленные растворы железа и солей натрия согласно прописи среды (индикатор на сероводород). Кроме того, для регистрации кислотообразования добавляют индикатор феноловый красный. Среду варят, фильтруют, разливают по 5 - 7 мл в стерильные пробирки, стерилизуют 20 мин. при давлении 0,5 атм. и скашивают по типу среды Ресселя; рН готовой среды 7,3 +/- 0,1; цвет красный.

1,5%-й питательный агар - 1 л

Серно-кислое железо (FeSO4) - 0,2

Гипосульфит натрия (Na2SO3 х 5Н2О) - 0,08

Сульфит натрия (Na2SO3) - 0,4

0,2%-й феноловый красный - 10,0.

После расплавления рН среды довести до 8,0, разлить в пробирки по 5 - 7 мл и стерилизовать при 0,7 атм. 15 мин. Готовую среду после стерилизации скашивают так, чтобы получить столбик и косяк.

6) Среды для идентификации.

К 100 мл 1%-й пептонной воды (рН 7,3 +/- 0,1) без селитры добавляют 0,5 - 1,0% необходимого углевода или спирта (L-арабиноза, D-манноза, D-сахароза, D-маннит, L-инозит, D-глюкоза, растворимый крахмал и др.) и 1% индикатора Андреде или 0,1 мл 1,6%-го раствора бромтимолового синего. Среды разливают в стерильные пробирки с поплавками и стерилизуют при 0,5 атм. 20 мин.; среду с L-арабинозой следует стерилизовать в течение 20 мин. при 0,1 - 0,2 атм. Для приготовления сред Гисса можно применять только перечисленные изомеры углеводов. Готовые среды Гисса с индикатором Андреде светлые, при кислотообразовании краснеют. Среды с бромтимоловым синим зеленого цвета с травянистым оттенком, при кислой реакции - желтого цвета, при щелочной - синего.

Натрия хлорид - 5,0

Двузамещенный фосфат калия - 0,3

Бромтимоловый синий - 0,03

Дистиллированная вода - 1 л

К воде добавляют пептон, натрия хлорид и агар-агар. Смесь подогревают до расплавления агара, затем вносят фосфат калия и глюкозу, продолжают кипятить 2 - 3 мин. Смесь подщелачивают 20%-м раствором едкого натрия до рН 7,4 +/- 0,1, доводят объем среды до первоначального и добавляют 3 мл 1%-го водного раствора бромтимолового синего. Затем среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по 4 - 5 мл в стерильные пробирки и стерилизуют при давлении 0,5 атм. 20 мин. Цвет среды до стерилизации синий, а после автоклавирования травянисто-зеленый, рН 7,1 +/- 0,1. При кислой реакции среда желтеет.

Двузамещенный фосфат калия - 5,0

Дистиллированная вода - 1 л.

Смесь ингредиентов нагревают до полного их растворения, затем фильтруют через бумажный фильтр и разливают по 5 мл в стерильные пробирки. Бульон стерилизуют при давлении 0,5 атм. 20 мин.

Среда Кодама. В 1%-ю пептонную воду добавляют 0,5% растворимого крахмала. Среду разливают в стерильные пробирки и стерилизуют 20 мин. под давлением 0,5 атм. Для оценки результатов расщепления крахмала используют реактив Люголя.

Среда с желатиной. К мясопептонному бульону или бульону Хоттингера прибавляют мелко нарезанную желатину из расчета 10,0 - 15,0 г на 100 мл (летом концентрацию желатины увеличивают до 20%). Желатине дают набухать в течение 30 мин. и затем растворяют при медленном нагревании в водяной бане при температуре (45,0 +/- 5,0) °С. Устанавливают рН 7,1 +/- 0,1, прибавляя к расплавленной желатине 10%-й раствор двууглекислого натрия. При более щелочной реакции желатина застывает плохо, а иногда и совсем не застывает. В 1 л растворенной желатины вносят для просветления два взбитых с небольшим количеством дистиллированной воды яичных белка. Смесь перемешивают и прогревают текучим паром в течение 20 мин. до полного свертывания белка и просветления среды. Затем среду фильтруют в горячем состоянии через бумажный или ватно-марлевый фильтр с большой поверхностью. Среду, разлитую по 5 - 8 мл в пробирки, стерилизуют при давлении 0,5 атм. 20 мин. После стерилизации среду охлаждают путем погружения пробирок в холодную воду в строго вертикальном положении, чтобы верхняя часть столбика при застывании оставалась совершенно ровной.

Среда для определения декарбоксилаз и дигидролаз аминокислот

Дрожжевой экстракт - 25,0 (сухой 3,0)

Натрия хлорид - 5,0

Натрия карбонат - 0,1

(0,1%-й раствор в 20%-м спирте) - 45,0 (0,045 г сухого)

Аминокислота - 10,0 - 20,0

Дистиллированная вода - 1 л

Все ингредиенты по прописи вышеуказанной среды растворяют при нагревании, устанавливают рН 6,4 +/- 0,1, затем добавляют соответствующий индикатор и делят среду на 4 равные части. В одну часть аминокислоты не добавляют, эта порция служит контролем. В остальные порции вносят соответственно: в первую - 1% лизина, во вторую - 1% орнитина, в третью - 1% аргинина. Аминокислоты должны быть в L-форме, если имеются D-аминокислоты, то добавляют 2%, т.к. микроорганизмы активны только в отношении L-форм. После добавления аминокислот перед стерилизацией в случае необходимости реакцию среды исправляют 0,1%-м раствором соляной кислоты. Среду разливают по 1 - 2 мл в химически чистые стерильные пробирки и стерилизуют при давлении 0,1 - 0,2 атм. 20 мин. Небольшое количество флокулята в средах не имеет значения. Пептонно-дрожжевая среда имеет травянисто-зеленый цвет, при кислой реакции среда желтеет, при щелочной - синеет.

Мясопептонный бульон: мясная вода с 1% сухого пептона и 0,85% поваренной соли. Смесь кипятят до полного растворения пептона и соли, устанавливают нужную реакцию среды, стерилизуют при 0,7 атм. 20 мин.

а) Для определения образования индола

Парадиметиламинобензальдегид - 1,0 г

Этиловый спирт - 95,0 мл

Концентрированная соляная кислота - 20,0 мл.

Альдегид растворяют в спирте, затем добавляют кислоту, смешивают, хранят в темном месте.

Полоски фильтрованной бумаги пропитывают насыщенным раствором щавелевой кислоты и высушивают в термостате.

б) Для выявления образования сероводорода

Полоски фильтровальной бумаги пропитывают раствором уксусно-кислого свинца. Подсушивают на воздухе.

Полоски индикаторных бумажек на индол и сероводород помещают под пробку пробирки с засеянной культурой. В случае образования индола полоска краснеет, а при образовании сероводорода полоска чернеет.

в) Для определения нитратредуктазы

Готовят отдельно два раствора. Первый - путем растворения при нагревании в фарфоровой ступке в 20 мл дистиллированной воды 0,2 мг альфа-нафтиламина (C10H7NH2). Жидкость осторожно вливают в 150 мл 12%-го раствора уксусной кислоты. Второй - 0,5 г сульфаниловой кислоты (C6H4NH2SO3H) растворяют в 150 мл 12%-й уксусной кислоты.

Затем оба раствора сливают в темную склянку с хорошо притертой пробкой. Реактив Грисса должен быть бесцветным, если он розовеет, то им не пользуются.

Сложность приготовления реактива Грисса, дефицитность и токсичность входящих в него компонентов (в частности, альфа-нафтиламина) ограничивают возможности его применения. Этих недостатков лишен метод с использованием риванолового реактива, представляющего собой смесь равных объемов 0,1%-го раствора риванола в дистиллированной воде и 12%-го раствора соляной кислоты. В случае положительной реакции культура испытуемого штамма, выращенная в бульоне или 1%-й пептонной воде с 0,1%-м KNO3, окрашивается в красный цвет.

г) Для определения бета-галактозидазной активности приготавливают М/75 раствор орто-нитрафенил - бета-Д-галактопиранозида (ОНФГ):

Дистиллированная вода - 75 мл

Фосфатный буфер - 5 мл.

Растворяют в дистиллированной воде при 37 °С ОНФГ, затем добавляют раствор однозамещенного фосфорно-кислого натрия (NaH2PO4 х H2O). Доводят рН до 7,0. Раствор должен быть бесцветным - хранят при температуре -4 °С. Перед использованием раствор выдерживают в течение нескольких минут до растворения фосфата, который на холоде кристаллизируется.

а) Консервант с борной кислотой

Борная кислота - 40,0 г

0,9%-й раствор натрия хлорида - до 1 л.

Стерилизуют на водяной бане или текучим паром при 100 °С по 20 мин. в течение 3-х дней.

Соединяют 100 мл дефибринированной крови барана с 15 мл консерванта с борной кислотой.

б) Консервант Алсевера

Сахароза (или глюкоза) - 20,5

Хлористый натрий - 8,0

Цитрат натрия - 4,2

Дистиллированная вода - до 1,0 л.

рН - 6,1 доводится 10%-м раствором лимонной кислоты.

Стерилизуют на водяной бане или текучим паром при температуре 100 °С по 20 мин. в течение 3-х дней.

Консервант Алсевера и дефибринированную кровь соединяют поровну. Консервированную кровь хранят при температуре (4 +/- 1) °С.

Питательные среды, консерванты, ингибиторы посторонней микрофлоры, используемые в диагностике холеры, подлежат обязательной проверке в соответствии с действующими инструктивно-методическими документами.

Бактериологический контроль качества плотных и жидких питательных сред могут проводить лаборатории противочумных и других учреждений, имеющие разрешение на работу с возбудителем холеры, применяя для контроля тест-штаммы Vibrio cholerae Р-1 (145) и Vibrio cholerae eltor М-878, а также лаборатории особо опасных инфекций учреждений, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор, с использованием тест-штамма авирулентного холерного вибриона не О1 серогруппы Р-9741 в порядке, определяемом действующими методическими указаниями по контролю питательных сред.

Бактериологическому контролю подлежит каждая серия сухой среды производственного выпуска, имеющая номер государственной регистрации, лицензии на ее производство и соответствующий срок годности, а также среды лабораторного изготовления.

На контроль направляют часть общего объема среды, предназначенного для проведения исследований, в количестве 200 мл агара и 100 мл основного раствора пептона производственного выпуска и в двойном объеме для серий лабораторного изготовления. В направлении следует указать название среды, предприятие-изготовитель, номер серии и срок годности сухой среды, дату контролируемой варки. Транспортируемые образцы должны быть надежно упакованы, флаконы с жидкой средой закрыты резиновыми пробками.

Оптимальный срок проверки питательной среды 10 - 14 дней после приготовления.

При положительном результате контроля пробы соответствующая серия сухой среды считается пригодной к использованию. Последующий контроль этой серии среды осуществляется ежегодно, а также при изменении условий приготовления сухой среды, независимо от времени предыдущей проверки.

Если при первом контроле среда оказалась непригодной, необходим повторный бактериологический контроль этой же серии сухой среды, при этом на контроль необходимо направлять образец новой варки и навеску сухой среды этой же серии.

При получении отрицательного результата повторного контроля среды, приготовленной на месте, и положительного бактериологического контроля образца этой же серии сухой среды, сваренного в лаборатории контролирующего учреждения, следует считать пригодной данную серию сухой питательной среды и принять меры к выяснению и устранению ошибки в технологии местного изготовления.

При получении отрицательного результата на образец сухой среды данной серии направляют рекламацию в адрес учреждения-изготовителя и ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Сроки хранения щелочного агара и основного раствора пептона производственного выпуска (сухая среда и приготовленные из нее образцы) указаны в инструкции предприятия-изготовителя по применению среды.

Для сред лабораторного изготовления определены следующие сроки хранения:

- для щелочного агара - 6 месяцев с момента изготовления и первичного контроля, по истечении этого срока допускается переконтроль и продление срока годности еще на 3 месяца;

- для основного раствора пептона - 2 года с контролем качества среды после приготовления, затем спустя 1,0 - 1,5 года хранения.

Срок хранения 1%-й пептонной воды при герметичной упаковке (резиновые пробки и металлические колпачки) - 2 месяца, а после переконтроля возможно продление срока хранения на 1 месяц.

Питательные среды, готовые к употреблению, хранят в темном прохладном месте (6 - 20 °С), не допуская перепада температур больше чем на 5 °С. Подъем и снижение температур губительно действуют на биологические свойства сред.

Щелочной агар и основной пептон, контролируемые авирулентным тест-штаммом холерного вибриона, подлежат периодической перепроверке по согласованию с территориальными лабораториями и противочумными учреждениями на базе последних вирулентными тест-штаммами. Ежегодному контролю в территориальном противочумном учреждении подлежит также теллурит калия.


Питательные среды, консерванты, ингибиторы посторонней микрофлоры, используемые в диагностике холеры, подлежат обязательной проверке в соответствии с действующими инструктивно-методическими документами.

Бактериологический контроль качества плотных и жидких питательных сред могут проводить лаборатории противочумных и других учреждений, имеющие разрешение на работу с возбудителем холеры, применяя для контроля тест-штаммы Vibrio cholerae Р-1 (145) и Vibrio cholerae eltor М-878, а также лаборатории особо опасных инфекций учреждений, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор, с использованием тест-штамма авирулентного холерного вибриона не О1 серогруппы Р-9741 в порядке, определяемом действующими методическими указаниями по контролю питательных сред.

Бактериологическому контролю подлежит каждая серия сухой среды производственного выпуска, имеющая номер государственной регистрации, лицензии на ее производство и соответствующий срок годности, а также среды лабораторного изготовления.

На контроль направляют часть общего объема среды, предназначенного для проведения исследований, в количестве 200 мл агара и 100 мл основного раствора пептона производственного выпуска и в двойном объеме для серий лабораторного изготовления. В направлении следует указать название среды, предприятие-изготовитель, номер серии и срок годности сухой среды, дату контролируемой варки. Транспортируемые образцы должны быть надежно упакованы, флаконы с жидкой средой закрыты резиновыми пробками.

Оптимальный срок проверки питательной среды 10 - 14 дней после приготовления.

При положительном результате контроля пробы соответствующая серия сухой среды считается пригодной к использованию. Последующий контроль этой серии среды осуществляется ежегодно, а также при изменении условий приготовления сухой среды, независимо от времени предыдущей проверки.

Если при первом контроле среда оказалась непригодной, необходим повторный бактериологический контроль этой же серии сухой среды, при этом на контроль необходимо направлять образец новой варки и навеску сухой среды этой же серии.

При получении отрицательного результата повторного контроля среды, приготовленной на месте, и положительного бактериологического контроля образца этой же серии сухой среды, сваренного в лаборатории контролирующего учреждения, следует считать пригодной данную серию сухой питательной среды и принять меры к выяснению и устранению ошибки в технологии местного изготовления.

При получении отрицательного результата на образец сухой среды данной серии направляют рекламацию в адрес учреждения-изготовителя и ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Сроки хранения щелочного агара и основного раствора пептона производственного выпуска (сухая среда и приготовленные из нее образцы) указаны в инструкции предприятия-изготовителя по применению среды.

Для сред лабораторного изготовления определены следующие сроки хранения:

- для щелочного агара - 6 месяцев с момента изготовления и первичного контроля, по истечении этого срока допускается переконтроль и продление срока годности еще на 3 месяца;

- для основного раствора пептона - 2 года с контролем качества среды после приготовления, затем спустя 1,0 - 1,5 года хранения.

Срок хранения 1%-й пептонной воды при герметичной упаковке (резиновые пробки и металлические колпачки) - 2 месяца, а после переконтроля возможно продление срока хранения на 1 месяц.

Питательные среды, готовые к употреблению, хранят в темном прохладном месте (6 - 20 °С), не допуская перепада температур больше чем на 5 °С. Подъем и снижение температур губительно действуют на биологические свойства сред.

Щелочной агар и основной пептон, контролируемые авирулентным тест-штаммом холерного вибриона, подлежат периодической перепроверке по согласованию с территориальными лабораториями и противочумными учреждениями на базе последних вирулентными тест-штаммами. Ежегодному контролю в территориальном противочумном учреждении подлежит также теллурит калия.

Читайте также: