Методики по созданию инфекционных фонов

Обновлено: 24.04.2024

В статье представлены и обсуждаются результаты применения различных методов создания инфекционного фона Pyricularia oryzae для проведения фитопатологической оценки устойчивости селекционных материалов риса к пирикуляриозу и отбора болезнеустойчивых сортов и линии риса. Экспериментальным путем установлено, что наиболее эффективным лабораторным методом создания инфекционного фона является инокуляция отрезки листьев растений риса фильтровальной бумагой, пропитанной конидиальной суспензией гриба и инокуляция отрезки листьев растений риса каплями конидиальной суспензии патогена.

Введение

Одним из опасных заболеваний риса во всем мире, в том числе и в Казахстане, является пирикуляриоз, вызываемый несовершенным грибом Pyricularia oryzae Br. et Cav. (синоним Magnaporthe grisea (Hebert) Barr) 3. Впервые оно было описано в Японии в 1704 г., а его возбудитель – в 1896 г. Сейчас пирикуляриоз известен во всех районах возделывания риса [1]. Патоген поражает все надземные органы растения, что приводит к потере урожая на 30-60%, а в годы эпифитотий – на 80-100% 4.

Наиболее практичным и экономичным подходом в борьбе с пирикуляриозом риса является использование сортов, устойчивых к болезни. Определение устойчивости растений к патогену базируется на создании жесткого инфекционного фона и провокационных условий при возделывании культуры. Инфекционный фон может быть естественным и искусственным. При этом естественный инфекционный фон непостоянен и может варьиро-вать в пределах одного года и в разрезе отдельных лет, так как погодные условия не всегда благоприятствуют развитию, интенсивному размножению и распространению возбудителя болезни. В годы с умеренным и слабым развитием болезней гарантированную оценку болезнеустойчивости обеспечивает искусственное заражение растений, которое можно осуществлять как в полевых инфекционных питомниках, так и в условиях искусственного климата – теплицах и климатических камерах [6, 7].

В связи с этим, фитопатологии и селекционеры в своей работе в основном использует искусственный инфекционный фон для определения вирулентности гриба и отбора устойчивых сортов растений. Следовательно, изучение иммунологических свойств исходного и селекционного материала при искусственном заражении растений позволяет выявлять потенциальную и стабильную устойчивость сортообразцов, проводить своевременную браковку и отбор невосприимчивых форм на всех этапах селекции, что значительно ускоряет селекционный процесс, сокращая сроки выведения новых сортов культуры [8].

Успешная инокуляция может быть осуществлена при наличии ряда благоприятных условий [9]:

  • оптимальная температура для прорастания спор, конидии или развития мицелия гриба;
  • высокая влажность на поверхности листьев для прорастания спор;
  • качество и интенсивность освещения;
  • растения должны быть в достаточно восприимчивой физиологической стадии развития;
  • инокулюм должен быть наиболее эффективно распределен на растении.

К настоящему времени разработаны различные способы и методы создания инфекционного фона возбудителем P.oryzae. Однако не все известные методы являются эффективными для оценки устойчивости сортов риса к болезни. Прежде чем провести массовый скрининг сортов риса на устойчивость, необходимо выбрать эффективного метода по созданию инфекционного фона, что сказывается на качестве проведения эксперимента. Кроме того, проведение фитопатологических и иммунологических исследований в Казахстане лимитируется отсутствием коллекции изолятов возбудителя пирикуляриоза, не разработанностью полевых и лабораторных методик оценки болезнеустойчивости с использованием современных методов.

Материалы и методы

В качестве инфекционного материала использована смесь из казахстанских изолятов возбудителя P. oryzae, которые выделены в 2013-2014 гг. и культивированы на картофельно-декстрозном агаре. Для приготовления суспензии культуру гриба с поверхности агара соскабливали шпателем и суспензировали в стерильной воде. Полученную суспензию фильтровали и разводили водой до необходимой концентрации. Для проведения инокуляции растений были использованы Твин 80 и желатин.

На основании анализа литературных данных подобраны четыре метода инокуляции растений риса возбудителем P. oryzae, которые были использованы в данной работе:

  • метод опрыскивания [2, 10, 11];
  • смазывания листьев суспензией гриба [12];
  • инокуляция отрезки листьев каплями суспензией гриба [13];
  • инокуляция отрезки листьев фильтровальной бумагой пропитанной суспензией гриба [14].

Количество спор в суспензии (на 1 см2 площади колонии) определяли с помощью камеры Горяева по формуле:


Микроскопические работы проводили с помощью цифрового микроскопа (MC 300TS, Австрия), анализ микроскопических изображений проведен по компьютерной программе Motic Images 2000-1.3. Освещенность измеряли люксметром Ю-116.

Результаты и их обсуждение

На основе полученных результатов, можно считать, что метод заражения каплями конидиальной суспензии патогена имеет ряд преимуществ. Во-первых, данный метод позволяет, определит патогенность гриба в контролируемой среде, т.к. эксперименты выполняются в лабораторных боксах, и поэтому нет риска распространения гриба. А во- вторых метод экономичен во времени, не требует много растительного материала, изолята гриба, много места в лаборатории. Кроме того, использование данного метода позволяет одновременно заразить одних и тех же образцов несколькими изолятами болезни. Результаты исследований показаны на рисунке 1.



Результаты лабораторных экспериментов показали, что конидии пирикуляриоза риса можно поместить на растения разными способами. При этом дана характеристика к четырем методам заражения сортов риса возбудителем P. oryzae (суммировано в таблице 1).

Таблица 1 – Основные параметры методов заражения риса возбудителем P. Oryzae

Основные параметры методов заражения риса возбудителем P. Oryzae

Как видно из данных таблицы 1, что почти все применяемых методов можно использовать с водным носителем. Чтобы сохранить конидии в суспензии, необходимо добавит нефитотоксичный смачивающий агент, такой как Tвин 20 и желатин, а так же для заражения может быть использован опрыскиватель, щетка, фильтровальная бумага, шприц или микропипетка. Установлено, что процесс инфицирования проростков риса возбудителем P. oryzae происходит в интервале температур 22-28 оС с удлинением влажного периода до 48 ч. По литературным данным [12] наиболее благоприятной можно считать температуру, близкую к 26 оС, при которой первые признаки заражения проявляются уже после 4 сут заражения. Чем больше температура воздуха отклоняется от оптимальной (26 оС) в ту или иную сторону, тем требуется больший период увлажнения для инфицирования и проявления признаков пирикуляриоза на растениях.

Следует отметить, что для освещения растений мы использовали световую установку, состоящую из ртутно-дуговых люминесцентных ламп высокого давления (ДРЛ-2000), следовательно, в опытах освещенность была в пределах 10-20 тыс. люкс. При использовании отдельных методов затраты времени и труда значительны, но риск контаминации минимален и в научном плане высокоэффективен. В любом случае выбранный метод зависит от цели инокуляции, количества инокулируемых растений, количества пригодного инокулюма и материально-технической возможности экспериментатора.

Работа выполнена в рамках программы грантового финансирования Республики Казахстан на 2013-2015 гг. (грант №2495/ГФЗ).

Для создания в полевых условиях искусственного инфекционного фона почвообитающих возбудителей болезни (Fusarium, Pythium, Sclerotinium, Rhizoctonia) применяют метод монокультуры восприимчивого растения-хозяина в течение нескольких лет. Накопление инфекции можно ускорить искусственным заражением почвы путём внесения растительных остатков или почвы с участков, на которых отмечено эпифитотийное развитие заболевания. Размноженную на питательных средах чистую культуру патогена можно внести на поле при посеве и два — три раза в течение вегетационного периода. Последний приём применяется не только для почвообитающих грибов, бактерий и нематод, но и для зимующих стадий факультативных и облигатных паразитов.

В вегетационных и лабораторных условиях стерилизованную почву перед посевом смешивают с чистой культурой возбудителя фузариоза, размноженной на стерильных семенах овса или растения-хозяина.

Другой способ эффективного заражения — намачивание проростков с травмированными корешками в гомогенате чистой культуры патогена в течение 1 часа перед посевом семян в вегетационные сосуды или ящики со стерильной почвой. Ниже приводятся примеры создания искусственных инфекционных фонов для различных зерно-вых бобовых культур в селекционных центрах ряда стран.

      Были изучены варианты:
  • посев летом при температуре почвы 18—20°С, т. е. оптимальный для развития возбудителя болезни;
  • выращивание сортов гороха в монокультуре;
  • внесение патогена с семенами гороха при посеве;
  • внесение культуры возбудителя болезни в почву перед посевом.

Контролем служил сорт, посеянный в оптимальный срок по принятой в регионе технологии возделывания.

Культуру возбудителя выращивали на стерильных семенах овса и гороха в соотношении 2:1 и после 18—20 дней инкубации подсушивали в тени при температуре не выше 25°С, затем размалывали на электрической мельнице и полученный препарат вносили в почву из расчета 100 г/м².

Наиболее достоверные результаты в течение трех лет (1976—1978) были получены в варианте 4 (внесение культуры патогена в почву перед посевом), который впоследствии и был принят за основу. При этом осенью перед обработкой почвы вносят измельченные больные растения, а весной перед культивацией — 100 г/м² возбудителя в условиях монокультуры в течение ряда лет. Для контроля за равномерностью распределения инфекционной нагрузки через каждые 5—10 делянок высевали восприимчивый сорт, по степени поражения которого судили о выравненности фона.

Шевченко и Кирпичева разработали и применяют следующую методику создания фузариозного фона для гороха. Чистую культуру F. oxysporum выделяли на картофельно-глюкозной агаровой питательной среде. Затем по 100 г семян овса помещали в химические стаканчики объёмом 800 мл, заливали 100 см 3 воды и стерилизовали в автоклаве под давлением 2 атм. в течение 1 часа. После остывания зерно встряхивали и в стерильных условиях высевали на него суспензию культуры гриба. Через 15 дней появлялась плотно сплетенная грибница. Затем готовую культуру извлекали из стаканов, рассыпали тонким слоем (до 3 см) и просушивали на воздухе. Перед посевом гороха в почву вносили инфицированное зерно овса из расчета 150 г/м². В течение вегетационного периода влажность почвы поддерживали на уровне 80% путем орошения.

Польский исследовательский центр по испытанию сортов гороха в течение трёх лет, начиная с 1990 года, провел полевые и вегетационные эксперименты по оценке уровня устойчивости 60 сортов гороха к фузариозному увяданию (F. oxysporum) и корневым гнилям (F. solani, F. culmorum). Инокулюм для инокуляции готовили из 10—12 изолятов трех видов Fusarium (Fo, Fs, Fc). Культуру каждого изолята гриба выращивали на среде, содержащей семена гороха, перлит и воду в соотношении 1:1:2/3 в течение трех недель при комнатной температуре. Колбы регулярно встряхивали во избежание образования комков. Когда среда полностью покрылась мицелием гриба, изоляты смешали и использовали как стандартный инокулюм. Затем все инокулированные семена были стерилизованы этанолом, вынуты и промыты стерилизованной водой.

Почва опытных делянок в поле была инфицирована стандартным инокулюмом в объёме 75 см 3 на 1 м рядка делянки площадью 4 м² (2×2) с 4-кратной повторностью для инокулюма и 4-кратной без инокуляции. Учет поражения проводили в течение вегетации, а после уборки семена взвешивали для учета влияния поражения на урожай по сравнению с контрольным вариантом без инокуляции.

В тепличном варианте опыта растения также были инфицированы через почву. Семена каждого сорта гороха высевали в грунт со смесью торфа, песка, перлита и стандартного инокулюма (15 см 3 на 5 семян). Через 4 недели проростки удалили из субстрата и тщательно промыли в воде. Симптомы болезни отмечали по шкале от 0 (здоровые растения) до 9 (семена не проросли), после чего растения высушивали и взвешивали. В итоге результаты полевой и лабораторной оценки коррелировали между собой.

Фузариозный фон люпина. По отношению к люпину применяют двух-трехлетнюю монокультуру сильно восприимчивого сорта, внесение в почву измельченных пораженных растений или размноженных на питательной среде патогенов (5, 6). В качестве питательного субстрата могут служить зёрна хлебных злаков, особенно, проса и овса. Под инфекционный фон используют участки, изолированные от хозяйственных посевов, чистые от сорняков и пригодные для возделывания зерновых бобовых культур.

Подготовленный инфекционный материал люпина в конце августа вносят на поле из расчета 150—200 г/м² под культивацию, которую проводят вслед за внесением инокулюма. В первый год после внесения инфекции участок следует засевать восприимчивым к фузариозному увяданию сортом люпина. Созданный таким способом инфекционный фон можно использовать в течение 6 лет. Более длительное его использование ведет к излишнему накоплению инфекции, повышению токсичности почвы и обеднению её питательными веществами, в силу чего растения сильно угнетаются и гибнут.

Весной проводится посев коллекционного и селекционного питомников в 3—4-кратной повторности с размещением стандарта через 10 делянок и сильно восприимчивых сортов-индикаторов.

В б. Новозыбковском филиале ВИУА (Россия) искусственный фузариозный фон для люпина создавали следующим способом. Почву инфицировали путем ежегодного внесения чистой культуры фузариоза (100 г/м²) и измельченной массы растений, пораженных корневой гнилью и трахеомикозным увяданием (5 кг/м²). В результате был создан достаточно жесткий инфекционный фон, на котором было идентифицировано 12 видов Fusarium. В Украинском институте земледелия фузариозный инфекционный фон для люпина в поле был создан путем внесения в почву высоковирулентных штаммов F.oxysporum var. arthoceras (App.et Wr.) Bilai, выделенных в зоне люпиносеяния.

Фузариозный фон сои. Подкина и Котляров разработали оригинальную методику создания фузариозного инфекционного фона для оценки селекционного материала сои, которая оказалась в 1,3—1,5 раза эффективнее общепринятых трудоёмких способов локального внесения инокулюма с семенами при посеве в рядки и лунки или диффузного внесения в почву инфекционного материала. На первом этапе выделили возбудителей болезни из растений сои, выращенных в основных зонах Краснодарского края (Россия). Патогенные изоляты всех видов Fusarium, размноженные на стерильных семенах подсолнечника, высушивали при комнатной температуре, измельчали на мельнице „Пируэт“ в течение 1 мин. и смешивали виды Fusarium в соотношении, установ-ленном в зависимости от частоты их встречаемости на посевах сои — 5 частей F. oxysporum : 3 — F. moniliforme: 2 — F. solani: 1 — F. gibbosum.

Полученный биопрепарат из расчета 10 г на 100 г семян, смоченных 15% гуммиарабиком или 5% ПВС (поливиниловый спирт), или 2% АКМЦ (натриевая соль карбоксилметилцеллюлозы). Эти вещества не оказывают токсического действия на семена, не угнетают развитие патогена, легко растворяются в воде, формируют на поверхности семени прочную плёнку, имеют высокую клеющую способность и хорошо удерживают инокулюм. После обработки семена просушивали (в таком виде они могут храниться в течение месяца) и затем высевали в поле.

При оценке сортов и линий сои на устойчивость к фузариозу в условиях Молдовы для размножения чистых культур и внесения в почву при посеве в поле использовали 20—30 наиболее эффективных изолятов, сочетающих способность к биосинтезу фузариевой кислоты и высокую активность гидролитических ферментов — протеаз и липаз. Ежегодная реизоляция позволяла судить о правильности отбора ти-пичных культур. Кроме того, дополнительно выделяли и вводили в фон изоляты, которые преодолевали устойчивость резистентных генотипов, для включения новых вариантов вирулентности, возникающих в популяциях. Это обеспечивало поражение восприимчивых сортов и линий сои на 80—100%, а устойчивых — на 10—20%.

Полевые методы оценки на устойчивость к аскохитозу и другим болезням. В INRA (Франция) разработан новый (простой метод (ПМ)) оценки устойчивости гороха к тёмнопятнистому аскохитозу (М. pinodes), применяемый в селекционных питомниках. Ранее (Tivoli, 1994) был разработан детальный метод, включающий оценку устойчивости каждого узла на стебле и прилистника по шкале 0—5 баллов. Этот детальный метод даёт точную оценку устойчивости генотипа гороха к тёмнопятнистому аскохитозу (ТПА), но требует много времени и разрушения растения и непригоден для селекционного питомника, где число генотипов очень велико, а устойчивый материал должен быть сохранён.

При применении ПМ были использованы два способа посева: микроделяночный (2×2 м) — обычный тип в селекционном питомнике и проволочный (wire), при котором элиминировалось взаимодействие между проявлением болезни и полеганием. Делянки инокулировали зерном ячменя, инфицированным смесью штаммов гриба. Оценивали, во-первых, визуально пропорцию пораженной части растения и, во-вторых, среднюю величину поражения каждого органа, включая стебель и прилистники по той же 5-балльной шкале. Оценку проводили в 3 срока в 1995—96 гг. и в один срок в 1997 на 10 растениях каждого генотипа. Измеряли также высоту поражения стеблей и прилистников.

Таким образом, оценка ПМ заражения стебля представляет оптимальную среднюю для всей пораженной части растения, а оценка заражения прилистников отражает степень поражения средней части растения, т.к. нижние прилистники трудны для оценки из-за старения в фазе цветения и налива семян. Knoppe & Hoppe в 1993—94 гг. изучали устойчивость разных генотипов гороха к двум болезням, вызываемым M. pinodes и Phoma medicaginis var. pinodella (syn. A. pinodella). Споры изолятов обоих патогенов использовали для инокуляции семян и побегов (изолят M. р. — Mp1 изолят Ph. m. — R15). Семена погружали в суспензию спор (10 6 спор/мл), затем высушивали при 30°С в течение 4 часов и сразу высевали в поле. 10 недель спустя после посева растения опрыскивали такой же суспензией спор, дополненной 0,01% глюкозой и 0,01% экстрактом дрожжей для стимуляции прорастания спор.

Полевые опыты проводили в двух местах рендомизированными блоками в 3—4 повторностях. Поражение каждой болезнью оценивали на 25 растениях каждой делянки, ранжируя от 0 (нет поражения) до 9 (полная гибель). Поражение листьев, стеблей и бобов оценивали независимо, а на эпикотилях измеряли длину повреждений.

У нута эпифитотия аскохитоза была создана путем разброса инфицированных дробленых семян вирулентным в регионе патотипом внутри делянки. Ряды восприимчивой линии были высеяны после каждых 4 рядов и вдоль границы поля для увеличения распространения и выравненности инфекции. Устойчивость каждой линии нута оценивалась по 9-балльной шкале.

Инфекционный фон для заражения гороха вирусом обыкновенной мозаики гороха (PCMV), а люпина, кормовых бобов и яровой вики — вирусом желтой мозаики фасоли (BYMV) создавали путем их посева в изоляции от других посевов зерновых бобовых культур и инфицирования в фазе 2—3 листьев вирусами методом механической инокуляции. Культуру вирусов в чистом виде получали путем пассажей изолятов, отобранных в поле, на растения-дифференциаторы в условиях теплицы. Инокулюм готовили непосредственно перед заражением из листьев растений-накопителей, которые растирали в охлаждённом 0,1м фосфатном буфере при рН=7,0 (1:10) с добавлением активированного угля. Инокуляцию проводили вечером после захода солнца. Количество зараженных растений и интенсивность поражения по 5-балльной шкале отмечали через 14 и 21 день после инокуляции. В случае сомнительных результатов проводили индикаторный и серологический анализ.

В статье представлены и обсуждаются результаты применения различных методов создания инфекционного фона Pyricularia oryzae для проведения фитопатологической оценки устойчивости селекционных материалов риса к пирикуляриозу и отбора болезнеустойчивых сортов и линии риса. Экспериментальным путем установлено, что наиболее эффективным лабораторным методом создания инфекционного фона является инокуляция отрезки листьев растений риса фильтровальной бумагой, пропитанной конидиальной суспензией гриба и инокуляция отрезки листьев растений риса каплями конидиальной суспензии патогена.

Введение

Одним из опасных заболеваний риса во всем мире, в том числе и в Казахстане, является пирикуляриоз, вызываемый несовершенным грибом Pyricularia oryzae Br. et Cav. (синоним Magnaporthe grisea (Hebert) Barr) 1. Впервые оно было описано в Японии в 1704 г., а его возбудитель – в 1896 г. Сейчас пирикуляриоз известен во всех районах возделывания риса [1]. Патоген поражает все надземные органы растения, что приводит к потере урожая на 30-60%, а в годы эпифитотий – на 80-100% 2.

Наиболее практичным и экономичным подходом в борьбе с пирикуляриозом риса является использование сортов, устойчивых к болезни. Определение устойчивости растений к патогену базируется на создании жесткого инфекционного фона и провокационных условий при возделывании культуры. Инфекционный фон может быть естественным и искусственным. При этом естественный инфекционный фон непостоянен и может варьиро-вать в пределах одного года и в разрезе отдельных лет, так как погодные условия не всегда благоприятствуют развитию, интенсивному размножению и распространению возбудителя болезни. В годы с умеренным и слабым развитием болезней гарантированную оценку болезнеустойчивости обеспечивает искусственное заражение растений, которое можно осуществлять как в полевых инфекционных питомниках, так и в условиях искусственного климата – теплицах и климатических камерах [6, 7].

В связи с этим, фитопатологии и селекционеры в своей работе в основном использует искусственный инфекционный фон для определения вирулентности гриба и отбора устойчивых сортов растений. Следовательно, изучение иммунологических свойств исходного и селекционного материала при искусственном заражении растений позволяет выявлять потенциальную и стабильную устойчивость сортообразцов, проводить своевременную браковку и отбор невосприимчивых форм на всех этапах селекции, что значительно ускоряет селекционный процесс, сокращая сроки выведения новых сортов культуры [8].

Успешная инокуляция может быть осуществлена при наличии ряда благоприятных условий [9]:

  • оптимальная температура для прорастания спор, конидии или развития мицелия гриба;
  • высокая влажность на поверхности листьев для прорастания спор;
  • качество и интенсивность освещения;
  • растения должны быть в достаточно восприимчивой физиологической стадии развития;
  • инокулюм должен быть наиболее эффективно распределен на растении.

К настоящему времени разработаны различные способы и методы создания инфекционного фона возбудителем P.oryzae. Однако не все известные методы являются эффективными для оценки устойчивости сортов риса к болезни. Прежде чем провести массовый скрининг сортов риса на устойчивость, необходимо выбрать эффективного метода по созданию инфекционного фона, что сказывается на качестве проведения эксперимента. Кроме того, проведение фитопатологических и иммунологических исследований в Казахстане лимитируется отсутствием коллекции изолятов возбудителя пирикуляриоза, не разработанностью полевых и лабораторных методик оценки болезнеустойчивости с использованием современных методов.

Материалы и методы

В качестве инфекционного материала использована смесь из казахстанских изолятов возбудителя P. oryzae, которые выделены в 2013-2014 гг. и культивированы на картофельно-декстрозном агаре. Для приготовления суспензии культуру гриба с поверхности агара соскабливали шпателем и суспензировали в стерильной воде. Полученную суспензию фильтровали и разводили водой до необходимой концентрации. Для проведения инокуляции растений были использованы Твин 80 и желатин.

На основании анализа литературных данных подобраны четыре метода инокуляции растений риса возбудителем P. oryzae, которые были использованы в данной работе:

  • метод опрыскивания [2, 10, 11];
  • смазывания листьев суспензией гриба [12];
  • инокуляция отрезки листьев каплями суспензией гриба [13];
  • инокуляция отрезки листьев фильтровальной бумагой пропитанной суспензией гриба [14].

Количество спор в суспензии (на 1 см2 площади колонии) определяли с помощью камеры Горяева по формуле:


Микроскопические работы проводили с помощью цифрового микроскопа (MC 300TS, Австрия), анализ микроскопических изображений проведен по компьютерной программе Motic Images 2000-1.3. Освещенность измеряли люксметром Ю-116.

Результаты и их обсуждение

На основе полученных результатов, можно считать, что метод заражения каплями конидиальной суспензии патогена имеет ряд преимуществ. Во-первых, данный метод позволяет, определит патогенность гриба в контролируемой среде, т.к. эксперименты выполняются в лабораторных боксах, и поэтому нет риска распространения гриба. А во- вторых метод экономичен во времени, не требует много растительного материала, изолята гриба, много места в лаборатории. Кроме того, использование данного метода позволяет одновременно заразить одних и тех же образцов несколькими изолятами болезни. Результаты исследований показаны на рисунке 1.



Результаты лабораторных экспериментов показали, что конидии пирикуляриоза риса можно поместить на растения разными способами. При этом дана характеристика к четырем методам заражения сортов риса возбудителем P. oryzae (суммировано в таблице 1).

Таблица 1 – Основные параметры методов заражения риса возбудителем P. Oryzae

Основные параметры методов заражения риса возбудителем P. Oryzae

Как видно из данных таблицы 1, что почти все применяемых методов можно использовать с водным носителем. Чтобы сохранить конидии в суспензии, необходимо добавит нефитотоксичный смачивающий агент, такой как Tвин 20 и желатин, а так же для заражения может быть использован опрыскиватель, щетка, фильтровальная бумага, шприц или микропипетка. Установлено, что процесс инфицирования проростков риса возбудителем P. oryzae происходит в интервале температур 22-28 оС с удлинением влажного периода до 48 ч. По литературным данным [12] наиболее благоприятной можно считать температуру, близкую к 26 оС, при которой первые признаки заражения проявляются уже после 4 сут заражения. Чем больше температура воздуха отклоняется от оптимальной (26 оС) в ту или иную сторону, тем требуется больший период увлажнения для инфицирования и проявления признаков пирикуляриоза на растениях.

Следует отметить, что для освещения растений мы использовали световую установку, состоящую из ртутно-дуговых люминесцентных ламп высокого давления (ДРЛ-2000), следовательно, в опытах освещенность была в пределах 10-20 тыс. люкс. При использовании отдельных методов затраты времени и труда значительны, но риск контаминации минимален и в научном плане высокоэффективен. В любом случае выбранный метод зависит от цели инокуляции, количества инокулируемых растений, количества пригодного инокулюма и материально-технической возможности экспериментатора.

Работа выполнена в рамках программы грантового финансирования Республики Казахстан на 2013-2015 гг. (грант №2495/ГФЗ).


Москва, 2008г. - 68 с.
Введение
Создание инфекционных фонов для иммуногенетических исследований и испытаний
Ржавчина
Обоснование состава инокулюма для создания региональных инфекционных фонов
Размножение уредоспор ржавчинных грибов
Выращивание и заражение пшеницы
Сбор и консервация уредоспор
Определение прорастаемости уредоспор
Создание инфекционных фонов ржавчинных болезней
Оценка устойчивости растений к ржавчине
Фитопатологические оценки устойчивости к ржавчине селекционного материала в условиях искусственного климата
Септориоз
Обоснование состава инокулюма для создания региональных инфекционных фонов
Сбор образцов пораженных растений
Определение видовой принадлежности гриба
Выделение в чистую культуру изолятов Septria
Дифференциация изолятов Septoria/Stagonospora по культурально-морфологическим признакам
Оценка вирулентности изолятов Septoria
1. Сорта-дифференциаторы
2. Получение инокулюма изолятов для заражения дифференциаторов
3. Заражение растений
4. Определение группы патогенности изолятов Septoria
Подбор штаммов для испытания сортов и селекционного материала на устойчивость к септориозу
Получение биоматериала возбудителей септориоза для создания искусственного инфекционного фона
Определение жизнеспособности спор
Определение концентрации спор (титра) в биоматериале
Создание искусственных инфекционных фонов
Оценка устойчивости к септориозу селекционного материала в полевых условиях
Мучнистая роса
Обоснование состава инокулюма для создания региональных инфекционных фонов
Накопление инфекционного начала
Создание искусственного инфекционного фона
Методы полевой оценки
Методы работы в условиях искусственного климата

Бабчук И.В. Методические рекомендации по составлению прогноза развития и учёту вредителей и болезней сельскохозяйственных растений

  • формат djvu
  • размер 10.47 МБ
  • добавлен 02 января 2012 г.

К.: Наукова думка, 1981. - 237 с. Настоящие методические рекомендации по прогнозу развития и учету вредителей и болезней сельскохозяйственных растений составлены специалистами Министерства сельского хозяйства УССР (Бабчук И. В., Григоренко В. Г., Коваль М. К-, Рубец Л. Н.), Украинского научно-исследовательского института защиты растений (Хухрий О. В., Чабан В. С, Григорович И. В., Омелюта В. П.) на основании существующих разрозненных методически.

Дурынина Е.П., Великанов Л.Л. Почвенные фитопатогенные грибы

  • формат djvu
  • размер 2.73 МБ
  • добавлен 04 мая 2011 г.

М.: Изд-во Моск. ун-та, 1984. - 107 с. В учебном пособии рассмотрены основные сведения о биологии и экологии фитопатогенных грибов, обитающих в почвах, и о вызываемых ими поражениях растений. Большое внимание уделено разнообразию биотических связей этих грибов в экосистемах и причинам возникновения у них паразитизма. Описаны неинфекционные поражения корневой системы растений, возникающие в результате жизнедеятельности почвенных микроорганизмов.

Курсовая работа - Современное представление об интегрированной защите растений

  • формат pdf
  • размер 630.58 КБ
  • добавлен 08 октября 2010 г.

Содержание. введение. Содержание и схема функционирования интегрированной системы защиты. растений. История возникновения, определение и содержание интегрированной защиты растений. Агроэкосистема как основной объект интегрированной защиты растений. Основные элементы интегрированной защиты растений. Методы снижения среднего уровня численности вредных объектов с помощью. экологических механизмов агросистемы. Использование устойчивых сортов. Изменен.

Макарова Л.А. Назина Н.А. Методические указания по прогнозу фаз динамики популяций озимой совки и планированию объемов защитных мероприятий, сигнализации сроков их приминению

  • формат djvu
  • размер 3.49 МБ
  • добавлен 31 декабря 2011 г.

Ленинград: ВМЗР, 1990. - 41 с. Методика предназначена для специалистов службы защиты растений. Она составлена на основании обобщения летературных материалов, предшествующих методических указаний и специально проведенных исследований авторов по выявлению закономерностей распространения и размножения озимой совки в зоне одного и двух поколений на европейской территории Союза. В ней впервые дана система прогноза фаз днинамики популяций вредителя, о.

Презентация - Автор неизвестен. Хвороби та шкідники сої

  • формат pdf
  • размер 3.22 МБ
  • добавлен 27 июня 2011 г.

Презентация с фотографиями основных вредителей и симптомов проявления инфекционных и неинфекционных болезней сои.

Пригге Г., Герхард М., Хабермайер - Грибные болезни зерновых культур

  • формат pdf
  • размер 4.83 МБ
  • добавлен 09 ноября 2011 г.

Под ред. Ю.М. Стройкова - Лимбургерхоф, Ландвиртшафтсферлаг Мюнстер-Хилтруп и БАСФ АГ, 2004, 192 стр. Введение Гриб как конкурент в получении питательных веществ Грибные заболевания пшеницы Грибные заболевания ячменя (неспецифические симптомы, вирусные болезни) Грибные заболевания ржи Грибные заболевания тритикале Грибные заболевания овса Кладоспориум и вторичные грибы, развивающиеся на ослабленных зерновых Болезни минерального голодания зернов.

Роглер Хельмут. Заболевания пшеницы. Поражения и биология

  • формат pdf
  • размер 670.08 КБ
  • добавлен 25 мая 2011 г.

Санин С.С. Защита пшеницы от бурой ржавчины

  • формат pdf
  • размер 783.29 КБ
  • добавлен 24 ноября 2011 г.

Москва, 2007. - 25 с. Предисловие Общие ведения о возбудителе болезни Фитосанитарные и агроэкологические наблюдения Наблюдения за состоянием растений Наблюдения за развитием болезни в течение вегетации растения-хозяина Наблюдения за условиями развития болезни Защита пшеницы от бурой ржавчины в период вегетации растений Концепция управления защитой от ржавчины Консультативная система принятия решений о проведении защитных опрыски- ваний посевов пш.

Санин С.С., Неклеса Н.П., Стрижекозин Н.П. Защита пшеницы от мучнистой росы

  • формат pdf
  • размер 1.97 МБ
  • добавлен 26 ноября 2011 г.

Приложение к журналу Защита и карантин растений, 2008, №1, 62-71 с. Предисловие Общие следования о возбудителе болезни Факторы, влияющие на развитие болезни Фитосанитарные наблюдения Наблюдения за состоянием растений Наблюдения за развитием болезни в течение вегетации растения-хозяина Препараты, применяемые для защиты от мучнистой росы Консультативная система принятия правильных решений

Станчева Й. Атлас болезней сельскохозяйственных культур. Том 3. Болезни полевых культур

  • формат djvu
  • размер 7.11 МБ
  • добавлен 02 декабря 2009 г.

2003 г. В книге описаны болезни пшеницы, ячменя, ржи, овса, риса, кукурузы, зернового, сахарного и веничного сарго, гречихи, фуражных злаковых трав, фасоли, сои, гороха, чечевицы, нута, кормовых бобов, вики, люпина, люцерны, клевера, эспарцета.

Для создания в полевых условиях искусственного инфекционного фона почвообитающих возбудителей болезни (Fusarium, Pythium, Sclerotinium, Rhizoctonia) применяют метод монокультуры восприимчивого растения-хозяина в течение нескольких лет. Накопление инфекции можно ускорить искусственным заражением почвы путём внесения растительных остатков или почвы с участков, на которых отмечено эпифитотийное развитие заболевания. Размноженную на питательных средах чистую культуру патогена можно внести на поле при посеве и два — три раза в течение вегетационного периода. Последний приём применяется не только для почвообитающих грибов, бактерий и нематод, но и для зимующих стадий факультативных и облигатных паразитов.

В вегетационных и лабораторных условиях стерилизованную почву перед посевом смешивают с чистой культурой возбудителя фузариоза, размноженной на стерильных семенах овса или растения-хозяина.

Другой способ эффективного заражения — намачивание проростков с травмированными корешками в гомогенате чистой культуры патогена в течение 1 часа перед посевом семян в вегетационные сосуды или ящики со стерильной почвой. Ниже приводятся примеры создания искусственных инфекционных фонов для различных зерно-вых бобовых культур в селекционных центрах ряда стран.

      Были изучены варианты:
  • посев летом при температуре почвы 18—20°С, т. е. оптимальный для развития возбудителя болезни;
  • выращивание сортов гороха в монокультуре;
  • внесение патогена с семенами гороха при посеве;
  • внесение культуры возбудителя болезни в почву перед посевом.

Контролем служил сорт, посеянный в оптимальный срок по принятой в регионе технологии возделывания.

Культуру возбудителя выращивали на стерильных семенах овса и гороха в соотношении 2:1 и после 18—20 дней инкубации подсушивали в тени при температуре не выше 25°С, затем размалывали на электрической мельнице и полученный препарат вносили в почву из расчета 100 г/м².

Наиболее достоверные результаты в течение трех лет (1976—1978) были получены в варианте 4 (внесение культуры патогена в почву перед посевом), который впоследствии и был принят за основу. При этом осенью перед обработкой почвы вносят измельченные больные растения, а весной перед культивацией — 100 г/м² возбудителя в условиях монокультуры в течение ряда лет. Для контроля за равномерностью распределения инфекционной нагрузки через каждые 5—10 делянок высевали восприимчивый сорт, по степени поражения которого судили о выравненности фона.

Шевченко и Кирпичева разработали и применяют следующую методику создания фузариозного фона для гороха. Чистую культуру F. oxysporum выделяли на картофельно-глюкозной агаровой питательной среде. Затем по 100 г семян овса помещали в химические стаканчики объёмом 800 мл, заливали 100 см 3 воды и стерилизовали в автоклаве под давлением 2 атм. в течение 1 часа. После остывания зерно встряхивали и в стерильных условиях высевали на него суспензию культуры гриба. Через 15 дней появлялась плотно сплетенная грибница. Затем готовую культуру извлекали из стаканов, рассыпали тонким слоем (до 3 см) и просушивали на воздухе. Перед посевом гороха в почву вносили инфицированное зерно овса из расчета 150 г/м². В течение вегетационного периода влажность почвы поддерживали на уровне 80% путем орошения.

Польский исследовательский центр по испытанию сортов гороха в течение трёх лет, начиная с 1990 года, провел полевые и вегетационные эксперименты по оценке уровня устойчивости 60 сортов гороха к фузариозному увяданию (F. oxysporum) и корневым гнилям (F. solani, F. culmorum). Инокулюм для инокуляции готовили из 10—12 изолятов трех видов Fusarium (Fo, Fs, Fc). Культуру каждого изолята гриба выращивали на среде, содержащей семена гороха, перлит и воду в соотношении 1:1:2/3 в течение трех недель при комнатной температуре. Колбы регулярно встряхивали во избежание образования комков. Когда среда полностью покрылась мицелием гриба, изоляты смешали и использовали как стандартный инокулюм. Затем все инокулированные семена были стерилизованы этанолом, вынуты и промыты стерилизованной водой.

Почва опытных делянок в поле была инфицирована стандартным инокулюмом в объёме 75 см 3 на 1 м рядка делянки площадью 4 м² (2×2) с 4-кратной повторностью для инокулюма и 4-кратной без инокуляции. Учет поражения проводили в течение вегетации, а после уборки семена взвешивали для учета влияния поражения на урожай по сравнению с контрольным вариантом без инокуляции.

В тепличном варианте опыта растения также были инфицированы через почву. Семена каждого сорта гороха высевали в грунт со смесью торфа, песка, перлита и стандартного инокулюма (15 см 3 на 5 семян). Через 4 недели проростки удалили из субстрата и тщательно промыли в воде. Симптомы болезни отмечали по шкале от 0 (здоровые растения) до 9 (семена не проросли), после чего растения высушивали и взвешивали. В итоге результаты полевой и лабораторной оценки коррелировали между собой.

Фузариозный фон люпина. По отношению к люпину применяют двух-трехлетнюю монокультуру сильно восприимчивого сорта, внесение в почву измельченных пораженных растений или размноженных на питательной среде патогенов (5, 6). В качестве питательного субстрата могут служить зёрна хлебных злаков, особенно, проса и овса. Под инфекционный фон используют участки, изолированные от хозяйственных посевов, чистые от сорняков и пригодные для возделывания зерновых бобовых культур.

Подготовленный инфекционный материал люпина в конце августа вносят на поле из расчета 150—200 г/м² под культивацию, которую проводят вслед за внесением инокулюма. В первый год после внесения инфекции участок следует засевать восприимчивым к фузариозному увяданию сортом люпина. Созданный таким способом инфекционный фон можно использовать в течение 6 лет. Более длительное его использование ведет к излишнему накоплению инфекции, повышению токсичности почвы и обеднению её питательными веществами, в силу чего растения сильно угнетаются и гибнут.

Весной проводится посев коллекционного и селекционного питомников в 3—4-кратной повторности с размещением стандарта через 10 делянок и сильно восприимчивых сортов-индикаторов.

В б. Новозыбковском филиале ВИУА (Россия) искусственный фузариозный фон для люпина создавали следующим способом. Почву инфицировали путем ежегодного внесения чистой культуры фузариоза (100 г/м²) и измельченной массы растений, пораженных корневой гнилью и трахеомикозным увяданием (5 кг/м²). В результате был создан достаточно жесткий инфекционный фон, на котором было идентифицировано 12 видов Fusarium. В Украинском институте земледелия фузариозный инфекционный фон для люпина в поле был создан путем внесения в почву высоковирулентных штаммов F.oxysporum var. arthoceras (App.et Wr.) Bilai, выделенных в зоне люпиносеяния.

Фузариозный фон сои. Подкина и Котляров разработали оригинальную методику создания фузариозного инфекционного фона для оценки селекционного материала сои, которая оказалась в 1,3—1,5 раза эффективнее общепринятых трудоёмких способов локального внесения инокулюма с семенами при посеве в рядки и лунки или диффузного внесения в почву инфекционного материала. На первом этапе выделили возбудителей болезни из растений сои, выращенных в основных зонах Краснодарского края (Россия). Патогенные изоляты всех видов Fusarium, размноженные на стерильных семенах подсолнечника, высушивали при комнатной температуре, измельчали на мельнице „Пируэт“ в течение 1 мин. и смешивали виды Fusarium в соотношении, установ-ленном в зависимости от частоты их встречаемости на посевах сои — 5 частей F. oxysporum : 3 — F. moniliforme: 2 — F. solani: 1 — F. gibbosum.

Полученный биопрепарат из расчета 10 г на 100 г семян, смоченных 15% гуммиарабиком или 5% ПВС (поливиниловый спирт), или 2% АКМЦ (натриевая соль карбоксилметилцеллюлозы). Эти вещества не оказывают токсического действия на семена, не угнетают развитие патогена, легко растворяются в воде, формируют на поверхности семени прочную плёнку, имеют высокую клеющую способность и хорошо удерживают инокулюм. После обработки семена просушивали (в таком виде они могут храниться в течение месяца) и затем высевали в поле.

При оценке сортов и линий сои на устойчивость к фузариозу в условиях Молдовы для размножения чистых культур и внесения в почву при посеве в поле использовали 20—30 наиболее эффективных изолятов, сочетающих способность к биосинтезу фузариевой кислоты и высокую активность гидролитических ферментов — протеаз и липаз. Ежегодная реизоляция позволяла судить о правильности отбора ти-пичных культур. Кроме того, дополнительно выделяли и вводили в фон изоляты, которые преодолевали устойчивость резистентных генотипов, для включения новых вариантов вирулентности, возникающих в популяциях. Это обеспечивало поражение восприимчивых сортов и линий сои на 80—100%, а устойчивых — на 10—20%.

Полевые методы оценки на устойчивость к аскохитозу и другим болезням. В INRA (Франция) разработан новый (простой метод (ПМ)) оценки устойчивости гороха к тёмнопятнистому аскохитозу (М. pinodes), применяемый в селекционных питомниках. Ранее (Tivoli, 1994) был разработан детальный метод, включающий оценку устойчивости каждого узла на стебле и прилистника по шкале 0—5 баллов. Этот детальный метод даёт точную оценку устойчивости генотипа гороха к тёмнопятнистому аскохитозу (ТПА), но требует много времени и разрушения растения и непригоден для селекционного питомника, где число генотипов очень велико, а устойчивый материал должен быть сохранён.

При применении ПМ были использованы два способа посева: микроделяночный (2×2 м) — обычный тип в селекционном питомнике и проволочный (wire), при котором элиминировалось взаимодействие между проявлением болезни и полеганием. Делянки инокулировали зерном ячменя, инфицированным смесью штаммов гриба. Оценивали, во-первых, визуально пропорцию пораженной части растения и, во-вторых, среднюю величину поражения каждого органа, включая стебель и прилистники по той же 5-балльной шкале. Оценку проводили в 3 срока в 1995—96 гг. и в один срок в 1997 на 10 растениях каждого генотипа. Измеряли также высоту поражения стеблей и прилистников.

Таким образом, оценка ПМ заражения стебля представляет оптимальную среднюю для всей пораженной части растения, а оценка заражения прилистников отражает степень поражения средней части растения, т.к. нижние прилистники трудны для оценки из-за старения в фазе цветения и налива семян. Knoppe & Hoppe в 1993—94 гг. изучали устойчивость разных генотипов гороха к двум болезням, вызываемым M. pinodes и Phoma medicaginis var. pinodella (syn. A. pinodella). Споры изолятов обоих патогенов использовали для инокуляции семян и побегов (изолят M. р. — Mp1 изолят Ph. m. — R15). Семена погружали в суспензию спор (10 6 спор/мл), затем высушивали при 30°С в течение 4 часов и сразу высевали в поле. 10 недель спустя после посева растения опрыскивали такой же суспензией спор, дополненной 0,01% глюкозой и 0,01% экстрактом дрожжей для стимуляции прорастания спор.

Полевые опыты проводили в двух местах рендомизированными блоками в 3—4 повторностях. Поражение каждой болезнью оценивали на 25 растениях каждой делянки, ранжируя от 0 (нет поражения) до 9 (полная гибель). Поражение листьев, стеблей и бобов оценивали независимо, а на эпикотилях измеряли длину повреждений.

У нута эпифитотия аскохитоза была создана путем разброса инфицированных дробленых семян вирулентным в регионе патотипом внутри делянки. Ряды восприимчивой линии были высеяны после каждых 4 рядов и вдоль границы поля для увеличения распространения и выравненности инфекции. Устойчивость каждой линии нута оценивалась по 9-балльной шкале.

Инфекционный фон для заражения гороха вирусом обыкновенной мозаики гороха (PCMV), а люпина, кормовых бобов и яровой вики — вирусом желтой мозаики фасоли (BYMV) создавали путем их посева в изоляции от других посевов зерновых бобовых культур и инфицирования в фазе 2—3 листьев вирусами методом механической инокуляции. Культуру вирусов в чистом виде получали путем пассажей изолятов, отобранных в поле, на растения-дифференциаторы в условиях теплицы. Инокулюм готовили непосредственно перед заражением из листьев растений-накопителей, которые растирали в охлаждённом 0,1м фосфатном буфере при рН=7,0 (1:10) с добавлением активированного угля. Инокуляцию проводили вечером после захода солнца. Количество зараженных растений и интенсивность поражения по 5-балльной шкале отмечали через 14 и 21 день после инокуляции. В случае сомнительных результатов проводили индикаторный и серологический анализ.

Читайте также: