Лайн блот на сифилис
Обновлено: 22.04.2024
Сифилис, подтверждающий тест (иммуноблот) IgG — современный методов диагностики сифилиса, самый достоверный высокочувствительный метод идентификации белков.
Сифилис — инфекционное заболевание, вызываемое бледной трепонемой (Treponema pallidum), передающееся в основном половым путем, склонное к хроническому течению и поражающее большинство органов и систем организма. Сифилис характеризуется медленным прогрессирующим течением. На поздних стадиях он может приводить к тяжёлым поражениям нервной системы и внутренних органов.
Клинические проявления сифилиса
Клинические проявления сифилиса очень разнообразны и зависят от стадии заболевания. Выделяют несколько стадий сифилиса. Первичная стадия наступает примерно через 2–3 недели после заражения. На этой стадии проявляются одна или иногда несколько язв, называемых шанкром, как правило, на той части тела, которая контактировала с шанкром больного человека, например пенисом или влагалищем. Во многих случаях твердый шанкр безболезненный и остается незамеченным, особенно если он находится в прямой кишке или на шейке матки. Шанкр исчезает через 4–6 недель.
Вторая стадия заболевания начинается через 2–8 недель после возникновения твердого шанкра. Она характеризуется появлением сыпи, чаще на ладонях и подошвах. Иногда встречаются и другие симптомы, к примеру лихорадка, усталость, опухание лимфатических узлов, боль в горле и ломота в теле.
Сифилис способен протекать в скрытой форме, во время которой у инфицированного человека не проявляется никаких симптомов, но в то же время он продолжает оставаться носителем инфекции. Это может длиться годами.
Без лечения примерно у 15% больных развиваются симптомы позднего, или третичного, сифилиса. Эта стадия иногда длится несколько лет, и приводит к психическим заболеваниям, слепоте, неврологическим проблемам, болезням сердца и даже к смерти.
От сифилиса можно избавиться с помощью антибиотиков (предпочтительно применять производные пенициллина). Причем на ранней стадии заболевание лечится легче и быстрее.
При контакте человека с Treponema pallidum, его иммунная система вырабатывает антитела к бактерии. В крови могут быть обнаружены два вида таких антител: IgM и IgG.
Антитела класса IgG при сифилисе
Антитела класса IgG появляются в крови через 3–4 недели после инфицирования. Концентрация их нарастает и достигает максимума на 6-й неделе, в этот момент их концентрация преобладает над концентрацией IgM. Иммуноглобулины класса G на определённом уровне сохраняются длительное время, иногда пожизненно.
Исследование IgG антител к антигенам возбудителя сифилиса Treponema pallidum методом иммуноблота используют в качестве дополнительного специфического трепонемного теста при необходимости углубленного исследования при неубедительных результатах скрининговых и подтверждающих тестов диагностики сифилиса.
Тест основан на методе Вестерн-блота. В ходе исследования выявляют наличие в сыворотке пациента антител класса IgG к электрофоретически разделенным и перенесенным на нитроцеллюлозную мембрану избранным антигенам возбудителя сифилиса Treponema pallidum.
Используемые антигены в методе Вестерн-блота:
- 47 кДа мембранный белок (TpN47) — специфичный;
- 45 кДа (TmpA) — специфичный;
- 22 кДа (Р 22) — неспецифичный;
- 17 кДа мембранный белок (TpN17) — специфичный;
- 15 кДа мембранный белок (TpN15) — специфичный.
Подготовка
Кровь рекомендуется сдавать утром, в период с 8 до 12 часов. Взятие крови производится натощак, спустя 4–6 часов голодания. Допускается употребление воды без газа и сахара. Накануне сдачи исследования следует избегать пищевых перегрузок.
Интерпретация результатов
Формат выдачи результата исследования — качественный (описание наличия/отсутствия полос, характеризующих выявление антител к каждому из указанных антигенов; общее заключение о результате исследования в форме: положительный/отрицательный/неопределенный).
Референсные значения: отрицательный.
При общей оценке результата учитывают положение окрашенных полос (специфичность антигена) и интенсивность их окрашивания (поскольку иногда возможна неспецифическая слабая ложная реакция с отдельными антигенами):
Разработка иммуноферментной тест-системы для подтверждения наличия в сыворотке, плазме крови и спинномозговой жидкости иммуноглобулинов класса G к Treponema pallidum методом иммунного блоттинга (формат Western blot)
Журнал: Клиническая дерматология и венерология. 2020;19(4): 465‑469
АКТУАЛЬНОСТЬ
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
Разработать набор реагентов для диагностики сифилиса методом иммунного блоттинга в формате Western blot с использованием нативных антигенов Treponema pallidum.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Для приготовления иммуносорбента использован нативный лизат T. pallidum (штамм Nichols) собственного производства и коммерческие препараты, необходимые для электрофореза и электропереноса белков возбудителя на нитроцеллюлозную мембрану. Выбран оптимальный режим проведения этих процедур. Для оценки чувствительности и специфичности новой тест-системы использованы коммерческие панели сывороток, содержащих и не содержащих антитела к T. pallidum, а также клинические материалы — образцы сыворотки, плазмы крови, спинномозговой жидкости.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Разработана новая тест-система для оценки наличия в крови и спинномозговой жидкости антител класса G к отдельным антигенам T. pallidum методом иммунного блоттинга в формате Western blot, не уступающая по эффективности импортному аналогу.
Дата принятия в печать:
Введение
Согласно статистическим данным Роспотребнадзора [1] заболеваемость сифилисом в Российской Федерации имеет тенденцию к снижению. Несмотря на это, сифилис остается социально значимым заболеванием, требующим пристального внимания со стороны как лечащих врачей, так и специалистов лабораторной службы.
Спектр методов, применяемых в лабораторной диагностике сифилиса, довольно широк [2—4]. При обследовании разных групп пациентов применяются разные комбинации этих методов и различные алгоритмы лабораторной диагностики сифилиса, которые, помимо скрининговых, обязательно включают различные подтверждающие методы исследования [5— 7]. Наиболее эффективным подтверждающим методом в настоящее время считается иммунный блоттинг (ИБ) — выявление специфических антител к отдельным антигенам возбудителя. Из основных антигенов T. pallidum диагностически значимыми считаются TpN15, TpN17, TmpA и TpN47 с молекулярной массой 15, 17, 45 и 47 кДа соответственно [5, 8—12].
В практике отечественного здравоохранения широко применяются наборы реагентов для ИБ формата Line blot (лайн-блот, линейный иммуноблот), в которых используются рекомбинантные аналоги антигенов TpN15, TpN17, TmpA и TpN47 [13, 14]. В то же время опыт серологической диагностики инфекционной патологии показывает, что наиболее эффективными являются подтверждающие исследования с использованием как рекомбинантных аналогов, так и нативных антигенов возбудителей, т.е. применительно к ИБ его обоих форматов — Line blot и Western blot.
Цель исследования — разработка иммуноферментной тест-системы для подтверждения наличия в сыворотке, плазме крови и спинномозговой жидкости IgG к T. pallidum методом ИБ (формат Western blot).
Материал и методы
В процессе разработки использованы следующие основные материалы:
— белковый маркер молекулярной массы фирмы Bio-Rad (США);
— акриламид и бис-акриламид фирмы AppliChem (Германия);
— нитроцеллюлозная мембрана с диаметром пор 0,45 мкм фирмы Sartorius (Германия);
— конъюгат козьих антител к IgG человека с щелочной фосфатазой фирмы Jakson ImmunoResearch (США);
— субстратный раствор, содержащий 5-бром-1-хлор-3-индолилфосфат и нитроголубой тетразолий фирмы Kem-En-Tec (Дания).
В работе применяли следующие методы:
2. Получение нативного лизата из культуральной массы. Полученный супернатант подвергали обработке ультразвуком, центрифугировали, удаляли надосадочную жидкость и ресуспендировали осадок в фосфатно-солевом буферном растворе.
3. Электрофорез нативного лизата T. pallidum в полиакриламидном геле (ПААГ) в восстановленных условиях с целью разделения белков в соответствии с их молекулярной массой проводили по методике, предложенной U.K. Laemmli [17].
4. Электроперенос (блоттинг) разделенных белков из ПААГ на нитроцеллюлозную мембрану проводили с использованием оборудования фирмы Hoefer Scientific (США).
В качестве референсного материала при оценке чувствительности и специфичности разработанной тест-системы использовали международный стандарт ВОЗ WHO International Standard 1st IS for human syphilitic plasma IgG фирмы NIBSC (Великобритания); сероконверсионную панель Syphilis Seroconversion Panel фирмы SeraCare (США) и смешанную панель Syphilis Mixed Titer AccuSet Performance Panel Modified фирмы SeraCare (США).
В качестве набора сравнения использовали набор реагентов Anti-T.pallidum WESTERNBLOT (IgG) фирмы EUROIMMUN AG (Германия).
Результаты и обсуждение
При разработке новой тест-системы использован опыт разработки аналогичных наборов, в частности тест-системы для выявления IgG к цитомегаловирусу [18]. При этом отработаны оптимальные условия получения иммуносорбента, процедуры анализа, регистрации, учета и интерпретации полученных данных.
По результатам проведенных экспериментов выбраны следующие условия получения иммуносорбента:
1) ПААГ с концентрацией акриламида 16% и бис-акриламида 4%;
2) загрузка нативного лизата T. pallidum на поверхность ПААГ из расчета 2 мкг на 1 мм 2 ;
3) проведение электрофореза в течение 4 ч при температуре 7°С и меняющемся напряжении (250 В в начале процесса, 150 В через 1 ч от начала процесса и 100 В через 2 ч от начала процесса);
4) проведение электропереноса в течение 3 ч при температуре 15 °С и постоянном напряжении 100 В;
5) инкубирование мембран после электропереноса в течение 15 мин в трис-солевом буферном растворе с целью блокирования сайтов неспецифического связывания.
Анализ антигенного состава нативного лизата T. pallidum показал наличие в нем всех диагностически важных антигенов с молекулярными массами 47, 45, 17 и 15 кДа (см. рисунок).
Антигенный состав лизата T. pallidum.
1 — результат электрофоретического разделения белкового маркера молекулярной массы; 2 — результат исследования сыворотки, положительной по наличию IgG к T. pallidum, при инкубации с мембраной, на которую нанесены электрофоретические разделенные антигены нативного лизата T. pallidum и контрольная линия (анти-IgG).
В качестве оптимальной выбрана следующая процедура проведения анализа:
— разведение образца в буферном растворе 1:100;
— инкубация стрипов иммуносорбента с образцом в течение 30 мин при комнатной температуре на шейкере-качалке;
— 3 промывки буферным раствором по 5 мин;
— инкубация стрипов иммуносорбента с конъюгатом в течение 30 мин при комнатной температуре на шейкере-качалке;
— 3 промывки буферным раствором по 5 мин;
— инкубация с субстратным раствором в течение 10 мин в темноте при комнатной температуре на шейкере-качалке;
— остановка реакции водой очищенной.
Итогом разработки стала тест-система ИФА-Блот-Сифилис-IgG следующего состава:
1) иммуносорбент — 24 полоски (стрипа) из нитроцеллюлозной мембраны с нанесенными на них методом электропереноса белками T. pallidum (антигены р47, р45, р17, р15) и контрольной линией (козьи антитела к IgG человека);
2) конъюгат — козьи антитела к IgG человека, меченные щелочной фосфатазой;
3) окрашивающий раствор — 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат и нитроголубой тетразолий;
4) 10-кратный концентрат трис-солевого буфера [ТСБ(×10)];
5) фотография референс-стрипа с проявленным белковым профилем антигенов T. pallidum (р47, р45, р17, р15).
Результаты анализа интерпретировали с учетом окрашивания зон, соответствующих только специфическим антигенам, при этом учету подлежали только четко окрашенные полосы. Наличие слабо окрашенных полос, соответствующих специфическим антигенам, а также окрашенных полос, соответствующих неспецифическим антигенам, не учитывали.
Положительным результатом анализа считали наличие не менее 2 полос, соответствующих специфическим антигенам T. pallidum; наличие только одной полосы, соответствующей одному из специфических антигенов, оценивали как неопределенный результат, отсутствие окрашивания в области полос, соответствующих специфическим антигенам, — как отрицательный результат.
Чувствительность и специфичность разработанной тест-системы вначале исследовали на референсных материалах — на 9 сыворотках сероконверсионной панели Syphilis Seroconversion Panel фирмы SeraCare (5 отрицательных, 3 неопределенных и 1 положительный) и на 20 сыворотках панели Syphilis Mixed Titer AccuSetTM Performance Panel Modified фирмы SeraCare (2 отрицательных и 18 положительных).
Полученные оценки исследованных образцов полностью совпали с их паспортными характеристиками, т.е. была показана 100% диагностическая чувствительность и специфичность разработанной тест-системы. Аналитическая чувствительность тест-системы оценена с использованием международного стандарта ВОЗ WHO International Standard 1st IS for human syphilitic plasma IgG фирмы NIBSC и составила 0,001 МЕ/мл.
В заключение исследовали чувствительность и специфичность разработанной тест-системы на клиническом материале по сравнению с аналогом — набором реагентов Anti-T.pallidum WESTERNBLOT (IgG) фирмы EUROIMMUN AG. Исследовано по 10 образцов сыворотки и плазмы крови человека, а также спинномозговой жидкости, содержащих IgG к T. pallidum по результатам их предварительного обследования, и по 10 образцов сыворотки, плазмы и спинномозговой жидкости, не содержащих этих антител (всего 60 образцов). Оценки всех исследованных образцов, полученных в обеих тест-системах, полностью совпали, что подтверждает высокую чувствительность и специфичность новой тест-системы.
Кроме полного совпадения общих оценок клинических материалов, в обеих тест-системах получено практическое совпадение профилей антител, выявленных этими тест-системами в исследованных образцах, о чем свидетельствуют коэффициенты корреляции оценок наличия антител к антигенам р47, р45, р17, р15 — 0,93—1,00.
Выводы
1. Разработана отечественная иммуноферментная тест-система ИФА-Блот-Сифилис-IgG, предназначенная для подтверждения наличия в сыворотке, плазме крови и спинномозговой жидкости IgG к T. pallidum методом ИБ (формат Western blot).
2. Разработанная тест-система характеризуется высокими показателями чувствительности и специфичности и имеет аналитическую чувствительность 0,001 МЕ/мл.
3. ИФА-Блот-Сифилис-IgG выгодно отличается по техническим характеристикам и стоимости от своего импортного аналога — набора реагентов Anti-T.pallidum WESTERNBLOT (IgG) фирмы EUROIMMUN AG (Германия).
4. После прохождения процедуры государственной регистрации медицинского изделия новая тест-система может быть рекомендована учреждениям здравоохранения в качестве подтверждающего теста на сифилис.
Опыт применения отечественной тест-системы для линейного иммуноблоттинга в лабораторной диагностике сифилиса
Журнал: Клиническая дерматология и венерология. 2020;19(1): 18‑23
Несмотря на очевидную тенденцию к снижению заболеваемости сифилисом в РФ, медико-социальная значимость этой инфекции остается очень высокой, а эффективность и своевременность ее диагностики отнюдь не утратили своей актуальности [1]. По-прежнему актуальна проблема эффективности лабораторных исследований в диагностике сифилиса, в особенности его ранних и скрытых форм.
В практике лабораторных исследований на сифилис особая роль отведена подтверждающим тестам, в частности иммунному блоттингу (ИБ), позволяющему выявлять в исследуемом образце антитела к отдельным антигенам Treponema pallidum.
По мнению Т.И. Долгих, ИБ целесообразно применять в следующих случаях:
1) с целью подтверждения положительных результатов выявления антител класса G и М при иммуноферментном анализе (ИФА), особенно у беременных и пациентов, страдающих аутоиммунными заболеваниями, поскольку у этих групп лиц возможно получение ложноположительного результата ИФА, обусловленного перекрестным реагированием антител, а также у пациентов, анамнестические и клинические данные которых позволяют сомневаться в наличии сифилиса;
3) с целью мониторинга течения сифилитической инфекции на разных стадиях лечения, а также с целью оценки эффективности проводимой терапии;
4) во время диспансерного наблюдения пациентов, перенесших сифилис (особенно при серологической резистентности и аутоиммунном процессе);
5) с целью исключения/подтверждения повторного заражения [2].
Особую значимость ИБ приобретает для уточнения диагноза в тех случаях, когда при предварительном обследовании различные серологические реакции дают противоречивые результаты.
Цель исследования
Материал и методы
Результаты и обсуждение
Из 54 протестированных образцов 35 (65%) показали отрицательный результат (отсутствие IgG к T.pallidum), 17 (31%) — положительный, 2 (4%) — неопределенный.
Из 54 проанализированных образцов 46 (85%) показали отрицательный результат (отсутствие IgМ к T.pallidum), 5 (9%) — положительный, 3 (6%) — неопределенный.
Таблица 3. Итоговые результаты исследования с помощью ЛИБ на наличие IgG и IgM к антигенам Treponema pallidum
Таблица 3 (окончание). Итоговые результаты исследования с помощью ЛИБ на наличие IgG и IgM к антигенам Treponema pallidum
В итоге из 54 исследованных образцов 4 (7,4%) остались неопределенными, причем в трех из них неопределенными были результаты оценки наличия IgM при отрицательных результатах оценки наличия IgG, а в одном, наоборот, неопределенным был результат оценки наличия IgG при отрицательном результате оценки наличия IgM.
По результатам ЛИБ 29 (53,7%) образцов оказались отрицательными, т. е. в них не были обнаружены ни IgM, ни IgG, а 21 (38,9%) образец — положительным, причем только в одном из них (образце № 6) были обнаружены и IgM, и IgG; в 4 образцах были выявлены IgM при отсутствии IgG, в 1 образце IgM были выявлены при неопределенном результате оценки наличия IgG, в 16 образцах были выявлены только IgG.
Заключение
Сведения об авторах
Введение
Сифилис — инфекционное заболевание человека, лабораторная диагностика которого требует проведения микробиологических и серологических исследований [1]. Несмотря на значимость прямых методов обнаружения Т.pallidum, серологические реакции являются в настоящее время основным инструментом диагностики сифилиса. Серологическая диагностика сифилиса, исключая скрининговые обследования, носит комплексный характер. Применение двух методов: нетрепонемного и трепонемного — позволяет увеличить вероятность постановки правильного диагноза [1, 2].
В силу ряда объективных и субъективных причин специфические тесты на сифилис не всегда дают однозначные результаты. На этом фоне достоверность диагноза зависит от количества проведенных исследований, что в свою очередь делает всю диагностическую процедуру трудоемкой и дорогостоящей. В связи с этим разработка новых чувствительных и специфичных диагностических наборов с целью минимизировать объем необходимых серологических исследований является актуальной проблемой сифилидологии [3, 4].
Дизайн тест-системы
В состав набора входят: 10-кратный концентрат промывочного раствора (ПР), раствор для разведения исследуемых образцов (РРО), раствор для разведения конъюгата, конъюгат — антитела козьи к IgG человека, конъюгированные со щелочной фосфатазой, раствор хромогенного субстрата для выявления ферментативной активности щелочной фосфотазы, контрольные образцы (К+ и К-) — сыворотки крови человека, содержащие и не содержащие антитела к T.Pallidum, и тест-полоски (стрипы) из нитроцеллюлозной мембраны, на которые в виде дискретных линий нанесены четыре рекомбинантных белка TpN15, TpN17, TpN47 и TmpA.
Кроме линий (зон) рекомбинантных антигенов, на каждом стрипе имеются четыре контрольные линии. Линия контроля антигена (Каг) — для оценки корректности проведения теста на данном исследуемом образце (при правильном проведенном исследовании эта полоса не окрашивается). Три калибровочные линии, которые при проведении анализа дают зоны дискретно уменьшающейся интенсивности окрашивания соответствующие баллам 3+, 1+, 0,5+ (рис. 1).
Проведение исследования
Регистрацию результатов проводят визуально, оценивая интенсивность окраски антигенных линий в баллах, посредством сравнения интенсивности окраски антигенных линий с интенсивностью окраски контрольных линий согласно таблице 1.
По интенсивности и количеству полос, проявившихся на стрипе, интерпретируют результат исследования анализируемого образца сыворотки или спинномозговой жидкости согласно таблице 2.
B. — П-АТ-Т.Pallidum; Панель сывороток, содержащих и не содержащих антитела к Тreponema рallidum; МБС; 24 инактивированных лиофилизированных сыворотки; Кат. № А-091
C. — Панель сывороток с нормированным содержанием IgG антител к антигенам р17 и р41 (TmpA) Тreponema Pallidum; 18 сывороток
F. — ВЛ-Контроль-АТ- Т.Рallidum; МБС; Контрольная сыворотка, содержащая антитела к Тreponema Pallidum для проведения внутрилабораторного контроля; Кат. № А-092
Разработка технологий производства рекомбинантных антигенов бледной трепонемы способствовало широкому внедрению в серологическую диагностику сифилиса методов иммуноферментного анализа 8.
C.Г. Марданлы, В.А. Арсеньева, М.В. Захаров
Читайте также: