Лабораторная диагностика сальмонеллеза пчел

Обновлено: 25.04.2024

4.2. Биологические и микробиологические факторы

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА САЛЬМОНЕЛЛЕЗОВ, ОБНАРУЖЕНИЕ САЛЬМОНЕЛЛ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ И ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Дата введения 2010-09-02

1. Методические указания разработаны ФГУН "ЦНИИ эпидемиологии" Роспотребнадзора (С.Ш.Рожнова, А.Т.Подколзин).

2. УТВЕРЖДЕНЫ И ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 13.08.2010 г.

1. Область применения

1.1. Настоящие методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы специалистами организаций здравоохранения и других заинтересованных организаций.

1.2. В настоящих методических указаниях определен порядок проведения лабораторных исследований в целях обнаружения сальмонелл в клиническом материале, пищевых продуктах и объектах окружающей среды.

1.3. Настоящие методические указания распространяются только на лаборатории, имеющие право на работу с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и удовлетворяющие требованиям к помещениям и оборудованию в соответствии с СанПиН 1.3.2322-08.

2. Термины и сокращения

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ПЦР - полимеразная цепная реакция

Н-антиген - жгутиковый антиген, представляющий собой термолабильный белок

О-антиген - соматический антиген, представляющий собой липополисахарид клеточных мембран

Смесь О-сывороток - диагностические адсорбированные сыворотки сальмонеллезные

R-форма - шероховатая форма

RAPD - амплификация с произвольными (случайными) праймерами

ISO-6579 - международная организация стандартизации

MLST - мультилокусное секвенирование-типирование

PFGE - электрофорез в пульсирующем поле

VNTR - амплификация тандемных повторов с переменной копийностью

S-форма - гладкая форма

SS-агар - сальмонелла-шигелла агар

РПГА - реакция пассивной гемагглютинации

AFLP - оценка полиморфизма длины фрагментов амплификации

3. Нормативные ссылки

МУ по микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями - 1984 г.

ГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella.

ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологического анализа.

ГОСТ Р 50455-92 Мясо и мясные продукты. Обнаружение сальмонелл (арбитражный метод).

ГОСТ 9792-73 "Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц. Правила приемки и методы отбора проб".

ГОСТ 7702.20-95 "Субпродукты и полуфабрикаты птичьи. Методы отбора проб".

ГОСТ Р 52833-2007 (ИСО 22174-2005). Микробиология пищевой продукции и кормов для животных. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для определения патогенных микроорганизмов. Общие требования и определения.

ГОСТ 30705-2000 "Продукты молочные для детского питания. Методы микробиологического анализа".

МУ 4.2.1884-04 Санитарно-микробиологический и санитарно-паразитологический анализ воды поверхностных водных объектов.

МУК 4.2.577-96 "Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов".

* На территории Российской Федерации документ не действует. Действуют МУ 1.3.2569-09, здесь и далее по тексту. - Примечание изготовителя базы данных.

Информационное письмо МЗ РСФСР N 10/11-3223 от 28.08.1987 г.

"Методы контроля бактериологических питательных сред". Методические указания. МУК 4.2.2316-08.

"Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней". Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.2322-08.

"Методы контроля. Бактериологические и микробиологические факторы. Техника сбора и транспортировки биоматериала в микробиологические лаборатории" МУ 4.2.2039-0.

Инструкция по применению набора реагентов "Диагностикум эритроцитарный сальмонеллезный О-антигенный жидкий" от 22.08.2008 N 6854-Пр/08.

Laboratory Protocol "Isolation of Salmonella spp. From Food and Animal Faeces" 5 Ed June 2010. WHO Global Foodborhe Infections Network.

Antigenic formulae of the Salmonella serovars, 2007, 9 edition WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella.

4. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы

4.1. Аппаратура и инструментарий

Наименование аппаратуры и материалов

Названия нормативных документов (ГОСТ, ТУ)

Анализатор потенциометрический, погрешность измерений pH±0,01

Шкаф сушильный стерилизационный ШСС-80П или других марок, позволяющий поддерживать температуру (160±5) °С

* Документ в информационных продуктах не содержится. За информацией о документе Вы можете обратиться в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

Термостат, позволяющий поддерживать рабочую температуру 37 °С с отклонением от заданной ±1 °С

Термостат, позволяющий поддерживать рабочую температуру 41,5 °С с отклонением от заданной ±1 °С

Весы лабораторные общего назначения, 2 и 4 класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г

Микроскоп биологический МБИ-1, МБИ-2, МБИ-3, МБР-1, МБР-3, МБС

* На территории Российской Федерации документ не действует. Действуют ТУ 3-3.404-83, ТУ 3-3.154-80, ТУ 3-3.190-80, ТУ 3-3.193-80, ТУ 3-3.986-81, являющиеся авторской разработкой. За информацией о документе Вы можете обратиться в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

Стерилизаторы паровые медицинские или аналогичные

* На территории Российской Федерации документ не действует. Действует ГОСТ Р 51935-2002. - Примечание изготовителя базы данных.

Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды в соответствии с

Гомогенизатор перистальтического типа "Микс-2", "Стомайкер", или других наименований

AES Lab., Cat.N AESAP 1066

Гомогенизатор типа "вортекс"

Микропипетки на 200-1000 мкл

BIOHIT, Cat.N 720040 или "Ленпипет"

Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 или других видов

Холодильник бытовой электрический

* На территории Российской Федерации документ не действует. Действует ГОСТ 21239-93. - Примечание изготовителя базы данных.

Скальпель хирургический, 15 см

Часы механические сигнальные

Аппарат универсальный для встряхивания жидкости в колбах и пробирках (или другая аппаратура для встряхивания)

4.2. Лабораторная посуда и материалы

Бумага фильтровальная лабораторная

* На территории Российской Федерации документ не действует. Действует ГОСТ 9412-93. - Примечание изготовителя базы данных.

Колбы плоскодонные конические или круглые разной вместимости

Вата медицинская гигроскопическая

Пипетки вместимостью 1, 2, 5 и 10 см

Пробирки типов II1, II2

Стекла предметные для микропрепаратов

Спиртовки лабораторные стеклянные

Термометр ртутный с диапазоном измерения от 0 до 100 °С (цена деления шкалы 1 °С)

Сальмонеллез (паратиф) пчел – инфекционная патология пчелиных семей, приводит к гибели взрослых пчел, вызываемая различными видами сальмонелл.
Данное заболевание распространено на пасеках многих стран мира. Чаще всего источником инфекции становятся зараженные животные и бактерионосители, ими являются не только разные виды животных, но и сами пчелы, осы. Поэтому сальмонеллез пчел обнаруживается на тех пасеках, которые находятся в непосредственной близости с животноводческими помещениями, сточными водами ферм и местами стоянок сельхозживотных.

Если пчеловоды нарушают ветеринарно-санитарные правила содержания пчел и на пасеках отсутствуют поилки со свежей водой, то вероятность распространения паратифа возрастает. Заболеванию подвержены все породы пчел и осы. Инкубационный период сальмонеллеза пчел 3-14 дней. Продукты пчеловодства от зараженных одним из видов сальмонелл пчел не пригодны в пищу человека и являются опасными для его здоровья, вызывая отравление.

Возбудитель инфекционной патологии попадает в организм пчелы с водой и зараженным кормом и размножается в желудочно-кишечном тракте. В результате разрушению подвергаются перитрофические мембраны, гемолимфа, мышцы и прочие органы. При дальнейшем размножении микроорганизмов происходит интоксикация организма пчел и они гибнут. Чаще всего сальмонеллез пчелиных семей возникает в конце зимы начале весны, когда нарушены условия содержания и кормления пчел. Внешне болезнь проявляется увеличением брюшка. Из-за нарушений пищеварительной системы отмечается диарея. Каловые массы темно-бурого цвета, клейкие, со зловонным запахом. В феврале-марте до выставки из зимовника пораженные сальмонеллезом пчелы проявляют беспокойство, чрезмерное возбуждение, затем наступает угнетение. В летке распространен гнилостный запах из-за разложения экскрементов пчел. Очистительный облет вялый, пчелосемьи сильно ослабевают, развитие приостанавливается. Количество погибших пчел каждый день растет.

Диагностика

Для определения сальмонеллеза пчел нужно учитывать характерные клинические признаки, а также результаты бактериологических и серологических ветлабораторных исследований (выделений гемолимфы, содержимого кишечника). В ветеринарной лаборатории определяют чувствительность возбудителя заболевания к антибактериальной терапии. Важно исключить нозематоз, гафниоз, колибактериоз и прочие энтеробактериозы.

Профилактика

Профилактикой сальмонеллеза пчел является размещение пасеки вдали от животноводческих, звероводческих и птицеводческих помещений, а также соблюдение ветеринарно-санитарных правил содержания пчелосемей, обеспечение их доброкачественным питьем и кормом.

Лечение

Лечением пчел занимаются в весенний период (апрель-начало мая) или летний, что обусловлено временем возникновения заболевания. Лечебная подкормка дается и зараженным, и условно здоровым пчелосемьям. Слабеющие семьи уничтожают. Лекарственные препараты добавляются в сахарный сироп в расчете 1:1 сахара и воды. Антибактериальную терапию проводят синтомицином или левомицетином по 0,2-05 г, тетрациклином или террамицином в дозе 200 000-300 000 ЕД на 1 л сиропа. Для средних по состоянию пчелосемей применяют минимальную дозу препарата, для сильных пчелосемей – максимальную. Антибиотики растворяются в малом количестве воды (терррамицин, тетрациклин) или измельчаются в порошкообразную массу и смешиваются с водой (левомицетин и синтомицин плохо растворяются в воде). После их добавляют в сахарный сироп 30-37 градусов. Лечебная подкормка дается по 100 г на улочку трижды с интервалом 4-5 дней в вечернее время.

Сальмонеллез пчел способен нанести пчеловодам значительный экономический ущерб.

По материалам пресс-службы ФГБУ "Краснодарская межобластная ветеринарная лаборатория" Россельхознадзора

1.1. Американский гнилец (злокачественный гнилец, гнилец закрытого расплода) - инфекционная болезнь пчелиных и трутневых личинок в возрасте 7 - 9 дней. Болезнь проявляется во вторую, наиболее жаркую половину лета.

Зараженные личинки погибают, разлагаются, становятся вязкими, тягучими, приобретают запах растопленного столярного клея. Постепенно гнилостная масса высыхает в плотную корочку, которая с трудом извлекается из ячейки.

Крышечки ячеек над погибшими личинками темнеют, становятся продырявленными, просевшими (пестрый расплод).

1.2. Возбудитель болезни - Bac. larvae - грамположительные, спорообразующие, подвижные, прямые палочки с закругленными концами, располагающиеся одиночно или короткими цепочками.

1.3. Диагноз на американский гнилец ставят на основании эпизоотологических данных, характерных признаков поражения расплода и результатов лабораторного исследования.

1.4. Для исследования в лабораторию направляют образцы сотов размером 10×15 см с больными и погибшими личинками. Образцы пересылают в фанерном или деревянном ящике, отделяя их друг от друга и от стенок деревянными планками. Соты нельзя обертывать бумагой.

Заплесневевший материал для исследования непригоден.

1.5. Лабораторная диагностика американского гнильца включает микроскопию мазков из патологического материала и выделение культуры возбудителя с последующей ее идентификацией.

2.1. Мазки готовят из массы разложившихся личинок или сухих корочек. С этой целью из ячеек сотов пинцетом извлекают не менее 10 погибших личинок или корочек и помещают в пробирку с 5 мл стерильного физиологического раствора. Содержимое пробирки доводят до кипения над пламенем спиртовки, охлаждают и растирают до получения однородной суспензии.

2.2. Каплю приготовленной суспензии наносят на поверхность предметных стекол и распределяют тонким слоем. Мазки подсушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки, окрашивают по Граму и для обнаружения спор - 2 %-ным спиртовым раствором карболового фуксина в течение 1,5 - 2 мин.

При наличии возбудителя в мазках обнаруживают овальные споры и одиночные грамположительные палочки.

3.1. Для выделения культуры Вас. larvae суспензию, приготовленную как указано в п. 2.1, высевают в МПБ и на МПА с добавлением 10 % нормальной сыворотки крови лошади или среду Уайта (см. приложение 1).

Посевы инкубируют в термостате при температуре 37 - 38 °С в течение 24 - 72 ч.

3.2. Через 24 ч культивирования в жидкой питательной среде Вас. larvae дает помутнение, через 48 - 72 ч среда просветляется, на дне пробирки образуется осадок.

На плотных питательных средах через 48 - 72 ч культивирования появляются шероховатые, локонообразные слегка выпуклые колонии, вначале прозрачные, затем серовато-белые. Позднее наблюдается сплошной рост в виде серовато-белых наложений на поверхности агара.

3.3. Выделенные культуры идентифицируют по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам.

Возбудитель американского гнильца пчел расщепляет глюкозу с образованием кислоты без газа, не сбраживает мальтозу, сахарозу, арабинозу, восстанавливает нитраты в нитриты, не образует каталазу, не обладает гемолитической активностью (см. приложение 2).

3.3.1. Ферментативные свойства выделенных культур изучают путем выращивания их в течение 2 - 5 сут. на жидких средах Гисса с добавлением 10 % нормальной сыворотки крови лошади.

3.3.2. Восстановление нитратов в нитриты. Выделенную культуру высевают в сывороточный МПБ с 1 % нитрата калия. Через 48 - 72 ч инкубирования при 37 - 38 °С в пробирку вносят 0,5 мл 0,5 %-ного водного раствора крахмала и такое же количество 0,5 %-ного водного раствора йодистого калия. Содержимое пробирки тщательно перемешивают, добавляют одну каплю 5 %-ного раствора серной кислоты и взбалтывают. В присутствии нитрита калия цвет среды становится темно-синим.

3.3.3. Для определения каталазной активности на предметное стекло наносят каплю 3 %-ного раствора перекиси водорода и вносят в нее петлей суточную агаровую культуру возбудителя, при этом выделения газа не наблюдается.

3.3.4. Гемолитическую активность возбудителя определяют на глюкозо-кровяном агаре (см. приложение 1).

На агаре в чашках Петри через 24 - 48 ч обнаруживают серовато-белые наложения с локонообразными краями без зоны гемолиза.

4. Диагноз на американский гнилец считается установленным при выделении из патологического материала культуры со свойствами, характерными для Вас. larvae.

5. Срок исследования до 10 дн.

Начальник Главного управления
ветеринарии Государственного
агропромышленного комитета СССР

к Методическим указаниям по лабораторной
диагностике американского гнильца пчел

1. Среда Уайта. Скорлупу свежего куриного яйца протирают ватным тампоном, смоченным спиртом, обжигают на огне, стерильно вскрывают, отделяют белок, а желток выливают в колбу с 70 мл стерильной водопроводной воды. Содержимое колбы тщательно перемешивают путем встряхивания, разливают в пробирки по 10 мл и помещают в холодильник. По мере необходимости к 50 мл расплавленного и охлажденного до 45 - 50° МПА добавляют стерильно 10 мл эмульсии желтка, круговыми движениями тщательно смешивают агар с желтком и разливают в чашки Петри.

Застывшую среду выдерживают сутки в термостате для контроля стерильности.

2. Глюкозо-кровяной агар. МПА (рН 7,2 - 7,4) разливают в колбы по 100 мл и стерилизуют в автоклаве при 1 атм в течение 30 мин.

По мере надобности агар расплавляют в кипящей водяной бане, охлаждают до 45 - 50 °С, добавляют 2 % глюкозы и 15 - 20 мл свежевзятой стерильной дефибринированной крови лошади (барана, крупного рогатого скота) и смесь осторожно перемешивают, не допуская образования пены. Среду разливают в чашки и после застывания выдерживают в термостате 4 - 6 ч для подсушивания.

к Методическим указаниям по лабораторной диагностике американского гнильца, европейского гнильца и парагнильца пчёл

Что такое сальмонеллез? Причины возникновения, диагностику и методы лечения разберем в статье доктора Александрова Павла Андреевича, инфекциониста со стажем в 14 лет.

Над статьей доктора Александрова Павла Андреевича работали литературный редактор Маргарита Тихонова , научный редактор Сергей Федосов и шеф-редактор Лада Родчанина

Определение болезни. Причины заболевания

Сальмонеллёз — это острое инфекционное заболевание желудочно-кишечного тракта с возможностью дальнейшей генерализации процесса (распространением заболевания по всему организму). Причина развития сальмонеллёза — различные серотипы бактерий рода Salmonella. К клиническим характеристикам сальмонеллёза относят синдром общей инфекционной интоксикации, синдром поражения желудочно-кишечного тракта (гастрит, энтерит), синдром обезвоживания, гепатолиенальный синдром (увелечение печени и/или селезёнки) и иногда синдром экзантемы (высыпания).

Возбудитель

семейство — кишечные бактерии (Enterobacteriaceae)

род — Сальмонелла (Salmonella)

Существует 7 подвидов (более 2500 сероваров). Наиболее актуальные серовары: typhimurium, enteritidis, panama, london.

Представлены следующей антигенной структурой:

О-антиген (соматический, термостабильный);
H-антиген (жгутиковый, термолабильный);
К-антиген (поверхностный, капсульный);
Vi-антиген (антиген вирулентности — степень способности штамма вызвать заболевание; является компонентом О антигена);
М-антиген (слизистый).

К факторам патогенности (механизмам приспособления бактерий) относятся:

холероподобный энтротоксин — интенсивная секреция жидкости в просвет кишки;
эндотоксин (липополисахарид) — общее проявление интоксикации;
инвазия — заражение.

Тинкториальные свойства: разлагают глюкозу и маннит, образовывая кислоту и газ, продуцируют сероводород. Грамм-отрицательные палочки подвижны, спор и капсул не образуют. Растут на обычных питательных средах, образуя прозрачные колонии, на мясо-пептонном агаре с образованием колоний голубоватого цвета, на среде Эндо образуют прозрачные розовые колонии, на среде Плоскирева — бесцветные мутные, на висмут-сульфитном агаре — чёрные с металлическим блеском.

Высокоустойчивы во внешней среде (без агрессивных воздействий), активно размножаются в мясе и молоке (до 20 суток), в воде сохраняют жизнесособность до 5 мес., в почве — до 9 мес., в комнатной пыли — до 6 мес., в колбасе — до 1 мес., в яйцах — до 3 мес., в фекалиях сохраняются до 4 лет. При 56 °C погибают через 3 минуты, при кипячении мгновенно. Сальмонеллы, которые находятся в куске мяса массой 400 гр и толщиной до 9 см, погибают при его варке за 3,5 часа. Соление и копчение оставляет сальмонелл в живых. Воздействие кислот и хлорсодержащих дезинфицирующих средств вызывает их гибель. В последнее десятилетие появились штаммы сальмонелл, устойчивые ко многим антимикробным препаратам. [2] [5]

Эпидемиология

Зооантропоноз, распространённый повсеместно.

Источники инфекции: домашние животные (сами не болеют), птицы, человек (больной и носитель).

Резервуары инфекции и причина эпидемических вспышек сальмонеллеза: грызуны, дикие птицы, тараканы, улитки, лягушки, змеи.

Механизм передачи: фекально-оральный (пути — алиментарный, т. е. через органы ЖКТ, водный, контактно-бытовой). В основном источниками заражения являются птицы, яйца и молочные продукты. Инфицирующая доза 10*5-10*8 микробных тел.

Факторы риска

детский возраст до 5 лет;
возраст до 12 месяцев, особенно высока вероятность заболеть без грудного вскармливания;
иммунодефицит (в основном у младенцев и лиц старше 65 лет, а так же у пациентов с ВИЧ в стадии СПИДа, принимающих иммунодепрессивные препараты);
регулярный приём препаратов, снижающих кислотность желудка;
употребление сырого и недостаточно термически обработанного мяса, молочных продуктов и яиц;
частый контакт с животными с несоблюдением правил гигиены;
посещение стран с низким уровнем жизни.

В России в 2016 г. заболеваемость была – 26 на 100 тыс. населения, у детей в до 14 лет – 71 на 100 тыс. Для сравнения в США среднегодовая заболеваемость — 15 на 100 тыс. (1,35 миллиона заболеваний, 26 500 госпитализаций и 420 смертей ежегодно). Иммунитет строго типоспецифичен (возможно многократное инфицирование различными штаммами) и непродолжителен [2] [6] [9] [10] .

При обнаружении схожих симптомов проконсультируйтесь у врача. Не занимайтесь самолечением - это опасно для вашего здоровья!

Симптомы сальмонеллеза

Инкубационный период — от 6 часов (при алиментарном заражении) до 3 суток. При внутрибрюшном заражении (искусственно) — до 8 дней.

Начало заболевания острое (т. е. развитие основных синдромов происходит в первые сутки заболевания).

Читайте также: