Лабораторная диагностика бруцеллеза у собак

Обновлено: 24.04.2024

Бруцеллез – хроническое инфекционное заболевание животных и человека, вызываемое группой бактерий – бруцелл; сопровождается поражением органов и систем, у многих животных проявляется абортом и задержанием последа.

Сейчас бруцеллез распространен во многих странах мира. В бывших странах СССР наибольшее распространение имеет в Казахстане, Средней Азии и южных регионах России.

На 01.01.2012 года в РФ числилось 161 неблагополучных пункта по бруцеллезу крупного рогатого скота. За 10месяцев 2012 года в РФ было выявлено вновь 330 неблагополучных пунктов, оздоровлено 214 пунктов и по состоянию на 01.11.2012года осталось 277 неблагополучных пунктов.

Наибольшее количество неблагополучных пунктов в Астраханской области — 51, Республике Калмыкия — 49, Ставропольском крае — 40 и т.д.

Бактерии бруцеллеза подразделяются на 6 видов, основное эпизоотологическое и эпидемиологическое неблагополучие по бруцеллезу имеют бруцеллы: мелитензис, абортус и суис сельскохозяйственных животных. Особую опасность для человека представляет бруцелла мелкого рогатого скота — мелитензис. Бруцеллы, обладая высокой инвазивностью, могут проникать в организм человека через неповрежденные слизистые и при микротравмах кожных покровов. К химическим и физическим факторам бруцелла не устойчива: в почве, воде, навозе, кормах сохраняется до 4месяцев, прямые солнечные лучи убивают бруцелл за 3-4часа. По устойчивости к дезинфицирующим средствам — малоустойчивы.

У животных бруцеллез в большинстве случаев протекает без видимых клинических признаков Инкубационный (скрытый) период 2-4недели. Наиболее частыми проявлениями бруцеллеза у крупного, мелкого рогатого скота и свиней являются аборты, чаще во второй половине беременности, и задержание последов. Отмечаются заболевание суставов – бурситы, артриты -чаще передних конечностей. У самцов — орхиты и эпидидимиты. Бруцеллы выделяются больными животными с мочой и молоком: у овец-до 2х лет, у коров — в течении 5-7лет. Человек заражается от больного бруцеллезного скота при работе с больным скотом, через сырье животного происхождения (шерсть, пух, шкуры), при употреблении инфицированных мясомолочных продуктов, инфицированные предметы ухода за животными, экскременты и т.д.

У больного бруцеллезом человека инкубационный (скрытый )период 1-2 недели иногда до 2-х месяцев. Заболевание начинается с повышения температуры тела до 39-40 градусов. Температура держится в течение 7-10 дней и более. Если не проводить лечение ,то высокая температура держится 2-3месяца. Так называемая температурная лихорадка сопровождается ознобами, повышенной потливостью и признаками интоксикации организма. По мере развития болезни появляются симптомы поражения опорно-двигательного аппарата, сердечно-сосудистой, нервной и других систем организма (артрит, спондилит, ишиорадикулит, менингоэнцефалит, миокардит и т.д.)

Несмотря на поражения многих систем организма, больной часто чувствует себя удовлетворительно. В субъектах РФ неблагополучных по бруцеллезу разрабатываются комплексные планы по профилактике бруцеллеза, исходя из которых владельцы сельскохозяйственных животных, вне зависимости от форм собственности, обязаны:

выполнять требования по профилактике , своевременному выявлению зараженных бруцеллезом животных;
обеспечить ухаживающий персонал спецодеждой, средствами индивидуальной защиты, бытовыми помещениями;
организовать прохождение обслуживающим персоналом профилактических медицинских осмотров;
владельцы ЛПХ один раз в год проходят серологическое обследование на бруцеллез с целью выявления заболевания на ранней стадии.

В случае выявления бруцеллеза в сельхозпредприятии или ЛПХ, на хозяйство решением губернатора накладываются ограничения, разрабатываются мероприятия по оздоровлению от бруцеллеза и проводиться целый комплекс противоэпизоотических мероприятий.

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА

Animals. Laboratory diagnostics of brucellosis. Serological methods

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГБУ "ВГНКИ")

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 7 июня 2017 г. N 99-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Минэкономики Республики Армения

Госстандарт Республики Беларусь

Госстандарт Республики Казахстан

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 июня 2017 г. N 582-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34105-2017 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2018 г.

5 ВЗАМЕН ГОСТ 25385-91 в части серологических методов диагностики

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на все виды млекопитающих животных и устанавливает следующие методы серологической диагностики бруцеллеза:

- реакция агглютинации с S- и R-бруцеллезными антигенами;

- пластинчатая реакция агглютинации с антигеном, окрашенным бенгальской розовой (роз бенгал проба);

- реакция связывания комплемента;

- реакция длительного связывания комплемента на холоде;

- реакция непрямой гемагглютинации;

- реакция иммунодиффузии в геле агара с олигополисахаридным антигеном;

- реакция иммунодиффузии в геле агара с R-бруцеллезным антигеном;

- кольцевая реакция с молоком;

Примечание - Методы применимы ко всем видам бактерий рода Brucella.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.0.004-2015 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.4.011-89 Система стандартов безопасности труда. Средства защиты работающих. Общие требования и классификация

ГОСТ 1625-2016 Формалин технический. Технические условия

ГОСТ 2651-78 Натрия бихромат технический. Технические условия

ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия

ГОСТ 4220-75 Реактивы. Калий двухромовокислый. Технические условия

ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 5962-2013 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 16445-2012 Сыворотка гемолитическая для реакции связывания комплемента. Технические условия

ГОСТ 16446-2012 Комплемент сухой для реакции связывания комплемента. Технические условия

ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ 17206-96 Агар микробиологический. Технические условия

ГОСТ 18704-78 Кислота борная. Технические условия

ГОСТ 23519-93 Фенол синтетический технический. Технические условия

ГОСТ 25134-2013 Бруцеллин ВИЭВ. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 25794.1-83 Реактивы. Методы приготовления титрованных растворов для кислотно-основного титрования

ГОСТ 29230-91 (ИСО 835-4-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 4. Пипетки выдувные

ГОСТ 33675-2015 Животные. Лабораторная диагностика бруцеллеза. Бактериологические методы

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины, определения и сокращения

3.1 В настоящем стандарте применены термины с соответствующими определениями по ГОСТ 33675.

3.2 В настоящем стандарте применены следующие сокращения:

- РА - реакция агглютинации;

- РСК - реакция связывания комплемента;

- РБП - пластинчатая реакция агглютинации с бруцеллезным роз бенгал антигеном;

- РДСК - реакция длительного связывания комплемента;

- РИД - реакция иммунодиффузии;

- ЛПС - липополисахаридный антиген;

- О-ПС - олигополисахаридный антиген;

- РНГА - реакция непрямой гемагглютинации;

- КР с молоком - кольцевая реакция с молоком;

- ИФА - иммуноферментный анализ;

- ИХА - иммунохроматографический анализ;

- PKг-G - раствор конъюгата, конъюгированного с пероксидазой;

- ФСБ-Т - фосфатно-солевой буферный раствор с твином;

- РБР-С - разводящий буферный раствор для сывороток;

- К+ - инактивированная сыворотка крови животных, содержащая специфические антитела класса G к бактериям рода Brucella (положительный контрольный образец);

- К- - инактивированная сыворотка крови животных, не содержащая специфических антител к бактериям рода Brucella (отрицательный контрольный образец).

НАСТАВЛЕНИЕ ПО ДИАГНОСТИКЕ БРУЦЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ

Руководитель Департамента ветеринарии Е.А.Непоклонов 29 сентября 2003 г. N 13-5-02/0850

1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

1.1. Бруцеллез - инфекционная, хронически протекающая болезнь животных.

Возбудитель - бактерии из рода бруцелла, в который входят шесть самостоятельных видов: мелитензис (овец и коз), абортус (крупного рогатого скота), суис (свиней), канис (собак), овис (баранов и овец) и неотома (кустарниковых крыс).

Микроорганизмы первых четырех видов вызывают бруцеллез животных, а пятого вида - инфекционный эпидидимит баранов (ИЭ).

От животных, больных бруцеллезом, могут заражаться люди, для которых наиболее опасен возбудитель бруцеллеза овец и коз.

1.2. Диагноз на бруцеллез у животных ставят на основании результатов бактериологического, серологического, молекулярно-генетического и аллергического исследований с учетом эпизоотологических данных и клинических признаков болезни, руководствуясь при этом санитарными и ветеринарными правилами по профилактике и борьбе с заразными болезнями, общими для человека и животных.

1.2.1. При установлении диагноза на бруцеллез необходимо учитывать следующее:

- различные виды возбудителя являются патогенными, в основном, для животных соответствующего вида. Бруцеллы видов мелитензис, абортус и суис могут мигрировать на животных других видов;

- клинические признаки бруцеллеза у животных не характерны. Наиболее часто клиническое проявление болезни у маточного поголовья - аборт, у свиноматок наблюдается мумификация плодов.

При абортах отмечается утолщение плодовых оболочек, образование на них фибринозных или гнойных хлопьев. Бруцеллез сопровождается нередко поражением суставов (артриты), синовиальной системы (тендовагиниты, бурситы), половой системы (у самок - эндометрит, вагинит, у самцов - орхит, эпидидимит);

- патологоанатомическая картина при бруцеллезе не имеет характерных особенностей, позволяющих использовать их для диагностики этой болезни. Только у свиней на слизистой оболочке матки иногда находят желтовато-гнойные или казеозные узелки величиной с просяное зерно, так называемый "милиарный бруцеллез матки";

- у баранов, больных бруцеллезом, в семенниках и придатках обнаруживают некротические или гнойные очаги различной величины; отмечают заполнение полости мошонки серозно-гнойным транссудатом, разрастание фиброзной ткани, сращение придатка с семенником и общей влагалищной оболочкой, иногда атрофию семенников.

1.3. Диагностика бруцеллеза включает лабораторные (бактериологическое, серологическое и молекулярно-генетическое) исследования материала и аллергическое исследование свиней в хозяйствах.

Плановые серологические исследования являются основным методом выявления больных и подозрительных по заболеванию животных.

Бактериологическую диагностику проводят в случае аборта или при появлении у животных других признаков (бурситы, гигромы, орхиты, эпидидимиты и прочие), вызывающих подозрение на данное заболевание. Одновременно проводят серологическое исследование сывороток крови этих животных.

Молекулярно-генетическое исследование (ПЦР) проводят в случае аборта и при появлении у животных других клинических признаков, вызывающих подозрение на бруцеллез, а также при получении положительных и сомнительных результатов серологического исследования на бруцеллез животных, не иммунизированных противобруцеллезными вакцинами, из хозяйств, благополучных по данному заболеванию.

1.4. При взятии проб крови, молока и патологического материала, а также проведении лабораторных исследований необходимо соблюдать меры, предупреждающие заражение людей и обсеменение объектов внешней среды, руководствуясь при этом действующими правилами и инструкциями.

2. ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА ОТ ЖИВОТНЫХ И ПЕРЕСЫЛКА ЕГО ДЛЯ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Материал для лабораторных исследований отбирают от каждого животного в отдельности.

2.2. Для бактериологического исследования на бруцеллез направляют абортированный плод с плодовыми оболочками (от свиноматок берут не менее трех плодов) или селезенку, печень, желудок плода с содержимым, перевязанный со стороны пищевода и двенадцатиперстной кишки, и околоплодную жидкость.

Для прижизненной диагностики бруцеллеза от животных берут кровь, молоко, содержимое гигром (бурситов) и абсцессов. При диагностическом убое - дополнительно селезенку, печень, подчелюстные, заглоточные, предлопаточные, надколенные, подколенные, надвыменные, парааортальные, тазовые лимфатические узлы и половые органы. Жидкий материал берут в стерильную посуду (пробирки, банки).

При взятии содержимого гигром, бурс в области поражения выстригают шерсть, кожный покров дезинфицируют 70%-ным спиртом и смазывают настойкой йода. Затем стерильным шприцем с иглой большого диаметра делают пункцию, отсасывают содержимое гигромы (бурсы) и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой.

Перед взятием проб молока у коров вымя обмывают теплой водой, соски обрабатывают 70%-ным спиртом. Для исследования из каждой доли вымени берут последние порции молока в количестве 10-15 мл в отдельные стерильные пробирки с резиновыми пробками.

У овец и коз пробы молока берут путем пункции цистерны вымени. Для этого животное фиксируют в боковом положении, вымя у основания соска протирают 70%-ным спиртом и смазывают настойкой йода. Стерильным шприцем с иглой делают пункцию у основания соска и после попадания иглы в цистерну (о чем судят по свободному движению конца иглы) набирают в шприц молоко и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой.

Молоко должно быть доставлено в лабораторию и исследовано в день взятия пробы. Если это невозможно, молоко консервируют сухой борной кислотой (0,1 г на 10 мл) или генцианвиолетом (0,4 мл 1%-го спиртоводного раствора краски на 10 мл молока). Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 10 дней.

2.2.1. Отобранные для бактериологического исследования пробы упаковывают в целлофан или пергаментную бумагу, помещают в непроницаемую тару (ящик, банка, полиэтиленовый пакет) и в этот же день направляют в лабораторию. От абортировавшего животного одновременно с патологическим материалом направляют кровь (сыворотку крови) для серологического исследования на бруцеллез. Если в течение 24-30 ч взятый материал доставить в лабораторию не представляется возможным, его консервируют стерильным 30%-ным водным раствором химически чистого глицерина. Материал заливают консервирующей жидкостью в количестве, превышающем его объем в 4-5 раз. Крупные плоды направляют в неконсервированном виде.

2.3. Для серологического исследования в лабораторию направляют кровь (сыворотку крови) и молоко.

2.3.1. Кровь у животных берут из яремной вены (у свиней - из яремной, ушной или хвостовой; у собак - головной предплечья или латеральной подколенной голени; у лисиц и песцов - из бедренной вены; у норок путем отсечения подушечки среднего пальца задней лапы или кончика хвоста в стерильные пробирки по 5-7 мл (от пушных зверей по 1-2 мл). Пробирки нумеруют и составляют опись проб.

Консервирование сывороток проводят:

- добавлением 0,05 мл (1 капля) 5%-го раствора фенола на каждый миллилитр сыворотки при тщательном перемешивании;

- сухой борной кислотой (2-4% к объему сыворотки) до получения насыщенного раствора и образования на дне пробирки небольшого осадка;

- путем однократного замораживания.

Неконсервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 6 сут со дня взятия крови при условии хранения их при 4-8 °С.

Сыворотки, консервированные фенолом или борной кислотой, пригодны для исследования в течение 30 сут; замороженные сыворотки - в течение 3 сут после однократного оттаивания.

Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки исследованию на бруцеллез не подлежат.

2.3.2. Для исследования на бруцеллез в кольцевой реакции пробу цельного свежего молока от коровы (буйволицы) берут сборную из каждой доли вымени одного удоя в одну стерильную пробирку в количестве 10-15 мл. При этом, если молоко берут перед дойкой, то первые порции молока сдаивают. Пробы молока на рынках берут из каждой отдельной посуды (бидон, фляга и проч.) после тщательного его перемешивания. Пробирки нумеруют и составляют опись проб.

Молоко исследуют свежее (охлажденное до 4-10 °С или неохлажденное) или консервированное добавлением в каждую пробу одной капли 10%-го раствора формалина на 5 мл молока. Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 2-3 сут. Перед исследованием молоко необходимо тщательно перемешать для равномерного распределения сливок.

При массовом исследовании молока работу по отбору проб и постановке кольцевой реакции можно проводить непосредственно на ферме в специально отведенном помещении.

Не разрешается исследовать в кольцевой реакции молоко от коров (буйволиц), больных маститом или болезнями, сопровождающимися повышением температуры тела, а также молоко животных в первые две недели после родов. Молоко, имеющее повышенную кислотность (30° по Тернеру и выше), исследованию не подлежит, т.к. антиген обесцвечивается.

2.4. На направляемый в лабораторию материал заполняют сопроводительный документ установленной формы.

3. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА

3.1 Бактериологическую диагностику бруцеллеза проводят в случае аборта или при появлении у животных других признаков (бурситы, гигромы, орхиты, эпидидимиты и прочие), вызывающих подозрение на данное заболевание.

3.2 Бруцеллы обнаруживают бактериоскопией мазков из патологического материала, выделением культуры бруцелл на питательных средах и, при необходимости, путем постановки биологической пробы на морских свинках.

3.3 Бактериоскопическое исследование

Из доставленного на исследование патологического материала делают по два мазка из каждого объекта. При исследовании абортированных плодов мазки готовят из содержимого желудка, жидкости брюшной и грудной полостей, печени, селезенки, а также котиледонов плодовых оболочек. Из паренхиматозных органов, котиледонов и другого плотного материала делают мазки-отпечатки, жидкий материал наносят на предметные стекла пипеткой.

Мазки, фиксированные над пламенем горелки, окрашивают по Граму и одному из следующих специальных методов: по Стампу (модифицированный метод Циль-Нильсена), Козловскому или Шуляку-Шину (см. Прил. N 1, п.1). При микроскопии мазков учитывают, что бруцеллы - мелкие, грамотрицательные, расположенные отдельно, попарно или кучно коккобактерии, окрашивающиеся по Стампу, Козловскому или Шуляку-Шину в красный цвет.

3.4. Бактериологическое исследование

3.4.1 Для культивирования бруцелл используют мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ), печеночный глюкозо-глицериновый бульон (ПГГБ), мясо-пептонный печеночно-глюкозо-глицериновый агар (МППГГА), печеночный глюкозо-глицериновый агар (ПГГА), картофельный агар, эритрит-агар, сывороточно-декстрозный агар, печеночно-сывороточный агар и печеночно-аминопептидный агар, (см. Прил. N 1, п.2) и другие питательные среды, предназначенные для этой цели.

3.4.2 Перед посевом материала кожу абортированного плода с поверхности по белой линии протирают тампонами, смоченными 5%-ным раствором фенола. Стерильными ножницами вскрывают брюшную стенку и грудную клетку плода, содержимое грудной и брюшной полостей набирают пастеровскими пипетками и высевают в 1 пробирку с бульоном и 2 пробирки с агаром, а содержимое желудка - в 2 пробирки с бульоном и не менее 5 пробирок с агаром.

Из печени и селезенки вырезают кусочки размером не менее 2,0х1,5х2,5 см, увлажняют их спиртом, обжигают с поверхности и растирают в стерильной ступке с песком. Затем в ступку добавляют равное количество стерильного физиологического раствора и вновь растирают. Полученную взвесь пастеровской пипеткой по 0,1-0,2 мл высевают на поверхность предварительно подсушенных плотных сред (в пробирках или чашках). Допускается высев материала пастеровской пипеткой из органов (место прокола органа предварительно прижигают раскаленным шпателем). Из каждого органа делают посев на 1 пробирку с бульоном и 2 пробирки с агаром.

Если в лабораторию доставлен только желудок плода, высев проводят не менее чем на 10 пробирок агара.

При поступлении нескольких плодов от одного животного посевы делают из органов и тканей каждого плода отдельно.

Из плодовых оболочек и плаценты вырезают кусочки тканей с утолщенными ворсинками и стенками, наличием на поверхности фибрина или гнойного экссудата (выбирают менее загрязненные участки без некротических изменений).

Для уничтожения посторонней микрофлоры кусочки плаценты помещают в чашку Петри и заливают 3%-ным раствором гидроокиси калия на 30 мин. Затем их обмывают стерильным физиологическим раствором, готовят из этого материала суспензию в ступке со стерильным песком и делают посев пастеровской пипеткой на чашки со средой, содержащей бактериостатические препараты: генцианвиолет 1:200000 (0,1 мл 0,5%-го спиртоводного раствора на 100 мл среды) или кристаллвиолет 1:100000, генцианвиолет и малахитовую зелень в концентрации каждой краски 1:200000, уксуснокислый натрий из расчета 12,5 мг на 100 мл среды и др.

Содержимое бурс, гигром высевают на 3-4 чашки с плотной питательной средой, содержащей бактериостатические препараты.

Пробы молока центрифугируют 30 мин при 3000 об./мин. Верхний слой (сливки) и осадок набирают в пастеровскую пипетку и по 0,1-0,2 мл вносят на 3-4 чашки с агаром, содержащим бактериостатические препараты. Молоко, консервированное генцианвиолетом или другими консервантами, высевают на среды без бактериостатических веществ.

3.4.3. Для выращивания культур посевы помещают в термостат при 37-38 °С.

При исследовании материала от крупного рогатого скота половину засеянных пробирок и чашек культивируют в обычных условиях, другую - в атмосфере с повышенным содержанием углекислого газа (10-15%) в -инкубаторе или эксикаторе (микроанаэростате). Аналогичные условия можно создать в пробирках, закрытых резиновыми пробками или залитых парафином.

Перед парафинированием пробирки закрывают ватными пробками, пронося последние над пламенем горелки. Затем верхнюю часть пробки обрезают, а оставшуюся часть углубляют на 0,5-1,0 см внутрь пробирки и заливают расплавленным парафином.

Необходимое содержание углекислого газа в эксикаторе можно получить путем:

- заполнения части объема углекислым газом из баллона или аппарата Киппа;

- внесения бикарбоната натрия и серной или соляной кислоты (0,48 г бикарбоната натрия и 5 мл 25%-го раствора кислоты или 0,4 г бикарбоната натрия и 0,35 мл концентрированной соляной кислоты на 1 л объема);

- сжигания ваты, смоченной спиртом. При этом пробирки и чашки с посевами должны занимать не более половины объема эксикатора. Для определения концентрации углекислого газа в эксикаторе можно использовать химический метод (см. Прил. N 1, п.3).

3.4.4. Посевы выдерживают в термостате при 37-38 °С в течение 30 сут. Первичный осмотр посевов проводят через 24-48 ч. Пробирки с агаром и бульоном, заросшие посторонней микрофлорой, обезвреживают путем автоклавирования при 1,5 атм. в течение 1 ч.

В дальнейшем для обнаружения роста бруцелл посевы просматривают каждые 3-4 сут визуально, при необходимости через лупу или малом увеличении микроскопа. При отсутствии роста часть поверхности агара орошают посевным материалом.

При значительном росте посторонней микрофлоры (80% и более засеянных пробирок) бактериологическое исследование прекращают.

При просмотре посевов обращают внимание на характер роста микробов. На поверхности агара бруцеллы образуют мелкие, блестящие, выпуклые, с ровными краями и гладкой поверхностью просвечивающиеся колонии, имеющие в отраженном свете голубоватый оттенок, в падающем свете - сероватый. С возрастом колонии мутнеют и приобретают более темную окраску, что связано с появлением пигмента.

В бульоне бруцеллы образуют равномерное помутнение и пристеночное кольцо, возвышающееся над уровнем бульона, а в дальнейшем небольшой осадок на дне пробирки. В отраженном свете пристеночное кольцо имеет голубоватый оттенок.

При обнаружении роста на жидких средах и отсутствии характерного роста на агаре из каждой пробирки готовят мазки, которые окрашивают одним из специальных методов, и делают пересев на чашки с плотной средой для выделения чистой культуры. Пересевы на чашках культивируют так же, как и высевы из патологического материала.

Выделенные культуры идентифицируют по тинкториальным (окраска мазков по Граму и одним из специальных методов - по Стампу, Козловскому или Шуляку-Шину), морфологическим, культуральным свойствам и в реакции агглютинации на стекле с использованием набора компонентов для серологической дифференциации бруцелл.

Для постановки пластинчатой реакции агглютинации на стекле необходимы следующие компоненты: испытуемая культура, набор для серологической дифференциации бруцелл (выпускается биопредприятием), 0,5%-ный фенолизированный физиологический раствор рН 7,0-7,2.

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА

Animals. Laboratory Diagnostics of Brucellosis. Bacteriological methods

Дата введения 2017-01-01

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт)

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 12 ноября 2015 г. N 82-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Минэкономики Республики Армения

Госстандарт Республики Беларусь

Госстандарт Республики Казахстан

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 24 ноября 2015 г. N 1949-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 33675-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2017 г.

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

ВНЕСЕНА поправка, опубликованная в ИУС N 3, 2022 год, введенная в действие с 12.10.2021

Поправка внесена изготовителем базы данных

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на все виды млекопитающих животных и устанавливает бактериологические методы лабораторной диагностики бруцеллеза.

1 Данные методы применимы ко всем представителям рода Brucella.

2 Бактерии рода Brucella относятся ко II группе патогенности.

Настоящий стандарт также устанавливает общие требования к проведению молекулярно-генетических методов диагностики бруцеллеза (ПЦР).

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 3-88 Перчатки хирургические резиновые. Технические условия

ГОСТ 12.0.004-90 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения

ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия

ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 975-88 Глюкоза кристаллическая гидратная. Технические условия

ГОСТ 2222-95 Метанол технический. Технические условия

ГОСТ 4159-79 Йод кристаллический. Технические условия

ГОСТ 4232-74 Калий йодистый. Технические условия

ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4919.1-77 Реактивы и особо чистые вещества. Методы приготовления растворов индикаторов

ГОСТ 5962-2013 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ 6259-75 Реактивы. Глицерин. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ ISO 7864-2011 Иглы инъекционные однократного применения стерильные

ГОСТ ISO 7886-1-2011 Шприцы инъекционные однократного применения стерильные. Часть 1. Шприцы для ручного использования

ГОСТ 8074-82 Микроскопы инструментальные. Типы, основные параметры и размеры. Технические требования

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 9656-75 Реактивы. Кислота борная. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 13739-78 Масло иммерсионное для микроскопии. Технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 13805-76 Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей. Технические условия

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 16280-2002 Агар пищевой. Технические условия

ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ 17206-96 Агар микробиологический. Технические условия

ГОСТ 18704-78 Кислота борная. Технические условия

ГОСТ 21241-89 Пинцеты медицинские. Общие технические условия

ГОСТ 22967-90 Шприцы медицинские инъекционные многократного применения. Общие технические требования и методы испытаний

ГОСТ 22280-76 Натрий лимоннокислый 5,5-водный. Технические условия

ГОСТ 23519-93 Фенол синтетический технический. Технические условия

ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 29230-91 (ИСО 835-4-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 4. Пипетки выдувные

ГОСТ 32275-2013 Перчатки медицинские анатомические одноразовые. Технические требования

3 Термины, определения и сокращения

3.1 В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1.1 бруцеллез: Инфекционное заболевание животных и человека, вызываемое бактериями рода Brucella семейства Brucellaceae порядка Rhizobiales класса -Proteocteria.

3.1.2 антиген бруцеллезный: Поверхностные или цитоплазматические полисахаридно-белковые структуры бруцелл, на которые животными вырабатываются специфические антитела.

3.1.3 реакция агглютинации: Метод выявления специфических агглютинирующих антител в сыворотке крови животных.

3.1.4 биовар: Внутривидовая систематическая категория для обозначения штамма или совокупности штаммов бактерий со сходными ферментативными или антигенными свойствами, отличающимися от других вариантов этого вида.

3.1.5 антитела бруцеллезные (иммуноглобулины, ИГ, lg): Особый класс гликопротеинов в сыворотке крови и тканевой жидкости животных в виде растворимых молекул, присутствующих на поверхности В-лимфоцитов в виде мембраносвязанных рецепторов и обладающих способностью избирательно связываться с антигенами конкретных бруцелл, обусловленной предварительным взаимодействием иммунной системы организма с возбудителем.

3.1.6 полимеразная цепная реакция (ПЦР): Молекулярно-генетический метод увеличения малых концентраций определенных фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

3.1.7 стандарт мутности: Взвесь частиц стекла Pyrex в запаянной стеклянной пробирке, соответствующая 10 (5) международным единицам мутности.

Примечание - Стандарт мутности используют для визуального определения оптической концентрации бактериальных взвесей.

3.1.8 сыворотки монорецепторные A и M: Антивидовые бруцеллезные сыворотки крови кроликов к рецепторам культур Brucella abortus и Brucella melitensis.

Примечание - Монорецепторные сыворотки A и M используют для дифференциации культур бруцелл в пробирочной реакции агглютинации.

3.1.9 сыворотка S-бруцеллезная: Сыворотка крови кроликов, содержащая S-бруцеллезные антитела.

Примечание - S-бруцеллезную сыворотку используют для идентификации культур бруцелл в пластинчатой реакции агглютинации.

3.1.10 сыворотка R-бруцеллезная: Сыворотка крови кроликов, содержащая R-бруцеллезные антитела.

Примечание - R-бруцеллезную сыворотку используют для идентификации культур бруцелл в пластинчатой реакции агглютинации.

Бруцеллез – хронически протекающая инфекционная болезнь всех млекопитающих, в том числе человека. Болеют бруцеллезом и собаки, у которых это заболевание протекает в виде периодического повышения температуры и патологии репродуктивных органов. Поскольку эта болезнь недостаточно хорошо изучена, врачами часто ставится другой диагноз.

Возбудителем болезни у собак преимущественно являются бактерии рода бруцелла вида канис. Бруцеллы относятся к микроорганизмам, которые мало устойчивы к неблагоприятным факторам внешней среды. Нагревание до 60 градусов убивает их за 30-40 минут, до 80 градусов – за 5 минут, кипячение – моментально. Прямые солнечные лучи действуют на бруцелл губительно. Однако в органических материалах при низкой температуре они могут сохраняться до 3-4 месяцев.

Восприимчивость собак к бруцеллезу отмечается у всех собак, независимо от породы, пола, возраста. В организм собаки бруцелла проникает через органы дыхания, пищеварения, через половые пути и даже через кожу. Но основным путем заражения все-таки является проникновение бруцелл через желудочно- кишечный тракт во время поедания инфицированных продуктов (мяса, молока). После попадания в организм бруцеллы беспрепятственно разносятся во все паренхиматозные органы (печень, селезенка, костный мозг) и лимфоузлы. Но чаще всего бруцелла поражает половую систему собак ( семенники, ткани матки, особенно в состоянии беременности). Развиваются множественные воспалительные явления, которые носят хронический характер с периодическими обострениями.

Клинические признаки у собак обычно не выражены. В отдельных случаях у кобелей возникает бесплодие в результате развития эпидидимитов и орхитов. У сук основные патологические признаки наблюдаются во время щенности. При этом собаки могут абортировать на 30-50 день беременности или же щенки могут появиться мертвыми. После этого у сук длительное время могут продолжаться воспалительные процессы в матке. Плодные воды и выделения из матки в это время представляют собой источник заражения для владельцев собаки. В литературе встречаются описания артритов у собак при бруцеллезе.

Диагностика проводится лабораторно.

Лечение не разработано, т.е. бруцеллез является практически неизлечимым заболеванием. Для облегчения течения заболевания применяют антибиотики тетрациклинового ряда вкупе с иммуностимуляторами макрофагального звена и Т-лимфоцитов. При выраженных аллергических проявлениях показано применение кортикостероидных препаратов. Иногда неплохой лечебный эффект дает прием отвара мяты перечной.

Профилактика Эффективных профилактических мероприятий против бруцеллеза у собак не разработано. Владельцы собак должны проявлять очень большую осторожность при контакте со своими больными питомцами и постараться обязательно провести лабораторную диагностику для исключения буцеллеза.

Читайте также: