Лизатный блот на вич

Обновлено: 28.03.2024

Большинство алгоритмов тестирования требует применения весьма специфических анализов, таких как Вестерн блот, непрямой анализ с использованием флуоресцирующих антител или радиоиммунопреципитация (РИП) для подтверждения положительных результатов, полученных в ходе скрининга. При правильном выполнении и интерпретации эти исключительно специфические анализы не должны давать биологических ложно-положительных результатов. Однако, они являются более трудоемкими и более дорогостоящими по сравнению с теми анализами, которые применяются для скрининга.

Эти подтверждающие анализы не должны быть разрешены FDA для применения в США, если они используются не для тестирования доноров крови, а для других целей. В случаев доноров используется лицензированный подтверждающий анализ для целей повторного использования доноров, когда результаты тестирования должны быть отрицательными. Основная задача подтверждающих анализов заключается в том, что неинфицированные лица, дающие положительный результат по данным скрининга, не идентифицируются ошибочно как лица, инфицированные ВИЧ.

Анализ на основе Вестерн блота

Методология
Вестерн блот представляет собой вероятно наиболее широко применяемый подтверждающий анализ для выявления антител к ретровирусам; большинство авторитетных исследователей в этой области считают его "золотым стандартом" для подтверждения результатов в отношении ВИЧ. Метод основан на использовании электрофореза для разделения антигенов ВИЧ, полученных из лизата вируса, выращенного в культуре. Это позволяет денатурировать компоненты вируса, придает им отрицательный заряд и разделяет их преимущественно на основании молекулярного веса. Разделение антигенов позволяет выявлять специфические антитела к каждому из антигенов вируса в ходе последующего набора этапов, являющегося сходным с методологией иммуноферментного анализа.

Смесь очищенных антигенов ВИЧ наносят на блок геля, содержащего додецилсульфат натрия и полиакриламид, после чего проводится электрофорез. Вирусные белки (антигены ВИЧ) мигрируют через молекулярные поры геля со скоростями, которые определяются электрическим зарядом и молекулярным весом; более высокомолекулярные белки мигрируют на меньшее расстояние и образуют полосу, находящуюся ближе к точке старта. Белки, разделенные в геле, затем переносят (осуществляется их "блоттинг") на нитроцеллюлозу с помощью другой процедуры электрофореза. Нитроцеллюлозная мембрана разрезается на тонкие полоски, каждая из которых содержит полное распределение полос антигенов, соответствующих вирусным белкам. Индивидуальная тест полоска инкубируется с разведением исследуемого образца или контроля (1:50 ил 1:100), после чего отмывается и инкубируется с меченым глобулином против антител человека. В этот момент процедура становится подобной процедурам любого непрямого иммуноанализа. Меткой обычно является фермент (пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза), который реагирует со специфическим бесцветным субстратом с образованием нерастворимого окрашенного вещества (окрашенной полосы на полоске) в тех местах, где присутствует комплекс антиген-антитело. Реакция с положительным образцом сыворотки дает набор полос на полоске, который характерен для ВИЧ. Многие из этих полос идентифицированы со специфическими продуктами вирусных генов.

Вирусные антигены ВИЧ-1 разделяются на следующие компоненты (сверху вниз): gp160, gp120, p66, p55, p51, gp41, p31, p24, p17 и p15.


Примеры Вестерн-блотов при анализе на ВИЧ-инфекцию. (1) Положительный контроль (сильный); (2) Положительный контроль (слабый); (3) Отрицательный (негативный) контроль; (4) Неопределенный результат; (5) Неопределенный результат (с высокой вероятностью положительного).

Обозначение "gp" относится к гликопротеидам; "p" означает белки. Цифры (x100) обозначают молекулярные веса. Важно помнить, что невирусные белки, происходящие из клеток хозяина, в которых выращивают вирус, также присутствуют на полоске нитроцеллюлозы. Они могут образовывать полосы во многих местах, однако чаще находятся вблизи средних значений молекулярного веса (40,000- 60,000). Наличие этих невирусных белковых полос может создавать трудности при интерпретации результатов за счет неспецифических реакций.

Интерпретация результатов

В зависимости от присутствующих в образце конкретных антител, реагирующих с разделенными антигенными компонентами, получаются разные профили полос. Тип профиля (комбинация и интенсивность присутствующих полос) определяет, является ли лицо, сыворотка которого анализируется, положительным в отношении антител к ВИЧ. Классификация результатов Вестерн блота определяется рядом критериев. Большинство учреждений в настоящее время следует рекомендациям Центра по контролю за заболеваниями (CDC), которые требуют для вывода о положительном результате наличия реагирования по крайней мере для следующих антигенов: p24, gp41, gp120/160. В настоящее время является общепринятым, что отрицательным результатом является отсутствием всех полос. Однако две организации, включая ВОЗ, придерживаются мнения, что результаты могут считаться отрицательными, если присутствует только очень слабая полоса p17. Вывод о неопределенных результатах делается, когда присутствует один или несколько антигенов, которые, однако, не удовлетворяют критериям для положительного результата. На Рис. 1 представлены примеры положительного, отрицательного и неопределенного результата Вестерн блота.

К сожалению, сыворотки ряда неинфицированных лиц показывают определенную способность к реагированию с одним или несколькими антигенами при анализе с помощью Вестерн блота. Такое реагирование может давать до 15% нормальных неинфицированных лиц, и это неоднократно происходит у лиц, которые оказываются отрицательными в результате применения методов скрининга. Соответственно, если сыворотки, дающие отрицательные результаты при использовании метода ИФА, тестируют с помощью Вестерн блота, многие из таких сывороток дают неопределенный результат. Большинство сывороток, дающих неопределенный результат, обнаруживают лишь слабую реакцию в отношении белков gag (обычно p17, p24 и/или p55); бывают и другие комбинации, но они являются нечастыми. Любая положительная реакция с использованием метода Вестерн блот, которая не отвечает требованиям, необходимым для вывода о положительном или отрицательном результате, должна считаться дающей неопределенный результат.

У некоторых лиц с неопределенными результатами (например, реакции с p24 и p55) впоследствии происходит сероконверсия; это свидетельствует о том, что наличие профиля, состоящего из p24 и p55, может быть индикатором ранней инфекции. Наоборот, у других лиц с аналогичным профилем, наблюдавшимся в течение длительных сроков (годы), сероконверсия никогда не происходила (т.е. они не являются инфицированными). По существу, большинство неопределенных результатов, получаемых при анализах Вестерн блот, связаны с неинфицированными лицами, которые дают профиль p24 и/или p55. Поэтому неопределенный результат Вестерн блота не может предсказывать ранние стадии инфекции.

Большинство авторитетных специалистов считает, что лица, дающие неопределенный результат, должны быть подвергнуты повторному анализу через несколько месяцев, хотя сероконверсия может быть обнаружена через более короткое время. Если это возможно, повторное тестирование в более поздний срок должно выполняться параллельно с повторным определением исходного образца в одном и том же опыте с одним и тем же набором и в одинаковых условиях определения, чтобы гарантировать возможность прямого сравнения образцов. Всемирная организация здравоохранения рекомендует повторное тестирование через 2 недели, если исходно получены "подозрительные профили" в Вестерн блотах, хотя другие организации рекомендуют подождать от 1 до 6 месяцев перед проведением повторного анализа. Если повторное тестирование выполняется в течение 6 месяцев и результаты становятся отрицательными или если не имеется прогрессии в отношении характера полос, инфекцию ВИЧ, как правило, можно исключить. Вследствие причин, которые остаются непонятными, у многих лиц неопределенные результаты сохраняются на протяжении многих лет, однако эти лица не являются инфицированными. Если имеет место серологическая прогрессия (большее число положительных полос или более интенсивные полосы) или имеет место конверсия к положительному результату (сероконверсия) при повторном анализе, то это означает, что соответствующее лицо было вероятно инфицировано на момент первого анализа (ранняя инфекция). Следует отметить, что лица, вакцинированные против ВИЧ (например, субъединицей gp160), могут неправильно выявляться как положительные на основании реакции только с антигенами оболочки вируса.

Непрямой анализ с иммунофлуоресцентными антителами (IFA)

При использовании этой методики клетки (обычно лимфоциты) инфицируются ВИЧ и далее фиксируются на предметном стекле. Добавляют сыворотку, содержащую анти-ВИЧ антитела, которые реагируют с внутриклеточным ВИЧ. Предметное стекло промывают, после чего добавляют антитела к иммуноглобулинам человека с ковалентно связанной флуоресцентной меткой. Реакцию считывают с помощью флуоресцентного микроскопа. Эта методика имеет то преимущество, что иногда она дает возможность определения для образцов, которые давали неопределенные результаты в анализе Вестерн блот. Недостатки, связанные с ее использованием, включают необходимость дорогостоящего микроскопа и субъективную интерпретацию, что требует хорошо подготовленных специалистов.

Модифицированный Вестерн блот

Линейный иммунный анализ

"Тест-системы на ВИЧ-специфические антитела" Н. Константайн, Медицинская школа Университета Мэрилэнд

Иммунный блоттинг (иммуноблот, Western Blot, вестерн-блот) - сочетает в себе иммуноферментный анализ (ИФА) с предварительным электрофоретическим переносом на нитроцеллюлозную полоску (стрип) антигенов вируса.

Иммуноблот включает в себя несколько стадий:

Подготовка стрипа. Предварительно очищенный и разрушенный до составных компонентов вирус иммунодефицита (ВИЧ) подвергается электрофорезу, при этом входящие в состав ВИЧ антигены разделяются по молекулярному весу. Затем методом блоттинга (аналог выдавливания на "промокашку" избытка чернил) антигены переносят на полоску нитроцеллюлозы, которая отныне содержит невидимый пока глазом спектр антигенных полос, характерный для ВИЧ.

Исследование пробы. На нитроцеллюлозную полоску наносится исследуемый материал (сыворотка, плазма крови пациента и т.п.), и если в пробе есть специфические антитела, то они связываются со строго соответствующими им (комплиментарными) антигенными полосами. В результате последующих манипуляций результат этого взаимодействия визуализируется - делается видимым.

В настоящее время иммунный блоттинг (иммуноблот) является основным методом для подтверждения наличия вирусспецифических антител в исследуемой сыворотке. В некоторых случаях ВИЧ-инфекции, до развития сероконверсии, специфические антитела более эффективно выявляются методом иммунного блоттинга, чем ИФА. При исследовании методом иммунного блоттинга обнаружено, что чаще всего в сыворотках больных СПИДом выявляются антитела к gp 41, причем обнаружение р24 у лиц, обследуемых с профилактической целью, требует дополнительных исследований на наличие у них ВИЧ-инфекции. Тест-системы для иммунного блоттинга на основе рекомбинантных белков, полученных путем генной инженерии, оказались более специфичными, чем обычные системы на основе очищенного вирусного лизата. При использовании рекомбинантного антигена формируется не диффузная, а четко выраженная узкая полоска антигена, легко доступная для учета и оценки.

Сыворотки лиц, инфицированных ВИЧ-1, обнаруживают антитела к следующим основным белкам и гликопротеидам - структурным белкам оболочки (env) - gp160, gp120, gp41; ядра (gag) - p17, p24, p55, а также ферментов вируса (pol) - p31, p51, p66. Для ВИЧ-2 типичны антитела к env - gp140, gp105, gp36; gag - p16, p25, p56; pol - p68.

Среди лабораторных методов, необходимых для установления специфичности реакции, наибольшее признание имеет обнаружение антител к белкам оболочки ВИЧ-1- gp41, gp120, gp160, и ВИЧ-2 - gp36, gp105, gp140.

ВОЗ считает положительными сыворотки, в которых методом иммунного блотинга обнаруживаются антитела к каким-либо двум гликопротеидам ВИЧ. Согласно этим рекомендациям, при наличии реакции только с одним из белков оболочки (гп 160, гп 120, гп 41) в сочетании или без реакции с другими белками, результат считается сомнительным и рекомендуется повторное исследование, используя набор другой серии или другой фирмы. Если и после этого результат остается сомнительным, рекомендуется наблюдение в течение 6 месяцев (исследования через 3 месяца).

Наличие положительной реакции с антигеном p24 может указывать на период сероконверсии, так как антитела именно к этому белку иногда появляются первыми. В этом случае рекомендуется, в зависимости от клинических и эпидемиологических данных, повторить исследование с образцом сыворотки, взятым как минимум через 2 недели, и это является как раз тем случаем, когда при ВИЧ-инфекции необходимо исследование парных сывороток.

Положительные реакции с белками gag и pol без наличия реакции с белками env могут отражать стадию ранней сероконверсии, а также может указывать на ВИЧ-2 инфекцию или на неспецифическую реакцию. Лиц с такими результатами после тестирования на ВИЧ-2 повторно исследуют через 3 месяца (в течение 6 месяцев).

Самым распространенным методом диагностики ВИЧ-инфекции является иммуноферментный анализ (ИФА) , с помощью которого в сыворотке крови больного выявляются антитела к ВИЧ.

Антитела к вирусу появляются у 90-95 % инфицированных лиц через 4-6 недель от момента заражения, у 5-10% через 3-6 месяцев и у 0,5-1% в более поздние сроки. В связи с этим, период от момента заражения до появления в крови определяемых с помощью общепринятых методов лабораторной диагностики количеств антител к ВИЧ называется "серонегативным окном". В течение этого времени диагноз поставить невозможно, но такой человек может быть источником инфекции и заражать других людей.

Иммуноферментный анализ (ИФА) позволяет выявлять в крови суммарный спектр антител к структурным белкам ВИЧ. В том случае если исследуемая сыворотка или плазма дала дважды положительный результат в ИФА, она тестируется в подтверждающем тесте иммуноблота (II этап). В отличие от ИФА иммуноблот позволяет обнаруживать антитела к индивидуальным белкам вируса. На основании результатов иммуноблота ставится окончательный диагноз ВИЧ-инфекции.

В этом анализе используется два типа реакций: иммунологическая и ферментативная.

Все вариации ИФА основаны на способности антител специфически взаимодействовать только с "собственными" антигенами, т.е. на иммунологической реакции "антиген-антитело".

Наибольшее распространение получил гетерогенный вариант иммуноферментного анализа, при котором антиген (определяемое соединение) или антитела фиксируется на твердой основе, в качестве которой могут выступать полистироловый планшет, полистироловые бусины, пористая подложка или магнитный носитель. Анализ проводят в 3 стадии. В лунку планшета, содержащую на своих стенках тот или иной антиген (т.е. один из белков вируса), добавляют исследуемый биологический материал - сыворотку крови больного. При наличии в организме инфекционного агента, в сыворотке появляются антитела к нему. Они прочно связываются с антигеном и не удаляются при последующей промывке чашки.

На следующем этапе необходимо определить, образовался или нет в лунке иммунный комплекс, то есть произошло ли соединение антигена с антителом. Простым глазом или под микроскопом это нельзя увидеть, поэтому требуются следующие две стадии, которые можно назвать проявляющими.

На второй стадии анализа в лунку вносят специальные (реагирующие с разными антителами) антитела с заранее прикрепленным к ним ферментом (поэтому метод называется ферментным). Слитый в единый комплекс "антитело-фермент" (конъюгат) способен связаться с антителами, уже зацепившимися за антиген, который закреплен на твердой подложке. В результате возникает "молекулярная цепочка", на одном конце которой вирусный белок, а на другом - фермент. После отмывки весь этот многослойный "пирог" остается в лунке планшета. Теперь нужно обнаружить активность фермента, чтобы сделать вывод о наличие антитела. Для этого на третьей стадии в ту же лунку вносят раствор субстрата и специального бесцветного вещества - хромогена, который способен окрашиваться в результате серии биохимических реакций, осуществляемых присутствующим в лунке ферментом. Если в лунке появляется окраска, это означает, что все элементы цепочки присутствуют. Из этого следует вывод: в крови пациента имеются антитела к антигенам ВИЧ и, следовательно, сам пациент инфицирован этим вирусом.

Существуют и другие варианты метода ИФА. Например, можно детектировать не антитела, а сам антиген. Процедура в целом будет похожей, хотя немного более сложной.

Результаты анализа могут быть положительными, отрицательными или сомнительными.

При отрицательном результате и отсутствии подозрения на недавнее (в течение последних 6 месяцев) заражение, можно считать диагноз ВИЧ неподтвержденным. Если есть подозрение на недавнее заражение, проводят повторное исследование.

ИФА может дать как ложноотрицательный, так и ложноположительный результат.

Ложноотрицательный результат ИФА возможен при свежем инфицировании, пока антитела к ВИЧ еще не выработались организмом больного.

Ложноположительные результаты могут быть получены при обследовании больных хроническими заболеваниями и в некоторых других случаях:

Административная ошибка в клинике или лаборатории (на пример, путаница в маркировке образцов или бланков) может привести к неверным результатам, сообщаемым лицам, проходящим тестирование на ВИЧ-инфекцию. Поэтому рекомендуется у всех пациентов с положительной реакцией на на­личие антител к ВИЧ взять еще одну пробу крови и исследо­вать ее на антитела к ВИЧ по той же методике.

Наиболее распространенной причиной ложноположительного теста является вакцинация. Однако описан один случай такого результата при заболевании системной красной волчанкой и в терминальной стадии заболевания почек.

Поэтому при получении положительного результата ИФА его обязательно перепроверяют более чувствительными методами.

У большинства больных антитела к ВИЧ выявляются через 6–12 недель после заражения с использованием тест-систем первых поколений и через 3–4 недели с использованием тест-систем третьего поколения, работающих по принципу сэндвич-ИФА с двумя антигенами. Однако ВИЧ-инфекция выявляется уже спустя 2 недели после заражения путем анализа на антиген p24 и уже через 1 неделю - путем анализа на вирусную РНК. Другими словами, период окна можно сократить до 2 недель и более с помощью комплексного диагностического подхода. Капсидный антиген p24 появляется в крови при бурной репликации вируса в острой лихорадочной фазе ВИЧ-инфекции и в этот период легко обнаруживается с помощью простого и сравнительно дешевого ИФА.

Если стоит задача выявить всех ВИЧ-инфицированных, в том числе лиц с ранними стадиями инфекции, то необходимо использовать весь арсенал анализов: на антитела, на антигены и на РНК. Однако тестирование на вирусную РНК дорого стоит, требует больших трудозатрат и недоступно для большинства лабораторий. И все же те лаборатории, в которых есть оборудование для ИФА, способны выявлять большинство случаев ВИЧ-инфекции при условии тестирования проб как на антитела к ВИЧ, так и на антиген p24.

В конце 1990-х гг. появились тест-системы для параллельного ИФА на антитела к ВИЧ и антиген p24, снявшие необходимость проведения раздельных анализов. Разработано и внедряется новое поколение комбинированных тест-систем для одновременного выявления антител к ВИЧ и антигенов ВИЧ.

Преимущество комбинированных анализов заключается в том, что они занимают меньше времени, требуют меньших трудозатрат и экономически более выгодны, чем раздельные анализы. Комбинированные тест-системы обладают высокой аналитической чувствительностью как за счет применения сэндвич-ИФА с двумя антигенами для выявления антител к ВИЧ, так и за счет одновременного выявления антигена p24.

В настоящее время на рынке имеется 8 комбинированных тест-систем четвертого поколения, прошедших клинические испытания: VIDAS HIV DUO Ultra (bioMérieux; Марси-л’Этуаль, Франция); Enzymun-Test-HIV-Combi (Boehringer; Мангейм, Германия); Vironostika HIV Uni-Form II Ag/AB (Organon Teknika; Бокстел, Нидерланды); AxSYM-HIV Ag/AB (Abbott Laboratories; Эбботт-Парк, Иллинойс, США); Enzygnost HIV Integral (Dade Behring; Марбург, Германия); Genescreen Plus HIV Ag-AB (Bio-Rad), and COBAS Core HIV Combi (Roche Diagnostics; Мангейм, Германия); Elecsys-HIV Combi (Boehringer; Мангейм, Германия). В последней тест-системе применен электрохемилюминесцентный сэндвич-метод с двумя антигенами; анализ занимает 18 минут; специфичность по данным испытаний на госпитализированных больных составляет 99,8%. Эта тест-система позволяет диагностировать ВИЧ-инфекцию на 5 дней раньше, чем самые чувствительные тест-системы на антитела к ВИЧ. Существует еще одна комбинированная тест-система без торговой марки для ИФА на антитела и антиген p24 с чувствительностью всего 99,5% и специфичностью 94,8%.

Комбинированный анализ на антитела и антиген для выявления недавней и длительно существующей ВИЧ-инфекции оправдан не только при тестировании доноров крови, но и во многих клинических ситуациях. Ранний диагноз ВИЧ-инфекции путем выявления антигена p24 позволяет безотлагательно начать лечение, провести консультирование больного и принять меры для снижения риска передачи инфекции. Благодаря способности выявлять антиген p24 тест-системы четвертого поколения позволяют диагностировать ВИЧ-инфекцию на ранних стадиях. Эти тест-системы весьма полезны для диагностики недавней и длительно существующей ВИЧ-инфекции в больничных и независимых клинических лабораториях и диагностических центрах (как бюджетных, так и коммерческих). В подобные учреждения нередко обращаются пациенты, риск ВИЧ-инфекции у которых значительно выше, чем у доноров крови. Для раннего выявления ВИЧ-инфекции у таких пациентов требуются тест-системы с высокой аналитической чувствительностью.

Важно отметить, что высокая аналитическая и эпидемиологическая чувствительность большинства тест-систем четвертого поколения, доказанная в испытаниях на больных из разных популяций, больных с сероконверсией и больных с разными подтипами ВИЧ, делает эти тест-системы незаменимыми для диагноза как недавней, так и длительно существующей ВИЧ-инфекции в самых разных ситуациях. Так, например, в клинических лабораториях бюджетных учреждений здравоохранения тестирование крови на антигены ВИЧ обычно не проводится (это прерогатива станций переливания крови), и поэтому при стандартном тестировании на антитела к ВИЧ случаи недавней инфекции могут быть пропущены. Было показано, что выявление инфекции на ранних стадиях дает основание вовремя начать антиретровирусную терапию, что повышает ее эффективность. Кроме того, появляется возможность своевременно проконсультировать пациента, правильно организовать его ведение и предотвратить передачу ВИЧ-инфекции.

Экспресс-тесты: Это класс тест-систем, дающих результат быстрее, чем через 30 минут. Экспресс-тесты для выявления специфических антител к ВИЧ появились в конце 1980-х гг., а в начале 1990-х гг. приобрели популярность. Благодаря усовершенствованию технологии производства экспресс-тесты стали не менее точными, чем ИФА (при условии, что анализ проводится аккуратно, квалифицированным сотрудником). Однако из-за мнимой простоты экспресс-тестов персонал часто допускает ошибки. Например, при внесении реагентов пипетки не всегда держат вертикально (как указано в инструкции), что нарушает соотношение объемов реагентов. Еще один источник ошибок - стремление многих лаборантов одновременно провести анализ нескольких проб. Из-за этого не выдерживается время этапов анализа.

При правильном выполнении экспресс-тесты на антитела к ВИЧ дают надежные результаты и могут использоваться в самых разных медицинских учреждениях и клинических ситуациях. В частности, их применяют в приемных отделениях, кабинетах врачей, амбулаториях, патологоанатомических отделениях, моргах, пунктах переливания крови, а также везде, где требуется срочное тестирование на ВИЧ (например, после контакта медицинского работника с возможным источником инфекции).

Экспресс-тесты на ВИЧ незаменимы для тестирования рожениц, за которыми не проводилось дородовое наблюдение (т. е. рожениц с невыясненным ВИЧ-статусом). Показано, что антиретровирусная терапия (в частности, зидовудином) эффективно снижает риск вертикальной передачи ВИЧ и что такое лечение в максимально ранние сроки необходимо матери, а затем и новорожденному. Экспресс-тестирование беременной на ВИЧ в предродовом периоде позволяет в случае выявления антител начать лечение до родов.

Читайте также: