Методика бактериологического исследования кормов на пастереллез

Обновлено: 24.04.2024

1.1. Пастереллезы - различные по локализации и характеру течения инфекционные болезни сельскохозяйственных, домашних и диких животных, птиц и человека, вызываемые бактериями рода Pasteriolla который включает в себя шесть видов: P.multocida, P.haemolytica, P.ureae, P.pneumotropica, P.aerogenes, P.gallinarum.

1.2. Ведущее этиологическое значение в инфекционной патологии животных и птиц принадлежит двум видам: P.muluocide, P.haemolytice.

P.muluocida является возбудителем геморрагической септицемии животных, холеры птиц, а также легочных пастереллезов, осложняющих респираторные инфекции вирусной и микоплазменной этиологии.

P.haemoytica вызывает у крупного рогатого скота и овец всех возрастов пневмонии, а также септицемию новорожденных ягнят.

Кроме перечисленных заболеваний эти два вида могут выделяться у коров и свиноматок при абортах, у овец и коров - при маститах, у телят и ягнят - при артритах и других локальных патологических процессах.

1.3. Краткие сведения о других видах пастерелл.

P.pneumotropica является возбудителем энзоотического заболевания мышей, кроликов и других лабораторных грызунов, которое проявляется поражением органов дыхания и образованием абсцессов.

P.ureae часто выделяют от человека при хроническом атрофическом насморке.

P.gallinarum встречается как комменсал верхних дыхательных путей птиц и иногда крупного и мелкого рогатого скота; имеет низкую вирулентность и чаще ассоциирует с хроническими респираторными инфекциями птиц.

P.aerogenes является постоянным обитателем кишечного тракта свиней.

1.4. Диагноз на пастереллезы устанавливают на основании эпизоотологических данных, клинических признаков, патологоанатомических изменений и результатов лабораторного исследования.

1.5. Лабораторная диагностика пастереллезов включает микроскопию мазков и отпечатков, выделение культур пастерелл и их идентификацию и при необходимости постановку биопроб.

1.6. Для исследования в лабораторию направляют 2 - 3 трупа мелких животных, от крупных животных - сердце с перевязанными сосудами, части селезенки, печени, почек, экссудат из грудной полости и трубчатую кость. При поражении легких берут также их кусочки (5×5 см) на границе нормального и измененного участков, миндалины, бронхиальные, средостенные и заглоточные лимфатические узлы.

Патологический материал берут от павших (не позднее 3 - 5 ч после гибели) или убитых животных, не подвергавшихся лечению антибактериальными препаратами.

Для диагностики пастереллеза у птиц в лабораторию направляют, кроме свежих трупов, 5 - 6 живых птиц с явными признаками болезни. Больную птицу убивают в лаборатории и делают высевы из костного мозга, сердца, печени и селезенки.

1.7. Взятие и доставку материала осуществляют в соответствии с действующими Правилами взятия патологического материала, крови, кормов, и пересылки их для лабораторного исследования.

2.1. посевы из патологического материала, перечисленного в п. 1.6, делают в МПБ и на МПА или бульон и агар Хоттингера рН 7,2 - 7,4 с добавлением 10 % нормальной сыворотки крови лошади (см. приложение пп. 1 - 4) или 5 - 10 % аминопептида-2.

2.1.1. Посев в пробирки с жидкими и твердыми питательными средами проводят пастеровской пипеткой. Пробирки с посевами инкубируют при 37 - 38° в течение 20 - 48 часов.

2.1.2. Одновременно с посевами из каждого органа делают мазки-отпечатки, фиксируют 10 - 15 мин смесью равных объемов этилового спирта и эфира, окрашивают по Леффлеру или Романовскому-Гимза и микроскопируют. В мазках из патологического материала пастереллы выглядят овоиды или короткие палочки с закругленными концами и заметной биполярностью, вокруг которых может быть видна прозрачная капсула.

2.2. В жидких питательных средах рост пастерелл сопровождается сначала слабым помутнением, затем через 24 - 36 часов возможно просветление среды и выпадение на дно пробирки осадка, поднимающегося при встряхивании в виде косички.

На сывороточном агаре или агаре с аминопептидом-2 пастереллы растут в виде прозрачных, средней (диаметром до 3 мм), округлых с ровными краями колоний слизистой консистенции, серого цвета.

На простых питательных средах без добавления сыворотки крови пастереллы растут не всегда удовлетворительно.

У выделенных культур изучают культуральные, тинкториальные и морфологические свойства. В мазках из культур при окраске по Граму пастереллы имеют вид грамотрицательных овоидов или коккобактерий, расположенных одиночно и попарно.

Идентификацию выделенных культур проводят по ферментативным свойствам и подвижности.

2.3.1. Суточную агаровую культуру высеевают в среды Гисса с глюкозой, маннитам, сахарозой, маннозой, в ПМА, молоко, желатин, на кровяной сывороточной МПА или агар Хоттингера (см. приложение п. 5), в МПБ с 1 % нитрата калия, в среду с мочевиной (см. приложение п. 6).

2.3.2. Для определения редукции нитратов исследуемые культуры засевают в МПБ с 1 % нитрата калия и выращиванием в течение 48 - 72 ч.

Затем в пробирку добавляют 1 см 3 2 %-ного водного раствора крахмала, 1 см 3 1 %-ного раствора йодистого калия и 1 - 2 капли 5 %-ного водного раствора серной кислоты и взбалтывают.

При положительной реакции среда приобретает окраску от темно-синего до коричневого цвета; при отрицательной - цвет среды желтый или слабо синий.

2.3.3. Индол выявляют с помощью индикаторных бумажек или по методу Легаль-Вейла. Индикаторные бумажки готовят из полосок фильтровальной бумаги длиной 10 - 12 см, пропитывая их горячей щавелевой кислотой, высушивают в термостате и хранят в банке с притертой пробкой.

С целью выявления индола в пробирку с МПБ после засева культуры под ватную пробку помещают полоску индикаторной бумажки с таким расчетом, чтобы нижний ее конец не касался среды, и инкубируют при 37 °С 24 - 72 ч. При выделении индола нижняя часть бумажки приобретает розовую окраску.

Метод Легаль-Вейла. В пробирку с суточной бульонной культурой пастерелл вносят 4 - 5 капель 5 %-ного водного раствора нитропруссида натрия, перемешивают и добавляют вначале такой же объем 40 %-ного водного раствора N₂OH, а спустя 1 - 2 мин 4 - 5 капель ледяной уксусной кислоты. При наличие индола бульонная культура приобретает сине-зеленую окраску.

2.3.4. Для определения уреазы в пробирку, содержащую среду с мочевиной, закапывают 2 - 3 капли 24-часовой изучаемой бульонной культуры. Посевы культивируют 20 - 24 ч. при 37 °С. При наличии фермента уреазы происходит покраснение среды.

2.3.5. Все виды пастерелл неподвижны, не свертывают молоко, не разжижают желатин, редуцируют нитраты, ферментируют с образованием кислоты без выделения глаза глюкозу, маннозу, сахарозу.

P.agrogenes в отличие от других видов ферментирует углеводы с выделением газа.

На кровяном сывороточном МПА или агаре Хоттингера P.haemolytica образует колонии с отчетливой зоной гемолиза, которая лучше просматривается после снятия колонии со среды. Остальные виды пастерелл гемолиза не вызывает.

2.3.6. Основные дифференцирующие признаки видов рода пастерелла представлены в таблице.

1.3. Краткие сведения о других видах пастерелл.

P.ureae часто выделяют от человека при хроническом атрофическом насморке.

P.aerogenes является постоянным обитателем кишечного тракта свиней.

Идентификацию выделенных культур проводят по ферментативным свойствам и подвижности.

P.agrogenes в отличие от других видов ферментирует углеводы с выделением газа.

2.3.6. Основные дифференцирующие признаки видов рода пастерелла представлены в таблице.

ПРАВИЛА БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ КОРМОВ

РАЗРАБОТАНЫ Всесоюзным научно-исследовательским институтом ветеринарной санитарии и специалистами Главного управления ветеринарии МСХ СССР.

УТВЕРЖДЕНЫ Главным управлением ветеринарии МСХ СССР 10 июня 1975 г.

1. ОТБОР ПРОБ И СОСТАВЛЕНИЕ СРЕДНЕГО ОБРАЗЦА

1.1. Настоящие правила регламентируют единые методы бактериологического исследования кормов животного и растительного происхождения, комбикормов и рыбной муки.

1.2. Отбор проб для бактериологического исследования при наличии затаренной продукции проводят согласно следующей таблицы.

Объем партии в упаковочных единицах

От каждой упаковочной единицы

От 10 упаковочных единиц

От 10 упаковочных единиц и дополнительно по 3 из каждых 100 упаковочных единиц

Примечание. 1 мешок = 1 упаковочной единице.

1.3. При наличии незатаренной продукции пробы берут не менее чем из 20 мест однородной партии со всей площади насыпи. Пробы можно отбирать в том же количестве с периодическими интервалами при погрузке и выгрузке из транспортных средств и бункеров.

1.4. Однородной партией считается количество корма, которое изготовляется по единой технологии в одну смену, затаренное в мешки или в незатаренном виде (насыпью) и доставленное одним видом транспорта.

1.5. Отбор проб проводят сухим, стерильным пробным щупом. После взятия проб от каждой партии пробный щуп очищают и дезинфицируют. Вес первичной пробы должен быть не менее 100 г.

1.6. Для бактериологического исследования от каждой партии корма составляют два средних образца весом не менее 500 г. Один из них направляют в лабораторию, а другой сохраняют на предприятии (хозяйстве) до окончания исследования.

1.7. Для упаковки средних образцов применяют стерильную пластмассовую или стеклянную тару.

1.8. Об отборе проб составляют акты в двух экземплярах. Акты должны содержать следующие данные: название предприятия (хозяйства), вид продукции, объем (вес) партии, вид упаковки (тары), дату изготовления, дату отбора проб.

2. МЕТОДЫ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Определение общего количества микробных клеток

2.1.1. В стерильную пробирку помещают 1 г корма, взятого из среднего образца (взятие корма для навески одноразовое), добавляют 9 мл физиологического раствора и тщательно встряхивают (получают разведение 1 : 10). Из полученной взвеси готовят последующие разведения (1 : 100,1 : 1000,1 : 10000,1 : 100000,1 : 1000000). После оседания взвешенных частиц из верхнего слоя жидкости делают посевы.

Для количественного учета микробного обсеменения в стерильные бактериологические чашки вносят по 1 мл каждого разведения и заливают 10-15 мл стерильного, расплавленного и охлажденного до температуры 44-45 °С мясо-пептонного агара. Осторожно покачивая чашки, засеянный материал равномерно распределяют в агаре. После застывания среды чашки помещают (вверх дном) в термостат при температуре 37 °С.

Например, в одной чашке оказалось 200 колоний, в другой - 21 и третьей - 1. В эти чашки посев проводили из пробирок с разведениями соответственно 1 : 10 000, 1 : 100 000, 1 : 1 000 000. Следовательно, 1 г корма содержит

2.2. Исследования на сальмонеллы

2.2.1. Метод последовательного обогащения. Навеску исследуемого материала 50-200 г (50 г от 10 и менее, 100 г от 10 до 100 и 200 г от 101 и выше упаковочных единиц) измельчают в стерильной фарфоровой ступке и помещают в колбу, содержащую среду предварительного обогащения (пептонная вода, МПБ с содержанием 5% маннита) при соотношении материала и среды 1:5.

Содержимое колбы тщательно перемешивают и помещают в термостат при температуре 37 °С. Через 16-18 ч производят посевы на бактериологические чашки с твердыми дифференциально-диагностическими средами: висмут-сульфит агар, средой Плоскирева или Левина (по две чашки) и на две (по выбору) основные среды обогащения (селенитовый бульон, магниевую среду, среды Киллиана, Мюллера, Кауфмана) в соотношении 1 : 5. Лучшими являются селенитовый бульон и магниевая среда.

После 16-18 ч выдерживания в термостате при 37 °С из обогатительных сред бактериологической петлей производят вторично посевы на чашки с твердыми дифференциально-диагностическими средами, которые помещают в термостат при 37 °С.

Засеянные чашки просматривают через 16-24-48 ч.

На висмут-сульфит агаре S.typhi и S. paratyphi А растут в виде мелких, нежных, серовато-зеленых колоний с черным центром; S. choleraesuis - в виде зеленых колоний. Колонии почти всех других сальмонелл значительно крупнее, темно-коричневого цвета с металлическим блеском, окруженные светлым ореолом, цвет участка среды под колонией черный.

На среде Плоскирева сальмонеллы растут в виде прозрачных или нежно-розовых колоний, на среде Левина - прозрачные, бледные, нежно-розовые или розовато-фиолетовые колонии.

В случае обнаружения колоний, подозрительных на сальмонеллы, 3-5 из них засевают на комбинированную среду Ресселя или на двусахарный (лактоза, глюкоза) агар, а лучше на трехсахарный (лактоза, глюкоза, сахароза), "скошенный столбик" с мочевиной.

Высев колоний из чашек также делают на короткий пестрый ряд, включающий скошенный агар и среды Гисса с лактозой, глюкозой и сахарозой, а также на бульон Хоттингера для определения индола и сероводорода (в этих целях под пробку пробирки с бульоном вкладывают специальные индикаторные бумажки). Для определения подвижности культуры производят посев уколом в полужидкий агар (0,3-0,5%).

На среду Ресселя и "скошенный столбик" посевы делают сначала штрихом на скошенной поверхности, а затем уколом в глубину столбика. При разложении лактозы косая поверхность окрашивается в синий цвет (при индикаторе ВР). При разложении одной глюкозы окрашивается только столбик среды и происходит разрыв агара со скоплением в нем пузырьков газа. При разложении мочевины в "скошенном столбике" окраска среды меняется на оранжевую при индикаторе ВР и на коричнево-фиолетовую при индикаторе тимоловый синий в сочетании с индикатором Андраде. Посевы выдерживают в термостате при температуре 37 °С 16-18 ч.

Культуры, ферментирующие лактозу, глюкозу и сахарозу с образованием газа и расщепляющие мочевину, отбрасывают. Культуры, не ферментирующие лактозу и сахарозу и не расщепляющие мочевину, подлежат дальнейшему исследованию. Изучают морфологию культуры в мазке, окрашенном по Граму, и подвижность (в висячей или раздавленной капле или в полужидком агаре).

Культуры, представляющие грамотрицательные подвижные палочки, ферментирующие глюкозу с образованием газа, не ферментирующие лактозу и сахарозу, не разлагающие мочевину и не образующие индол, подвергаются серологическому исследованию - испытанию в реакции агглютинации на предметном стекле с набором агглютинирующих сывороток.

Для реакции агглютинации используют культуры, выращенные на среде Ресселя или на двусахарном или трехсахарном агарах. При этом для реакции агглютинации с О-сыворотками культуру следует брать из верхней части скошенного агара, а для агглютинации с Н-сыворотками - из самой нижней части (конденсационной воды), где микробы наиболее подвижны.

Исследование культуры начинают реакцией агглютинации с поливалентной адсорбированной О-сывороткой основных серологических групп A, B, C, D, E.

На предметное стекло наносят каплю сыворотки и культуры, тщательно смешивают и в течение 2 мин наблюдают склеивание (агглютинацию) частиц. Культуры, дающие положительную реакцию агглютинации с поливалентной сывороткой, также проверяют с монорецепторными агглютинирующими сыворотками. Сначала с помощью монорецепторных О-сывороток устанавливают принадлежность культур к той или иной серологической группе. Установив серологическую группу, к которой отнесена данная культура, последнюю проверяют монорецепторными Н-сыворотками сначала первой фазы, а потом второй, определяя таким образом серологический тип бактерий в соответствии со схемой Кауфмана-Уайта.

2.3. Метод "двойного центрифугирования"

2.3.1. Первый день исследования. К 100 г исследуемого корма, помещенного в стерильную колбу, добавляют 500 мл физиологического раствора, энергично взбалтывают в течение 5 мин и помещают в термостат при температуре 37 °С. Через 6-8 ч колбу вынимают из термостата, встряхивают, затем содержимое отстаивают в течение 5-10 мин. Набирают 20-25 мл надосадочной жидкости, вносят в 4 центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 20 мин при 4000 оборотах в 1 мин.

Надосадочную жидкость из центрифужных пробирок удаляют и к осадку добавляют среды обогащения: Киллиана, Мюллера, жидкую среду Плоскирева (но не менее двух). После тщательного перемешивания пробирки помещают в термостат при температуре 37 °С на 5-6 ч для подращивания микрофлоры осадка. После этого пробирки вновь центрифугируют при тех же режимах.

Из центрифужных пробирок производят посевы на плотные дифференциально-диагностические среды: висмут-сульфит агар и среду Плоскирева, для чего из каждой пробирки материал отбирают пастеровскими пипетками и вносят на 2-3 чашки по 1-3 капли и равномерно распределяют его шпателем по всей поверхности среды. Засеянные чашки помещают в термостат.

К оставшемуся в центрифужных пробирках осадку добавляют ту же обогатительную среду, которая была удалена после центрифугирования, и продолжают инкубацию до следующего дня. Колбы с кормом после отбора необходимого количества материала оставляют в термостате также до следующего дня.

Определение биохимических свойств культур проводят ускоренным методом, для чего применяют пастеровские пипетки, в которые насасывают каплю взвеси исследуемой культуры, а затем небольшое количество тех или иных углеводов. Результаты учитывают по ферментации углеводов после выдерживания пипеток в термостате при 37 °С в течение 2-3 ч.

2.3.3. Третий день исследования. Производят просмотр чашек с твердыми средами, засеянными во второй день исследования, и проверяют биохимические и серологические свойства выделенных культур для определения серологического типа бактерий в соответствии со схемой Кауфмана-Уайта.

2.4. Люминесцентный метод обнаружения сальмонелл

2.4.1. Из средней пробы берут 100 г корма, разводят стерильным физиологическим раствором в соотношении 1 : 5 и выдерживают в термостате 6-8 ч при температуре 37 °С. Из полученной смеси готовят 2 мазка на обезжиренных стеклах нанесением суспензии бактериологической петлей на площадь 1 см, обозначенную восковым карандашом на обратной стороне. Мазки высушивают на воздухе при комнатной температуре или в термостате, фиксируют этиловым спиртом 15 мин и ополаскивают дистиллированной водой в течение 5-10 с.

2.4.2. На высушенные мазки, помещенные на мостик бактериологических чашек с влажным тампоном (для предотвращения высыхания сыворотки), наносят 1-2 капли рабочего разведения люминесцирующей поливалентной сальмонеллезной сыворотки. При необходимости определения групповой принадлежности сальмонелл применяют групповые люминесцирующие сальмонеллезные сыворотки. Мазки выдерживают во влажной камере в течение 30 мин при комнатной температуре или 15 мин в термостате при 37 °С. Затем мазки дважды по 10 мин промывают 0,15 М раствором хлористого натрия, ополаскивают дистиллированной водой и вновь высушивают.

При проведении бактериологического исследования на пастереллез и дифференциации выделенных культур от возбудителей рожи свиней и листериоза необходимо учитывать, что пастереллы в мазках-отпечатках из паренхиматозных органов, окрашенных синькой Леффлера, по Романовскому—Гимзе или Граму, представляют собой короткие с закругленными концами овоидные палочки-биполяры.
При росте на простом, аминопептидном, сывороточном и яичном МПА колонии пастерелл серовато-белого цвета, прозрачные, крутые, выпуклые, с ровными краями, их диаметр достигает 2—3 мм.

Первичный рост может быть также в виде тонкого налета на поверхности среды. На необогащенном МПА пастереллы растут в виде нежных, мелких росинчатых колоний, слегка опалесцирующих в проходящем свете. В первые дни выращивания (24 —48 ч) в МПБ пастереллы дают легкое равномерное помутнение среды, на 4—5-й день на дне пробирки образуется характерный слизистый осадок, поднимающийся при встряхивании в виде неразбивающейся косички, с полным просветлением бульона. В мазках, приготовленных из бульонных и агаровых культур, пастереллы имеют вид мелких (0,4—0,8 мкм) грамотрицательных коккобактерий.

Для идентификации пастерелл культуры высевают на среды Гисса. Пастереллы разлагают глюкозу, сахарозу, сорбит и маннит с образованием кислоты без газа, не разжижают желатин, образуют индол и, как правило, не образуют сероводород. Вирулентность выделенных культур пастерелл определяют путем постановки биологической пробы.
Пастереллы — это единый род бактерий с одинаковыми морфологическими, культуральными и ферментативными свойствами, но различающиеся по вирулентным свойствам, выявляемым в биопробе.
Диагноз пастереллеза проводят в соответствии с показателями, приведенными в таблице.

Табл. Дифференцирующие признаки бактерий пастелеллеза.

Окраска по Граму

Ветеринарно-санитарная оценка при пастереллезе, роже свиней и листериозе.
Туши и все субпродукты от больных и подозрительных по заболеванию животных выпускать в сыром виде запрещается.
При истощении и наличии дегенеративных или других патологических (абсцессы) изменений в мускулатуре - туша со всеми внутренними органами подлежит утилизации.
При отсутствии патологических изменений в туше и внутренних органах решение об использовании их принимают после бактериологического исследования (за исключением листериоза) на сальмонеллы; при обнаружении в мышцах или внутренних органах сальмонелл внутренние органы направляют на утилизацию или уничтожают, а туши выпускают после проварки или перерабатывают на консервы.
При отсутствии патологических изменений в мускулатуре туши, но отрицательном результате бактериологического исследования на сальмонеллы туши обезвреживают действием высокой температуры (проварка, изготовление мясных хлебов и консервов) по установленным режимам, а внутренние органы направляют на утилизацию или уничтожение. При отсутствии сальмонелл тушу, шпик и внутренние органы разрешается перерабатывать на вареные или варено-копченые колбасы, а также на варено-копченые грудинки и корейки или консервы с соблюдением установленного термического режима или направляют на проварку.
Внутренние органы, кишки и кровь, имеющие патологические изменения, а также головы от больных листериозом животных во всех случаях направляют на утилизацию с обезвреживанием при температуре не ниже 100 °С или проварку при этой же температуре в течение 1 ч.
Шкуры дезинфицируют согласно наставлению по их дезинфекции. При пастереллезе птицы внутренние органы утилизируют, тушки направляют на проварку, прожарку или на переработку на консервы. При листериозе — голову и пораженные органы утилизируют. Тушки и непораженные органы проваривают. При рожистой септицемии внутренние органы утилизируют, а тушку при отсутствии изменений в мышцах проваривают, при наличии дегенеративных изменений утилизируют.

При подозрении на листериоз бактериологическая диагностика включает микроскопическое исследование исходного материала, посевы на питательные среды, идентификацию выделенных культур по культурно-биохимическим и серологическим свойствам, а также постановку биологической пробы на лабораторных животных.
Морфологические и культуральные свойства. Микроскопическому исследованию подвергают тонкие мазки-отпечатки из головного мозга, внутренних органов и тканей. При приготовлении мазков-отпечатков - чистым предметным стеклом 3—4 раза прикасаются к поверхности среза органа. Мазки готовят непосредственно из материала, а также после выдержки (подращивания) проб в термостате в течение 4—6 часов. Мазки окрашивают по Граму, а также методами флуоресцирующих антител.
Возбудитель листериоза — полиморфная, чаще палочковидная бактерия длиной 0,5—2,0 мкм; она хорошо окрашивается всеми анилиновыми красками, грамположительна (однако в старых культурах могут встречаться единичные грамотрицательные палочки).

Люминесцентно-серологическое исследование проводят с использованием прямого и непрямого методов флуоресцирующих антител в соответствии с Наставлением по лабораторной диагностике листериоза животных (от 1971 г. с изменением от 31 июля 1974 г)*. С помощью двух методов можно идентифицировать возбудителя в культурах, обнаружить листерии в органах и тканях, а также определить их серогрупповую принадлежность.
Для выделения культуры листерий из органов и обязательно из головного мозга проводят обильные множественные посевы или предварительно готовят суспензию из головного мозга и паренхиматозных органов на физиологическом растворе в соотношении 1 : 5 и из нее делают посевы. Для культивирования листерий используют обычный или печеночный агар и бульон с добавлением 1% глюкозы и 2—3% глицерина (pH среды 7,2—7,4), а также кровяной агар и специальные среды.
При хранении патологического материала в холодильнике при +4 °С происходит размножение и накопление листерий. Поэтому в качестве дополнительного метода рекомендуется часть исследуемого материала помещать в холодильник и сохранять в течение 30 дней для проведения повторных исследований через каждые 10 дней при отрицательном результате первичного посева. Посевы инкубируют в термостате при 37 °С с ежедневным просмотром в первые 3—4 дня. При отсутствии роста наблюдение за посевами проводят в течение 2 недель.
Характерным для возбудителя листериоза является легкое помутнение бульона и появление мелких росинчатых колоний на агаре, наличие бетта-гемолиза на кровяном агаре. Просмотр посевов на плотных средах целесообразнее проводить с использованием осветителя ОИ-19 с голубым фильтром в проходящем свете: колонии листерий имеют в отличие от колоний других микроорганизмов голубую окраску с зеленоватым оттенком и мелкозернистую структуру. Выделенные культуры изучают микроскопически с окраской мазков по Граму, а также с применением прямого и непрямого методов флуоресцирующих антител.
При получении смешанной культуры ее очищают общепринятыми методами, а также путем заражения молодых белых мышей массой до 16 г. Определение подвижности проводят методом висячей или раздавленной капли. На подвижность исследуют 6 — 12-часовую бульонную культуру, выращенную при комнатной температуре. Листерии, выращенные при данной температуре, обладают активной подвижностью.
Для определения ферментативных свойств чистую культуру пересевают на пестрый ряд (глюкоза, мальтоза, рамноза, салицин, трегалоза, дульцит, инулин, раффиноза). Листерии разлагают с образованием кислоты (без газа) глюкозу, мальтозу, рамнозу, салицин, трегалозу и не разлагают дульцит, инулин, раффинозу.
Ставят пробу на каталазу. К суточной бульонной культуре добавляют равный объем свежеприготовленного 5%-ного пероксида водорода, при исследовании агаровой культуры в пробирку вносят несколько капель пероксида водорода. При наличии фермента каталазы пероксид водорода разлагается с образованием пузырьков газа (пены). Способность выделять фермент каталазу является характерным признаком листерий.
Для дифференциации листерий от возбудителя рожи свиней можно использовать индикаторные среды, метод основан на редукции и оксидации красок в средах при выращивании листерий.
Исследуемую бульонную культуру или смыв агаровой культуры засевают в объеме 2—4 капель не менее чем на 2 индикаторные среды: например, с нейтральным красным в смеси с метиленовой синью, метиловым красным. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при температуре 37—38 °С вместе с контрольными (незасеянными) средами. Результат учитывают через 3; 6; 24 и 48 ч.
Возбудитель листериоза через 3—6 ч обесцвечивает среду с нейтральным красным в смеси с метиленовой синью до цвета бульона, лишь у поверхности на границе с воздухом остается окрашенный ободок. При встряхивании цвет частично восстанавливается, поэтому посевы просматривают, не встряхивая пробирки. Среда с метиловым красным обесцвечивается через 3—6 ч, но восстановления цвета среды не происходит, Контролем служат незасеянные индикаторные среды. Возбудитель рожи свиней не обесцвечивает ни одну из вышеуказанных сред.
Серотипизация. Серологическая идентификация листерий проводится с поливалентной листериозной агглютинирующей сывороткой, представляющей собой смесь кроличьих листериозных агглютинирующих сывороток и содержащей факторы (антитела) Н-АВ и О-II, V, VII, IX. Поливалентная сыворотка в капельной реакции агглютинации на стекле агглютинирует все известные серотипы и подтипы листерий. Типовые сыворотки агглютинируют культуры листерий соответствующих типов ("серогрупп"). Сыворотка 1-го серотипа (серогруппы) содержит 0-фактор II, а сыворотка 2-го серотипа (серогруппы) — О-факторы V, VI. Серологическая типизация листерий осуществляется в соответствии с Наставлением по лабораторной диагностике листериоза.
Постановка биологической пробы. Для определения вирулентных свойств ставят биопробу. Биологическое исследование проводят на 2—3 белых мышах массой 18 г. Суспензию из головного мозга и внутренние органов или культур вводят животным под кожу или внутрибрюшинно в дозе 0,3—0,5 см3. Для повышения эффективности биопробы мышам за 3 —4 ч до заражения инъецируют внутримышечно кортизон в дозе 5 мг. При положительной биопробе животные погибают через 2—6 сут после заражения. При вскрытии отмечают множественные некротические очажки в печени, селезенке, почках. В отдельных случаях этих поражений может не быть.
Очень чувствительны к подкожному заражению 5 - 6-дневные мыши-сосуны, которые гибнут через 18—36 ч. К заражению листериями восприимчивы и кролики при внутривенном заражении культурой листерий в дозе 0,5 — 1 млрд. микробных тел .
Из внутренних органов павших животных делают мазки-отпечатки и высевы на питательные среды. Срок наблюдения за подопытными животными - 14 сут.

Дифференциация листерий от возбудителя рожи.
При бактериологическом исследовании мяса на листериоз и рожу свиней (срок исследования — 7 лет) проводят дифференциацию выделенных культур по морфологическим, биохимическим признакам и вирулентности (данные представлены в табл.).

Таблица. Дифференцирующие признаки листерий и возбудителя рожи свиней

Признак	Возбудидель листериоза	Возбудитель рожи свиней
Морфология в мазках - отпечатках	Неспорообразующие короткие палочка с закругленными концами. Располагаются поодиночке, попарно, в форме римской цифры V .	Неспорообразующие, тонкие, прямые или слегка изогнутые палочки, иногда нити.
Рост на МПА	Мелкие росинчатые, прозрачные колонии. Через 2-3 суток наблюдается помутнение колоний.	Мелкие росинчатые, прозрачные колонии.
Рост на МПБ	Небольшое помутнение с образованием слизистого осадка, поднимающегося при встряхивании в виде косички.	Легкое помутнение, поднимающегося при встряхивании осадок в виде облака.
Морфология в мазках из культуры	Короткие, прямые, овоидные палочки, иногда почти кокки, располагаются поодиночке или кучками.	Короткие, прямые или слегка изогнутые палочки; При хроническом течении инфекции- как короткие, тонкие палочки, так и удлиненные цепочки и нити.
Окраска по Граму	Положительная	Положительная
Подвижность	Подвижен в молодой 6-12 часовой культуре, выращенной при комнатной температуре.	Неподвижен
Салицин	Разлагает	Не разлагает
Проба на каталазу	Положительная	Отрицательная
Индикаторные среды	Обесцвечивает	Не обесцвечивает
РА с позитивной листериозной сывороткой	Положительная	Отрицательная
Коньюктивальная проба на морских свинках	Положительная	Отрицательная
Внутрикожная проба	Положительная	Отрицательная

При необходимости дополнительной дифференциации бактерий листериоза от бактерий рожи свиней применяют посевы: на питательный желатин, на углеводную среду с салицином, на мясо-пептонный печеночный агар с 0,01 % теллурита калия, на мясо-пептонный агар с кровью, а также ставят конъюнктивальную пробу на морских свинках.
Бактерии листериоза в отличие от бактерий рожи свиней на желатине дают медленный рост в виде узловатой нити с неровными краями и пушистыми отростками, желатин не разжижают, ферментируют салицин, вызывают гемолиз на агаре с кровью, растут на мясо-пептонном печеночном агаре с 0,5 % глюкозы, 3 % глицерина и 0*01 % теллурита калия в виде мелких черных колоний и вызывают кератоконъюнктивит у морских свинок.

И в заключение - фильм, созданый специалистами ВНИИМП, о пищевом листериозе и методах его определения в продуктах питания:

Читайте также: