Методические рекомендации по лабораторной диагностике легионеллеза

Обновлено: 27.03.2024

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ, БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Выявление бактерий Legionella pneumophila в объектах окружающей среды

1. Разработаны: Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Г.Ф.Лазикова, Ю.М.Федоров); ФГУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора (И.В.Брагина, М.В.Зароченцев, Э.Ф.Опочинский); ГУ "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи" РАМН (И.С.Тартаковский, Т.И.Карпова, Ю.Е.Дронина, Ю.С.Аляпкина, Ю.М.Романова, А.Л.Гинцбург); ФГУЗ "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" (А.Н.Куличенко, С.А.Портенко, Н.А.Осина, В.В.Кутырев); ФГУЗ "Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт" (Ю.М.Ломов, А.Н.Терентьев, Г.Л.Карбышев, Л.И.Шелохович, Г.Д.Харабаджахян, И.К.Савельева); ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в г.Москве" (Н.Я.Салова); Управлением Роспотребнадзора по г.Москве (Л.В.Родина); ФГУЗ Причерноморская ПЧС (В.И.Малай, Н.Д.Темежникова); Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф.Эрисмана (Г.М.Трухина); ГУП "Мосводоканал" (Г.П.Кашкарова); МГУ инженерной экологии (А.Н.Цедилин, Е.М.Иванникова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Роспотребнадзора (прот. N 1 от 29 марта 2007 г.).

3. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Г.Г.Онищенко 30 мая 2007 г.

1. Область применения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают методику проведения лабораторных исследований объектов окружающей среды по выявлению в них бактерий Legionella pneumophila - возбудителя болезни легионеров.

Проведение мониторинга объектов окружающей среды на наличие Legionella pneumophila позволит определить степень их контаминации возбудителем и дать оценку эффективности принимаемых мер в целях профилактики болезни легионеров и обеспечения безопасности здоровья населения.

1.2. Методические указания предназначены для применения в лабораториях учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации, осуществляющих контроль за объектами окружающей среды; в лабораториях других организаций, аккредитованных в установленном порядке на право осуществления контроля безопасности объектов окружающей среды на наличие возбудителя болезни легионеров.

1.3. Методические указания являются обязательными:

в ходе проведения противоэпидемических мероприятий и при эпидемиологическом расследовании возможных эпидемических вспышек и спорадических случаев болезни легионеров.

1.4. Предлагаемый метод выявления бактерий Legionella pneumophila в окружающей среде согласуется с международным стандартом ISO 11731 и руководством ВОЗ "Legionella and the prevention of legionellosis" (2006 г.).

2. Нормативные ссылки

2.3. СанПиН 2.1.2.1331-03 "Гигиенические требования к устройству, эксплуатации и качеству воды аквапарков".

2.5. МУК 4.2.1884-04 "Санитарно-микробиологический и санитарно-эпидемиологический анализ воды поверхностных вод".

2.6. Методические рекомендации МЗ СССР "Эпидемиология, клиника, лечение и профилактика легионеллеза", 1988.

2.7. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтов".

2.9. Методические указания МУ 3.5.5.1034-01 "Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I-IV групп патогенности, при работе методом ПЦР".

2.10. European Guidelines for Control and Prevention of Travel associated Legionnaires Disease, 2002.

2.11. ISO 1998.ISO 11731:1998 Water Quality-detection and enumeration of Legionella.

2.12. Legionella and the prevention of Legionellosis. - WHO guidelines. 2006.

3. Характеристика возбудителя болезни легионеров

Legionella pneumophila - грамотрицательная бактерия, возбудитель острых тяжелых пневмоний с высоким процентом летальных исходов (5-10%) и респираторных заболеваний. В природных условиях легионеллы обитают повсеместно в пресноводных водоемах, преимущественно в некультивируемой форме, и паразитируют в амебах и других простейших, не представляя серьезной опасности для человека. Размножение легионелл активно идет в теплой воде в диапазоне температур 25-45 °С, хотя их выделяют и из холодной воды.

Высокие адаптивные способности легионелл позволяют им успешно колонизировать искусственные водные системы - системы охлаждения и кондиционирования, градирни, компрессорные устройства, джакузи, фонтаны, медицинское оборудование и др. Условия для размножения легионелл в искусственных водных системах более благоприятны, чем в естественных, что приводит к накоплению в них возбудителя в высокой концентрации. Легионеллы активно колонизируют синтетические и резиновые поверхности промышленного, водопроводного, медицинского оборудования с образованием биопленок, в которых легионеллы значительно более устойчивы к действию дезинфицирующих веществ. В состав естественных биопленок помимо легионелл входят бактерии рода Pseudomonas, Klebsiella, Acinetobacter и др. Важная роль в персистенции легионелл в биопленках принадлежит амебам, в которых легионеллы активно размножаются перед образованием сложных биопленок в ассоциации с другими микроорганизмами.

Эпидемические вспышки и спорадические случаи болезни легионеров преимущественно выявляют в местах общественного назначения: у посетителей и персонала гостиниц; торговых, спортивных и выставочных комплексов; промышленных предприятий, больниц, учреждений; круизных судов и др. Фактором передачи служит водный мелкодисперсный аэрозоль, содержащий возбудителя и генерируемый системами водных коммуникаций.

Сочетание высокой концентрации легионелл в водной среде с источниками мелкодисперсного аэрозоля позволяет возбудителю инфекции вследствие ингаляции микробного аэрозоля попадать в нижнюю часть респираторного тракта и легкие человека, где происходит контакт с альвеолярными макрофагами, в которых вирулентные штаммы возбудителя активно размножаются.

При спорадическом легионеллезе и отдельных нозокомиальных вспышках заболевания возможна аспирация воды, контаминированной легионеллами без образования аэрозоля (бассейны, емкости для хранения и транспортирования воды и др.). Это обусловлено возрастанием восприимчивости к легионеллезу лиц со сниженной иммунологической реактивностью на фоне сопутствующих заболеваний, иммунодепрессивной терапии и др.

Эпидемические вспышки и спорадические случаи легионеллеза выявляют повсеместно. Особое значение в последние годы уделяется случаям болезни легионеров, возникающим во время поездок, путешествий и диагностируемым после возвращения из них. Инкубационный период составляет от 2 до 10 дней. Более 30% случаев спорадического легионеллеза, многочисленные эпидемические вспышки в гостиницах, на круизных судах послужили причиной создания международной системы эпидемиологического надзора за случаями легионеллеза, связанного с поездками.

В настоящее время известно около 50 видов легионелл, преимущественно выделенных из окружающей среды, из которых собственно болезнь легионеров вызывает вид Legionella pneumophila, насчитывающий 16 серогрупп. Причем более 80% случаев заболевания вызывают штаммы 1-й серогруппы. Среди других представителей рода Legionella в качестве микробов-оппортунистов, вызывающих заболевание при нарушении клеточного иммунитета и/или на коморбидном фоне, следует отметить L. micdadei, L. longbeachae, L. dumoffii и L. bozemanii. Остальные виды Legionella spp. не патогенны для человека.

4. Материально-техническое обеспечение*

* Указанное оборудование и расходные материалы могут быть заменены на аналогичные по характеристикам производства других фирм.

4.1. Средства измерения

рН метр - рН 410; диапазон рН от -1 до 14, точность 0,01 рН, температура анализируемой среды от -10 до 100 °С (Белоруссия)

Весы Adventurer - прецизионные одночашечковые электронные цифровые с функцией обнуления тары и другими вспомогательными функциями, стандартного уровня, максимальная загрузка - 210 г, погрешность при измерении - 0,001 г (OHAUS, США)

Весы ScoutPro - портативные одночашечковые электронные цифровые с функцией обнуления тары, максимальная нагрузка - 2000 г, погрешность при измерении - 0,1 г (OHAUS, США)

4.2. Оборудование

Шкаф сушильный стерилизационный ШСС-80П, поддерживающий температуру плюс (160±5) °С (Россия)

Термостат суховоздушный ТС-1/80, объем 80 л с температурой до 60 °С (Россия)

СО инкубатор МСО 5АС, персональный, объем 49 л, тепловая рубашка, ТС-датчик СО (Sanyo) или анаэростат GasPak 100 (на 11 чашек), GasPak 150 (на 36 чашек)

Стерилизатор паровой ВК-30 с вертикальной камерой, объем 150 л

Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды ГОСТ 6709-72

Облучатель бактерицидный настенный УФИК 1х30

Холодильник бытовой электрический с температурой в камере плюс 4-6 °С

Морозильная камера с температурой в камере до -20 °С

Водяная баня TW 2.03, автоматическое регулирование температуры до 85/90 °С, объем 8,5 л, внутренняя и внешняя циркуляция (Elmi, Латвия)

Батометр Молчанова ГР-18, предназначенный для взятия проб воды с различной глубины водоемов, с одновременным измерением температуры воды исследуемого слоя, при температуре окружающей среды от 1 до 40 °С (Россия)

Прибор для мембранной фильтрации под вакуумом с диаметром фильтрующей поверхности 35 или 47 мм и устройство для создания разрежения 0,5-1,0 атм. (САРТОГОСМ, Россия)

Прибор для подсчета колоний бактерий (Schuett)

Мешалка магнитная BioMMS-3000, без подогрева, максимальный объем 2 л, скорость вращения 0-3000 об./мин, размер платформы 150х150 мм

Универсальная центрифуга для пробирок до 50 мл "Ева 21" с роторами 6х50 мл (угловая скорость - до 6000 об./мин), 12х15 мл (угловая скорость - до 6000 об./мин), 30х2 мл (угловая скорость - до 12000 об./мин) (Hettich-Zentrifugen, Германия)

Микроцентрифуга/встряхиватель ТЭТА 2 (Биоком, Россия)

Малогабаритная высокоскоростная лабораторная микроцентрифуга "МиниСпин", угловая скорость - до 13400 об./мин, 12х1,5 (2,0) мл (Ерpendorf, Германия)

Твердотельный термостат Термо 24-15 с диапазоном рабочих температур от 0 до 120 °С (Биоком, Россия)

Охладитель проб ОП-1 с диапазоном температур oт -4 до 30 °С (Биоком, Россия)

Амплификатор Терцик МС-2 (ДНК-Технология, Россия)

Амплификатор iCycler для проведения ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени, оптический и реакционный модули, комплект фильтров iQ5 Optical System (BIORAD, США)



Артикул: 852-000
Производитель: Alere Inc., США
Экспресс-тест для определения антигена L.pneumophila (возбудителя Легионеллёза) в моче иммунохроматографическим методом.
Регистрационное удостоверение

ИХА тест "Binax NOW® Legionella" входит в стандарт оказания медицинской помощи, приказ МЗ РФ №741н от 9.11.2012 "Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи при пневмонии тяжелой степени тяжести с осложнениями": А26.28.010 Определение антигена возбудителя легионеллеза (Legionella pneumophila) в моче.

ИХА тест "Binax NOW® Legionella" входит в стандарты диагностики пневмонии, утвержденные в России:

В связи со сходством клинических проявлений и симптоматики легионеллезной и пневмококковой пневмонии быстрая и эффективная лабораторная диагностика приобретает решающее значение для выбора тактики этиотропной терапии больных.
В 1999 г. ВОЗ и в 2002 г. Европейской рабочей группой по легионеллезу в качестве диагностических критериев приняты стандарты, в соответствии с которыми диагноз легионеллеза в случае острой инфекции нижних дыхательных путей (клинически и рентгенологически подтвержденной) считается установленным:
1) при выделении культуры легионелл из отделяемого респираторного тракта или легочной ткани;
2) при 4-кратном или более нарастании титра специфических антител к Legionella pneumophila серогруппа 1 в реакции непрямой иммунофлюоресценции;
3) при определении растворимого антигена Legionella pneumophila серогруппа 1 в моче иммуноферментным (ИФА) или иммунохроматографическим методом (ИХА)

Тесты Бинакс одобрены FDA (Администрация по пищевым продуктам и лекарственным средствам США), и в настоящее время в более чем 90% случаев окончательного диагноза внебольничной пневмонии в мире устанавливается данным методом.

Выявление возбудителя пневмоний в моче ИХА методом включено в руководства по пневмонии Америки, Британии, Бразилии, Франции, Европы, Швеции, Испании, Канады:
Общество инфекционных болезней Америки/Руководства американского торакального общества по управлению внебольничной пневмонией у взрослых
Руководства британского торакального общества по управлению внебольничной пневмонией у взрослых:
Бразильские руководства по внебольничной пневмонии у имуннокомпетентных взрослых
Французские Руководства Лечение инфекций нижних дыхательных путей у иммунокомпетентных взрослы х
Европейские Руководства по управлению инфекциями нижних дыхательных путей у взрослых
Шведкие руководства по управлению внебольничной пневмонией у имуннокомпетентных взрослых
Руководства Испанского общество пульмонологии и торакальной хирургии
Канадские руководства по начальному управлению внебольничной пневмонии.

Предназначение:
Тест для определения возбудителя легионеллёза Binax NOW® Legionella – быстрый in vitro иммунохроматографический анализ для качественного определения антигена Legionella pneumophila серогруппы 1 в образцах мочи у пациентов с симптомами пневмонии. Он предназначен для помощи в постановке предположительного диагноза легионеллезной инфекции (болезнь легионеров), вызванной L. pneumophila серогруппы 1, в сочетании с культуральным и другими методами.
Аналогов данного теста нет ни Российского, ни Зарубежного производства.

В дополнение к быстрому тесту выпускается ИФА тест на легионеллу Binax® Legionella Urinary Antigen EIA для классического иммуноферментного анализа. ИФА тест-система на легионеллёз Binax® Legionella Urinary Antigen EIA предназначена для качественного определения Legionella pneumophila серогруппы 1 в образцах мочи, как дополнение к культуральному методу для постановки предположительного диагноза прошедшей или текущей болезни легионеров.

Binax NOW® Legionella – один из наиболее широко известных быстрых иммунохроматографических тестов для определения антигена возбудителя легионеллеза (Legionella pneumophila) в моче, благодаря его чувствительности, специфичности и простоте использования.

Время постановки: 15 минут
Чувствительность: 95%
Специфичность: 95%
Исследуемый образец: Моча
Количество тестов: 22
Индивидуальный анализ: Есть

Еще в начале 80-х годов прошлого века было показано, что в самом начале болезни (2-3-е сутки) антиген возбудителя можно обнаружить в моче больного легионеллезом, причем сам возбудитель в моче отсутствует. Антиген термастабилен и может быть выявлен в течение примерно 30 дней после начала заболевания. В 1989 г. метод был стандартизован компаниями Binax (США) и Biotest (Германия), испытан 14 лабораториями Европейских стран (включая лабораторию легионеллеза ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН) и был рекомендован в качестве высокоспецифичного и чувствительного метода, позволяющего поставить окончательный диагноз на первой неделе заболевания.

Если непосредственно после введения стандарта определения антигена L. pneumophila в моче данный метод использовали для диагностики менее чем в 5% случаев, то в настоящее время метод применяют для постановки окончательного диагноза более чем в 90% подтвержденных случаев легионеллезной инфекии. Превосходство данного метода над традиционными, включенными в стандарт бактериологическим и серологическим методами состоит, прежде всего, в сроках исследования. Бактериологический метод занимает не менее 4-5 суток, причем требуются инвазивные процедуры для получения материала (бронхоскопия, биопсия), так как из мокроты, особенно после начала элютропной терапии, возбудитель удается выделить далеко не всегда. Выявление диагностического нарастания титров антител в реакции непрямой иммунофлюоресценции возможно лишь на третьей неделе заболевания, когда проведен курс антибиотикотерапии и исход заболевания обычно уже ясен. Необходимость, исследования парных сывороток определяет ретроснективный характер диагностики легионеллеза данным методом.

4.2. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Выявление антигена бактерий Legionella pneumophila серогруппы 1 в клиническом материале иммунохроматографическим методом

1. Разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Г.Ф.Лазикова, Ю.В.Демина); ФГУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора (И.В.Брагина, М.В.Зароченцев, Э.Ф.Опочинский, И.В.Новокшоновой); ГУ "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи" РАМН (И.С.Тартаковский, Т.И.Карпова, Ю.Е.Дронина, В.Г.Нестеренко, А.Н.Ловенецкий, О.В.Садретдинова); ФГУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии (М.В.Храмов, С.Ф.Бекетов); ГНЦ биологического приборостроения (В.Н.Злобин, С.П.Ярков).

2. Рекомендованы к утверждению Лабораторным советом Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 23.09.08).

4. Введены впервые.

1. Область применения

1.1. Настоящие методические рекомендации предлагают методику проведения лабораторной диагностики легионеллеза на основе выявления антигена легионелл иммунохроматографическим методом.

1.2. Методические рекомендации предназначены для применения в лабораториях учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации, в лабораториях других организаций, осуществляющих лабораторную диагностику заболеваний верхних и нижних дыхательных путей.

1.3. Предлагаемый метод выявления бактерий Legionella pneumophila серогруппы 1 в клиническом материале согласуется с международными стандартами ВОЗ и Европейской рабочей группы по легионеллезу.

2. Термины и сокращения

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения.

ПЦР - полимеразная цепная реакция.

Нозокомиальный легионеллез - инфекционное заболевание легионеллезной этиологии, возникшее в период пребывания в лечебно-профилактической организации (ЛПО) или в течение 10-ти дней после выписки из него, а также связанное с процедурами, проводимыми в ЛПО любого типа.

Спорадический легионеллез - случаи легионеллеза, не связанные с пребыванием или получением процедур в лечебно-профилактической организации, а также с поездками и путешествиями.

3. Общие положения

По данным официальной статистики, среди населения Российской Федерации ежегодно регистрируется до 20 случаев легионеллезной инфекции. Однако современные исследования показывают, что удельный вес этой нозологической формы в общей структуре внебольничных пневмоний занимает порядка 6-14%. Время диктует необходимость более подробного изучения эпидемического процесса заболевания, которое уже приобрело определенное социальное значение, поражая людей во время путешествий, общественных мероприятий, дома и на работе.

В клинической картине заболевания отсутствуют патогномоничные симптомы. Подозрение на легионеллезную этиологию инфекции возникает в случаях тяжелого течения внебольничной пневмонии при наличии следующих факторов риска: теплое время года, возраст старше 40 лет, мужской пол, путешествие (отдых с выездом, командировка) внутри страны или за рубеж, совпадающее со сроком инкубационного периода (от 2 до 10 дней до начала заболевания), работа в туристических или гостиничных комплексах, занятость на строительных или земляных работах, наличие вредных привычек (курение, алкоголь, наркомания), наличие сопутствующих заболеваний, в первую очередь: диабет, сердечно-сосудистые заболевания, заболевания, сопровождаемые курсом гормональной или (и) интенсивной иммуносупрессивной терапии.

Легионеллез является серьезной инфекцией, часто приводящей к инвалидизации. Летальность в случаях позднего и неадекватного лечения может достигать 20%. Поэтому своевременная диагностика патологии приобретает особое значение, как для выбора соответствующей терапии и прогноза течения заболевания, так и для определения причинно-следственной связи формирования эпидемических очагов, организации адекватных санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий.

Читайте также: