Метод биочипов в диагностике туберкулеза

Обновлено: 25.04.2024

Обследование на туберкулез является обязательным компонентом обследования каждого больного, которому предполагается проведение лечения с использованием ГИБП.
В результате скринингового обследования должны быть даны ответы на следующие вопросы:
· Имеет ли у больного место активный туберкулез органов дыхания или какой-либо внелегочной локализации?
· Имеются ли у больного неактивные изменения после перенесенного активного туберкулеза, излеченного спонтанно или в результате лечебных мероприятий?
· Имеет ли место у больного латентная туберкулезная инфекция?
Для обоснованного ответа на эти вопросы необходимо проведение комплексного обследования, обязательно включающего клиническое, рентгенологическое и микробиологическое исследование мокроты или иного патологического материала, если таковой имеется.

Клиническое исследование больных, которым планируют назначение ГИБП, должно быть направлено на выявление характерных для активного заболевания жалоб и симптомов, а также биологических, медицинских, поведенческих и социальных факторов, повышающих риск заболевания туберкулезом. При клиническом исследовании должен быть тщательно собран анамнез жизни и заболевания, выявлены и детализированы жалобы, проведен осмотр больного и физикальное исследование.
При сборе анамнеза должны быть в обязательном порядке установлены наличие или отсутствие в прошлом у больного активного туберкулеза любой локализации или прохождение им обследования в противотуберкулезных учреждениях, наличие контакта с больными любыми формами туберкулеза (дома, на работе, в кругу друзей и знакомых; в прошлом или в настоящее время), наличие туберкулеза в семье и у кровных родственников. При контакте с больным-бактериовыделителем следует уточнить лекарственную чувствительность выделяемых им МБТ.

Рентгенологическое исследование
Флюорографическое исследование пациентов при скрининге на туберкулез перед назначением ГИБП нецелесообразно и необходимо проводить как минимум рентгенографическое исследование органов грудной клетки в двух проекциях. Проведение компьютерной томографии (КТ) грудной клетки, необходимо в тех случаях, когда необходимо особо надежно документировать исходное состояние паренхимы легких, внутригрудных лимфатических узлов, плевры, бронхиального дерева и средостения.

Обязательными показаниями к КТ являются любые выявленные при рентгенографии изменений органов дыхания, анамнестические указания на перенесенный ранее туберкулез органов дыхания или обследование у фтизиатра по поводу виража туберкулиновой пробы или ее нарастающего или гиперергического результата, а также – впервые выявленные положительные проба с Диаскинтестом или проба на высвобождение ИФН-γ, либо гиперергическая проба Манту с 2 ТЕ.
При выявлении ограниченных участков затемнения легочной ткани, инфильтратов, округлых образований, полостных образований, диссеминированных процессов в легких, очагов невысокой и средней плотности, увеличения в размерах внутригрудных лимфатических узлов, жидкости в плевральной полости необходимо исключение активного туберкулеза и больной должен быть срочно направлен в противотуберкулезный диспансер.

Для решения вопроса о латентной туберкулезной инфекции требуется проведение исследований для выявления специфического клеточного иммунного ответа на антигены МБТ: традиционной туберкулинодиагностики (проба Манту с 2 ТЕ), проб на высвобождение ИФН-γ in vitro (QuantiFERON © -TB Gold.), кожной пробы с аллергеном туберкулезным рекомбинантным (препарат Диаскинтест ® ).

Проба Манту с внутрикожным введением 2 ТЕ перед назначением лечения ГИБП должна быть проведена каждому пациенту
Проба Манту с 2 ТЕ определяет специфическую сенсибилизацию организма к МБТ с помощью очищенного туберкулина и должна производиться в соответствии с действующими инструкциями.
Пробу Манту с 2ТЕ должна проводить по назначению врача специально обученная в противотуберкулезном диспансере медицинская сестра, имеющая ежегодно подтверждаемый допуск к проведению туберкулино- диагностики.
Результат пробы Манту через 72 часа оценивает врач или специально обученная медсестра. Прозрачной линейкой фабричного изготовления измеряют поперечный (по отношению к оси предплечья) размер инфильтрата (папулы) в миллиметрах. При отсутствии инфильтрата измеряют гиперемию.

Реакция считается:
· отрицательной при полном отсутствии инфильтрата (папулы) или гиперемии или при наличии только уколочной реакции (0-1мм);
· сомнительной при инфильтрате размером 2-4 мм или только гиперемии любого размера без инфильтрата;
· положительной при наличии инфильтрата диаметром 5 мм и более.
Слабоположительными считаются реакции с размером инфильтрата 5-9 мм в диаметре, средней интенсивности - 10-14 мм, выраженными - 15-16 мм у детей и подростков и 15-20 мм у взрослых. Гиперергическими у детей и подростков считаются реакции с диаметром инфильтрата 17 мм и более, у взрослых - 21 мм и более, а также везикуло-некротические реакции, независимо от размера инфильтрата, с лимфангиитом или без него.
Усиливающейся реакцией на туберкулин считают увеличение инфильтрата на 6 мм и более по сравнению с предыдущей реакцией.

В России разработан препарат Диаскинтест ® , представляющий собой комплекс рекомбинантных белков CFP-10 и ESAT-6, продуцируемых Echerichia coli BL21(DE3)/pCFP-ESAT, и предназначенный для внутрикожного применения.

Оценка результатов и определение необходимых действий после комплексного скринингового обследования на туберкулез
Оценка результатов скринингового обследования производит фтизиатр, который должен дать заключение о наличии или отсутствии активного туберкулеза, посттуберкулезных изменений, оценить вероятность наличия у пациента латентной инфекции и определить целесообразность проведения химиопрофилактики или превентивного лечения.
· При подозрениях на активный туберкулез любой локализации обследование должно быть продолжено в противотуберкулезном учреждении, с применением расширенного микробиологического и лучевого и дополнительных методов исследования (иммунологических и молекулярно-биологических, эндоскопических, а при необходимости - и хирургических).
· При наличии признаков перенесенного ранее туберкулеза любой локализации или только латентной инфекции должен быть оценен риск развития активного туберкулеза и принято решение о проведении превентивного этиотропного лечения туберкулеза. Для обоснованного решения последнего вопроса необходима оценка всех имеющихся факторов риска заболевания туберкулезом у каждого пациента. При этом следует четко осознавать, что само лечение ГИБП, в первую очередь ингибиторами ФНО-α, является фактором, существенно повышающим риск заболевания туберкулезом.
· При наличии подозрительных на внелегочный туберкулез жалоб необходимо обследование больного в противотуберкулезном учреждении, располагающем возможностями для проведения специализированного обследования для исключения или подтверждения предположений о туберкулезе различных внелегочных локализаций.

Активный туберкулез любой локализации является противопоказанием к назначению ГИБП. Вопрос о лечении ГИБП может быть повторно рассмотрен только после завершения полноценного курса комплексного лечения туберкулеза в соответствии с действующими методическими документами.

Наличие посттуберкулезных изменений органов дыхания и/или иных органов, а также указания об установлении в прошлом диагноза активного туберкулеза являются факторами, повышающими риск заболевания туберкулезом (рецидива туберкулеза). Ни один из используемых в настоящее время режимов этиотропного лечения больных туберкулезом не обеспечивает стерилизацию организма человека от возбудителя туберкулеза. Поэтому ни сам факт проведения в прошлом противотуберкулезного лечения, ни его адекватность, не являются поводом для их игнорирования при назначении значительно снижающих резистентность к туберкулезу медикаментов. При этом не имеет значения ни отсутствие клинической симптоматики, ни характер иммунологических проб (поскольку в момент обследования популяция активно метаболизирующих микобактерий может и не быть значительной). В связи с этим целесообразно назначение больным с туберкулезом в анамнезе превентивного лечения, однако его объем и длительность должны варьировать в зависимости от наличия и числа дополнительных факторов риска эпидемиологического (контакт с больными туберкулезом), медицинского (сопутствующие заболевания, возраст, положительные и гиперергические результаты пробы Манту с 2 ТЕ, проб на высвобождение ИФН-γ, пробы с рекомбинантным туберкулезным антигеном) и социального характера.

При полном отсутствии как посттуберкулезных изменений в органах дыхания, так и указаний на возможный внелегочный туберкулез, необходимо оценить вероятность наличия у больного латентной туберкулезной инфекции, что повышает риск развития активного туберкулеза на фоне лечения ГИБП. При этом следует учитывать как результат пробы Манту с 2 ТЕ, так и проб на высвобождение ИФН-γ и/или пробы с рекомбинантным туберкулезным антигеном (Диаскинтест ® ).

При положительном результате пробы Манту с 2 ТЕ целесообразно проведение проб на высвобождение ИФН-γ (QuantiFERON-TB Gold) и/или пробы с рекомбинантным туберкулезным антигеном (Диаскинтест ® ). При их положительном результате проведение превентивного лечения противотуберкулезными препаратами представляется необходимым, поскольку в этом случае можно говорить о наличии в организме пациента активно метаболизирующей популяции МБТ и прием существующих противотуберкулезных препаратов будет оправдан. Объем и длительность превентивного лечения должны варьировать в зависимости от наличия и числа дополнительных факторов риска эпидемиологического (контакт с больными туберкулезом), медицинского (сопутствующие заболевания, возраст) и социального характера.

При отрицательной пробе Манту и отсутствии контактов можно говорить о малом риске латеной туберкулезной инфекции и ограничиваться в отношении данных больных стандартным наблюдением.

Начало лечения ингибиторами ФНО-α допустимо не ранее, чем через 4 недели превентивного противотуберкулезного лечения.
Вопрос о выборе того или иного ГИБП в зависимости от риска развития туберкулеза в настоящее время может быть решен только эмпирически, поскольку прямых сопоставлений не проводили, а имеющиеся данные разноречивы из-за различий в популяции больных и эпидемической ситуации по туберкулезу в странах и регионах.

ОБСЛЕДОВАНИЕ БОЛЬНЫХ, ПОЛУЧАЮЩИХ ЛЕЧЕНИЕ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫМИ БИОЛОГИЧЕСКИМИ ПРЕПАРАТАМИ С ЦЕЛЬЮ МОНИТОРИНГА ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ
В связи с достаточно высокой вероятностью контакта больных, получающих ГИБП, с источниками туберкулезной инфекции, невозможно ограничиться, по примеру большинства стран Европы, только скринингом перед началом приема ГИБП. На фоне лечения ГИБП больные должны регулярно проходить обследования, в ходе которых должно быть исключено развитие активного туберкулеза и оценена динамика состояния латентной туберкулезной инфекции. Наблюдение за больными со стороны фтизиатра следует продолжать еще в течение 6 месяцев после завершения терапии ГИБП.

При появлении клинической симптоматики – интоксикационных, респираторных, либо подозрительных на развитие активного внелегочного туберкулеза различных локализаций жалоб – внеочередное обследование на туберкулез должно быть проведено безотлагательно.
В случае появления респираторной симптоматики (кашель, отделение мокроты, кровохаркание или кровотечение, боли в груди, одышка) или интоксикационного синдрома (повышение температуры тела, потливость, слабость, снижение массы тела) необходимо проведение рентгенологического исследования органов грудной клетки (при возможности КТ) и микробиологического исследования мокроты с последующей консультацией фтизиатра.
При появлении интоксикационного синдрома, но отсутствии респираторных жалоб, необходимо исключить возможность внелегочного туберкулеза, для чего следует тщательно выяснить наличие жалоб, способных вызвать подозрение на туберкулез различных локализаций.
В случае подтверждения активного туберкулеза следует немедленно прекратить лечение ГИБП и назначить режим противотуберкулезного лечения в соответствии с существующими стандартами.
Отмененное из-за развития активного туберкулеза лечение ГИБП может быть возобновлено по специальному заключению фтизиатра и только после эффективного завершении курса полноценного комплексного лечения туберкулеза в соответствии с действующими методическими документами.

При появлении у больных с ранее отрицательной туберкулиновой пробой положительной или гиперергической пробы, либо при нарастании результатов ранее положительной пробы у больных, прошедших превентивное лечение, необходимо проведение клинического, рентгенологического и лабораторного исследования с целью исключения активного туберкулеза.
После исключения у этих больных активного туберкулеза необходимо проведение проб, выявляющих наличие в организме пациента популяции активно метаболизирующих МБТ - т.е. проб на высвобождение ИФН-γ и/или пробы с рекомбинантным туберкулезным антигеном (Диаскинтестом ® )

Положительный результат проб на высвобождение ИФН-γ и/или пробы с Диаскинтестом ® со значительной степенью вероятности указывает на высокий риск перехода латентной инфекции в клинически манифестированное заболевание и требует прекращения терапии ГИБТ и назначения профилактического курса противотуберкулезной терапии. Терапия ГИБП может быть возобновлена через 8 недель после начала противотуберкулезной терапии. Как альтернатива может рассматриваться переход на лечение менее опасными в отношении развития активного туберкулеза ГИБП
При отрицательных результатах проб на высвобождение ИФН-γ и/или пробы с Диаскинтестом ® , терапия ГИБП может быть продолжена.

Объем противотуберкулезной терапии определяется фтизиатром.

Показания к превентивному лечениюе противотуберкулезными препаратами больных, получающих генно-инженерные иммуносупрессивные препараты основывается на следующих факторах:
· Наличие в анамнезе туберкулеза любой локализации или выявление остаточных изменений спонтанно излеченного туберкулеза на этапе скрининга требует превентивного противотуберкулезного лечения в независимости от результатов иных исследований.
На этапе мониторинга назначение этим больным повторных курсов превентивного противотуберкулезного лечения показано при появлении положительного результата или нарастании размеров пробы Манту с 2 ТЕ при подтверждении их положительным результатом проб на высвобождение ИФН-γ и/или пробы с Диаскинтестом ® .
Если при повторных исследованиях в ходе лечения ГИБП сохраняются положительные результаты проб на высвобождение ИФН-γ и/или пробы с Диаскинтестом ® , то необходимо рассмотреть вопрос о полном отказе от терапии ГИБП или о применении менее опасных в отношении развития активного туберкулеза препаратов (либо этанерцепта, либо ритуксимаба, тоцилизумаба или абатацепта), либо о повторном курсе более интенсивного превентивного лечения туберкулеза.
· Положительный или гиперергический результат пробы Манту с 2 ТЕ, предпочтительно оцененный в динамике, подтвержденный положительной пробой на высвобождение ИФН-γ и/или пробы с Диаскинтестом ® - является показанием к превентивному противотуберкулезному лечению
· Наличие контактов с больными туберкулезом, особенно – с больными-бактериовыделителями – должно рассматриваться как дополнительный фактор риска развития активного туберкулеза и вести к назначению более интенсивного режима превентивного противотуберкулезного лечения и/или формированию режима лечения с учетом данных о спектре лекарственной устойчивости выделяемых больным МБТ
· Сопутствующие заболевания, повышающие риск развития туберкулеза, должны рассматриваться как дополнительный фактор риска развития активного туберкулеза и вести к назначению более интенсивного режима превентивного противотуберкулезного лечения и/или формированию режима лечения с учетом связанных с этим заболеванием противопоказаниям
· Планируемый к использованию или уже употребляемый пациентов ГИБП.

Наибольший риск туберкулеза связан с приемом ингибиторов ФНО-α (цертолизумаб-пегол, адалимумаб, инфликсимаб, и, в меньшей мере степени (по некоторым литературным данным) - этенерцепт. Назначение превентивного курса противотуберкулезной терапии при констатации наличия латентной туберкулезной инфекции у больных, которым планируется лечение данной группой препаратов, следует считать обязательным. Лечение ингибиторами ФНО-α можно начать не ранее, чем через 4 недели после начала курса превентивного противотуберкулезного лечения.

Перед началом лечения ритуксимабом, тоцилизумабом или абатацептом превентивное лечение противотуберкулезными препаратами показано только при наличии туберкулеза в анамнезе и/или при выявлении остаточных посттуберкулезных изменений органов дыхания. Вопрос о назначении превентивного курса противотуберкулезных препаратов на фоне приема ритуксимаба должен быть рассмотрен при появлении впервые положительных результатов проб на высвобождение ИФН-γ или пробы с Диаскинтестом. При этом следует учитывать наличие дополнительных эпидемических, медицинских и социальных факторов.

Превентивное противотуберкулезное лечение проводят под наблюдением врача-фтизиатра, который несет ответственность за правильность, безопасность и эффективность лечения.
Весь курс лечения можно проводить в амбулаторных условиях, либо в санатории, с учетом наличия и тяжести сопутствующих заболеваний, материально-бытовых условий жизни пациента, его психологических особенностей и степени социальной адаптации, местных условий.

Обследование по завершении курса превентивного лечения соответствует по объему обычному контрольному исследованию. Кроме того, необходимо повторение пробы с Диаскинтестом ® и/или тестов на высвобождение ИФН-γ. Их нарастание (появление) или отрицательная динамика клинико-лабораторных показателей требует тщательного клинического, рентгенологического и лабораторного исследования с целью исключения активного туберкулеза. После его исключения необходимо рассмотреть вопрос о полном отказе от терапии ГИБП или о применении менее опасных в отношении развития активного туберкулеза препаратов (либо этанерцепта, либо ритуксимаба, тоцилизумаба или абатацепта), либо о повторном курсе более интенсивного превентивного лечения туберкулеза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Для успешного внедрения в России методов биологической терапии хронических воспалительных заболеваний представляется абсолютно необходимым создание системы мероприятий по выявлению, диагностике и профилактике туберкулеза у данной группы больных. Учитывая расширение показаний к применению ГИБП, появление все новых препаратов данного класса и значительный рост числа больных, получающих ГИБП в течение длительного времени (в перспективе – пожизненно), следует говорить о формировании новой группы высокого риска развития туберкулеза. Пациенты, получающие лечение ГИБП нуждаются не только в скрининге туберкулеза перед началом лечения, но и в регулярном обследовании в дальнейшем, направленном на исключение развития активного туберкулеза и мониторинг латентной туберкулезной инфекции.

Почему так важно использовать тест-систему

Взятие пробы диагностического материала.
Разрушение клеток возбудителей туберкулеза в мокроте с высвобождением ДНК.
Проведение реакции ПЦР - размножение необходимых для генетического анализа фрагментов ДНК, определяющих устойчивость к противотуберкулезным препаратам.
Гибридизация - взаимодействие фрагментов ДНК микобактерий, приводящих к МЛУ, с зондами на биочипе.
Анализ свечения ячеек биочипа с помощью прибора анализатора биочипов.

Метод позволяет обнаружить не менее 500 геном-эквивалентов микобактерий (100-300 КОЕ в 1мл мокроты)
Метод позволяет обнаружить ДНК микобактерий туберкулезного комплекса в исследуемом образце(мокрота) и определить наличие/отсутствие устойчивости к рифампицину и изониазиду со специфичностью 95%.

Чем вызывается:

При активной форме болезни бактерии быстро размножаются в легких или других тканях организма, при этом происходит процесс туберкулезной интоксикации организма.

Факты

По данным статистики в мире туберкулезом каждый год заболевает 10 млн человек и умирает более 3 млн человек. В 1995 г. ВОЗ провозгласила туберкулез глобальной угрозой человечеству. Особую опасность представляют штаммы микобактерий, обладающие лекарственной устойчивостью. В 2004г. в России среди всех умерших от инфекционных и паразитарных болезней доля больных, смерть которых наступила от туберкулеза, составила 85%.

Туберкулез

Рифампицин, изониазид - противотуберкулезные препараты первого ряда, использующиеся для лечения впервые выявленных больных.
ТБ МЛУ (туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью) - форма заболевания, при которой микобактерии в организме больного нечувствительны к препаратам первого ряда.
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота - носитель генетической информации в клетках живых организмов.
ПЦР - полимеразная цепная реакция - метод получения в неограниченном количестве копий генов.
Гибридизация - метод обнаружения искомой ДНК путем взаимодействия ее с молекулярным зондом, расположенным на биочипе.

Ключевые слова

Об авторах

Уральский НИИ фтизиопульмонологии Национального медицинского исследовательского центра фтизиопульмонологии и инфекционных заболеваний МЗ РФ
Россия

кандидат биологических наук, ученый секретарь, руководитель референс-лаборатории по этиологической диагностике туберкулеза и микобактериозов,

620039, г. Екатеринбург, 22-го Партсъезда, д. 50

кандидат биологических наук, заведующая лабораторией микробиологии и ПЦР-диагностики,

620039, г. Екатеринбург, 22-го Партсъезда, д. 50

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник,

620039, г. Екатеринбург, 22-го Партсъезда, д. 50

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник,

620039, г. Екатеринбург, 22-го Партсъезда, д. 50

Список литературы

2. Бобровская К. В., Камаев Е. Ю., Кравченко М. А., Вахрушева Д. В. Определение лекарственной устойчивости М. tuberculosis к рифампицину и изониазиду методом абсолютных концентраций и анализ мутаций на биологических микрочипах // Омский научный вестник. ‒ № 1 (84). ‒ 2009. ‒ С. 9-13.

3. Вахрушева Д. В., Голубев Д. Н. Схема бактериологического обследования пациентов, поступающих в приемно-диагностическое отделение УНИИФ. Патент на промышленный образец № 82725 от 16.08.2012 г.

4. Зименков Д. В., Кулагина Е. В., Антонова О. В. и др. Анализ генетических детерминант множественной и широкой лекарственной устойчивости возбудителя туберкулеза с использованием олигонуклеотидного микрочипа // Молекулярная биология. ‒ 2014. ‒ Т. 48, № 2. ‒ С. 1-14.

5. Исакова Ж. Т., Совхозова Н. А., Гончарова З. К., Алдашев А. А. Сравнительный анализ определения лекарственно-устойчивых штаммов M. tuberculosis бактериологическим методом абсолютных концентраций и методом биологических микрочипов // Туб. и болезни легких. ‒ 2011. ‒№ 3. ‒ С. 57-59.

7. Носова Е. Ю., Краснова М. А., Галкина К. Ю. Сравнительная оценка эффективности молекулярных тест-систем “ТБ-биочип”, “Xpert MTB/Rif” и “Genotype MTBDRplus” для быстрого определения мутаций, ответственных за лекарственную устойчивость Мycobacterium tuberculosis complex (в респираторном материале пациентов московского региона) // Молекулярная биология. ‒ 2013. ‒ Т. 47, № 2. ‒ С. 267.

8. Носова Е. Ю., Хахалина А. А., Исакова А. И. и др. Одновременное определение генетических детерминант широкой лекарственной устойчивости и генотипирование M. tuberculosis с помощью гибридизационного анализа на биочипах // Туберкулез и социально-значимые заболевания. ‒ 2016. ‒ № 2. ‒ С. 24-33.

10. Умпелева Т. В., Кравченко М. А., Еремеева Н. И., Вязовая А. А., Нарвская О. В. Молекулярно-генетическая характеристика штаммов Mycobacterium tuberculosis, циркулирующих на территории Уральского региона России // Инфекция и иммунитет. ‒ 2013. ‒ Т. 3, № 1. ‒ Р. 21-28.

11. Федеральные клинические рекомендации по диагностике и лечению туберкулеза органов дыхания. ‒ М.-Тверь: Триада, 2014. ‒ 56 с.

12. Федеральные клинические рекомендации по диагностике и лечению туберкулеза органов дыхания с множественной и широкой лекарственной устойчивостью возбудителя. – М.-Тверь: Триада, 2014. ‒ 72 с.

13. Федеральные клинические рекомендации по организации и проведению микробиологической и молекулярно-генетической диагностики туберкулеза. ‒ М., 2015. ‒ 35 с.

14. BakuBa Z., Napiorkowska A., Bielecki J. et al. Mutations in the embB gene and their association with ethambutol resistance in multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Poland // BioMed. Res. Intern. ‒ 2013. ‒ Vol. 167954. ‒ P. 5.

15. Bespyatykh J. A., Zimenkov D. V., Shitikov E. A. et al. Spoligotyping of Mycobacterium tuberculosis complex isolates using hydrogel oligonucleotide microarrays // Infection Genetics and Evolution. ‒ 2014. ‒ Vol. 26. ‒ Р. 41-46.

16. Nosova E. Y., Zimenkov D. V., Khakhalina A. A. еt al. A comporation of the Sensititre MycoTB Plate, the Bactec MGIT 960, and microarray-based molecular assay for the detection of drug resistance in clinical Mycobacterium tuberculosis isolates in Moscow, Russia // PLOS ONE|DOI:10.1371/journal. pone.0167093.

17. Plinke C., Rusch-Gerdes S., Niemann S. Significance of mutations in embB Codon 306 for prediction of ethambutol resistance in clinical Mycobacterium tuberculosis isolates // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. ‒ 2006. Vol. 50, № 5. ‒ P. 1900-1902.

18. Zimenkov D. V., Antonova O. V., Kuz'min A. V. et al. Detection of second-line drug resistance in Mycobacterium tuberculosis using oligonucleotide microarrays // BMC Infectious diseases. ‒ 2013. ‒ № 13. ‒ Р. 240.

19. Zimenkov D. V., Kulagina E. V., Antonova O. V. еt al. Evaluation of a low-density hydrogel microarray technique for Mycobacterial species identification // J. Clinical Microbiology. ‒ 2015. ‒ Vol. 53, № 4. ‒ P. 1103-1114.

В настоящее время одной из перспективных молекулярных технологий гибридизационного анализа на твердых носителях являются биологические микрочипы. Первые биочипы появились в конце прошлого века, а сейчас уже десятки компаний выпускают различные типы чипов, отличающихся друг от друга по методике изготовления и по методу, с помощью которого регистрируют результат взаимодействия чипа с образцом.

Отечественные молекулярные биочипы, созданные по технологии, разработанной в Институте молекулярной биологии РАН имени В.А.Энгельгардта под руководством А.Д.Мирзабекова, содержат трехмерные ячейки, состоящие из геля, в которых иммобилизованы олигонуклеотидные зонды. Объем каждой ячейки составляет примерно 1 нл. Такие биочипы обладают существенным преимуществами по сравнению со стандартными двухмерными чипами.

Во-первых, взаимодействие исследуемого образца с зондом, иммобилизованным в геле, более специфичное, чем в случае, когда иммобилизованные зонды находятся на поверхности стекла. Во-вторых, каждая ячейка содержит гораздо большее количество молекул зонда по сравнению с ситуацией, когда зонды прикреплены к двухмерной поверхности. В третьих, в связи с тем, что каждая ячейка отделена от соседних гидрофобной поверхностью, то в разных ячейках трехмерных биочипов можно осуществлять различающиеся реакции, например ПЦР с различными праймерами и другие ферментативные реакции.

Показано, что использование молекулярных биочипов существенно ускоряет лабораторную диагностику туберкулеза и микобактериозов, а в комплексе с автоматизированной системой BACTEC MGIT 960 позволяет получить результат за 10 дней у 90% обследованных независимо от массивности бацилловыделения. Кроме того, данный метод позволяет изучать генетическое разнообразие типов мутаций и их сочетаний в генах rpoB, katG, inhA, oxyR и gyrA и в короткий срок выявлять лекарственно-устойчивые штаммы микобактерий, а также может служить дополнительными генетическими маркерами для штаммов микобактерий туберкулеза, циркулирующих в Московском регионе. (См. статью: Литвинов В.И. с соавт. "Биочипы в диагностике туберкулеза и микобактериозов").

В соответствии с современными программами ВОЗ, основой выявления туберкулёза за рубежом считают проведение микроскопии мазков мокроты, полученной от кашляющих больных, обратившихся к врачам общей практики; мазки окрашивают по Цилю-Нильсену. Эта методика входит в отечественный поликлинический и клинический минимум обследования пациента, выделяющего мокроту. В 1995 г. Минздравмедпром России в приказе № 8 "О развитии и совершенствовании деятельности лабораторной клинической микробиологии (бактериологии) лечебно-профилактических учреждений" подтвердил эту обязанность клинико-диагностических лабораторий. Обязательное бактериологическое исследование мокроты на М. tuberculosis должно быть организовано для нетранспортабельных больных, больных хроническими заболеваниями органов дыхания и мочевыводящей системы, а также для работников неблагополучных по туберкулёзу животноводческих хозяйств. Этот старейший метод полностью сохраняет свое значение вследствие доступности для практических клинико-диагностических лабораторий, низкой стоимости и быстроты выполнения.

При бактериоскопии мазка, окрашенного по Цилю-Нильсену, микобактерии туберкулеза могут быть обнаружены при наличии не менее 100 000 - 1 000 000 бактериальных клеток в 1 мл патологического материала (мокроты). Такое большое количество микобактерий встречается у больных с далеко зашедшими прогрессирующими формами заболевания (диссеминированными и фиброзно-кавернозными). У значительно большего числа больных количество выделяемых ими микобактерий ниже предела метода бактериоскопии, что и является большим минусом этого метода. Только при идеальном выполнении всех требуемых условий, указанных в Приказе № 109 МЗ РФ,-исследование не менее трех проб диагностического материала, правильный сбор мокроты, наличие современного бинокулярного микроскопа и высококачественных реактивов, просмотр до 300 полей зрения - возможно повышение чувствительности до 10000 микробных клеток.

Микобактерии туберкулёза имеют вид тонких, слегка изогнутых палочек различной длины с утолщениями на концах или посередине, располагаются группами и поодиночке (рисунок 1,а) Окрашенные по Цилю-Нильсену мазки микроскопируют с иммерсионной системой не менее 10 мин.

Люминесцентная микроскопия

Метод основан на проникновении в микробную клетку карболового производного флюоресцентного красителя (аурамина, родамина). При окраске флюоресцентным красителем аурамином-родамином микобактерии можно видеть при неиммерсионном 100-кратном увеличении. Более точен результат при окраске по Цилю-Нильсену карболфуксином и иммерсионной микроскопии при 1000-кратном увеличении. Именно окраска мазка по Цилю-Нильсену рекомендована при применении технологий DOTS. Микобактерии в этом случае выглядят светящимися желтыми палочками (рисунок 1, б). Метод имеет неоспоримые преимущества, так как позволяет при меньшем увеличении микроскопа просмотреть фактически весь мазок, так же этот метод экономически более эффективен, так как уменьшается время, затрачиваемое на просмотр мазков.

К недостаткам метода ЛМ следует отнести значительно более высокую стоимость люминесцентного микроскопа, при процедуре окрашивания- соблюдение и коррекция pH мазка, а также освобождение микобактерий в диагностическом материале (особенно в мокроте) от окружающей их слизи, которая препятствует проникновению флуоресцентного красителя в микробную клетку. Поэтому нецелесообразно использование ЛМ для нативной мокроты, но применять этот метод рекомендуется при исследовании мазков, приготовленных после центрифугирования из осадка материала, обработанного для культурального исследования и нейтрализованного после деконтаминации. Поэтому метод ЛМ следует применять в бактериологических лабораториях, где культуральное и микроскопическое исследование может быть произведено из одной и той же порции диагностического материала.

При гистологическом или цитологическом исследовании иногда можно обнаружить характерные для туберкулёза клетки, являющиеся результатом защитной реакции организма на внедрение туберкулёзной палочки. Наличие в цитограмме гигантских клеток Лангханса с несомненностью решает диагноз туберкулёза. Эти клетки имеют очень большие размеры (80 - 90 мкм и более в диаметре). Цитоплазма окрашена в серо-голубой цвет. По её периферии расположено в ряд большое количество ядер (до 20), расположенных в форме кольца (рисунок 1, в).

Другим признаком туберкулёза является присутствие в препарате так называемых эпителиоидных клеток, из которых и развиваются клетки Лангханса. Это происходит при увеличении количества ядер без разделения цитоплазмы, которая только увеличивается в размерах (рисунок 1, г).

Микроскопия позволяет быстро получить результат, но обладает низкой чувствительностью и специфичностью, невозможностью дифференциации кислотоустойчивых микобактерий.

Рисунок 1

Микобактерии туберкулеза
а - метод окраски по Цилю-Нельсену
б - метод люминисцентной микроскопии
в - клетки Лангхаса
г - эпителиоидные клетки

Культуральный метод

Исторически сложилось, что питательные среды на яичной основе (Левенштейна-Йенсена, Финна-2, Огавы, Аникина, "Новая", Попеску) получили наибольшее распространение среди плотных питательных сред, применяемых для выделения МБТ. Посев материала на среду Левенштайна-Йенсена проводят в бактериологической лаборатории. Рост первых колоний на классических средах отмечают через 4 - 8 недель. Однако появившиеся в последние годы агаровые среды Миддлбрука (7Н10, 7Н11) позволяют быстрее обнаружить рост микобактерий (от двух до четырех недель) и обеспечивают лучшие возможности для изучения морфологии колоний, чем на яичных средах. Недостатком агаризованных питательных сред является необходимость инкубации посевного материала в термостате с углекислым газом, поэтому агаризованные среды в России практически не применяются.

Следует отметить, что в связи с высокой избирательностью различных штаммов микобактерий и потребностью в полноценных белках до сих пор нет универсальной питательной среды, способной заменить все остальные. В Приказе № 109МЗ РФ для посева диагностического материала на МБТ рекомендуется использовать по одной пробирке международной питательной среды Левенштейна-Йенсена и Финна-2. Однако практика показывает, что кроме указанных сред целесообразно использовать и какую-либо из дополнительных, а посев на три пробирки питательной среды также повышает эффективность культуральной диагностики.

Для полноценной культуральной диагностики туберкулеза необходимо иметь соответствующие помещения и оборудование. Особенно важно наличие центрифуги и антиаэрозольной защитой и способностью обеспечить ускорение 3000g. А также шкафов биологической безопасности для предотвращения внутрилабораторного инфицирования.

Основным недостатком культуральной диагностики туберкулеза является длительность исследования - от трех недель до трех месяцев. Поэтому остаются актуальными дальнейшие исследования по разработке методов ускорения роста микобактерий.

Системы BACTEC

Культуральная диагностика туберкулеза переживает в настоящее время принципиальные изменения, связанные с внедрением в практику полностью автоматизированных систем культивирования МБТ. Главное отличие этих методов - применение жидких питательных сред для культивирования с последующей радиометрической (BACTEC 460), колорометрической (Mb-Bact, Вас- tALERT) и люминесцентной детекцией роста (BACTEC MGIT 960). Рост МБТ на жидкой питательной среде в этих системах удается обнаружить уже через 1 - 2 недели в зависимости от их исходного количества в диагностическом материале. Частота выявления микобактерий так же несколько выше, чем на плотных питательных средах. Автоматизированные системы BACTEC с использованием соответствующих флаконов, содержащих различные противотуберкулезные препараты, позволяют сократить время исследования лекарственной устойчивости микобактерий до 10 - 14 суток.

Из перечисленных автоматизированных систем наиболее эффективна в настоящее время система BACTEC MGIT 960BD. Флаконы MGIT с жидкой питательной средой 7Н9 содержат в придонной части под силиконом флуоресцентный индикатор, "погашенный" высокими концентрациями кислорода. При наличии роста микобактерий в процессе поглощения кислорода индикатор начинает светиться, регистрация флуоресценции в сисиеме BACTEC MGIT производится автоматически. Использование флаконов MGIT возможно и "вручную", тогда регистрацию свечения производят с помощью трансиллюминатора на флаконах MGIT составляет 11 суток.

Основным недостатком BACTEC MGIT, как и других систем BACTEC, является высокая стоимость оборудования (до 100000 долларов США) и флаконов с питательной средой - посев одной пробы диагностического материала стоит до 400 рублей.

Посев на L -формы микобактерий

Так называемые дефектные по клеточной стенке L-формы микобактерий и других инфекционных патогенов являются результатом изменчивости и основным видом персистирования, то есть переживания в неблагоприятных условиях. Посев на L-формы особенно эффективен при внелегочном туберкулезе, поскольку вегетация МБТ в очагах ВЛТ при повышенном ацидозе и анаэробиозе приводит к снижению их жизнеспособности и ферментативной активности.

Диагноз не может быть поставлен только на основании выявления L-форм микобактерий, но их обнаружение, особенно при верификации методом ПЦР, является весомым аргументом в пользу туберкулезной природы заболевания. В очагах внелегочного туберкулеза наблюдается ранняя L-трансформация микобактерий, поэтому их обнаружение позволяет поставить диагноз на начальных стадиях заболевания.

Читайте также: