Микробиологическая диагностика стафилококковых и стрептококковых инфекций

Обновлено: 18.04.2024

Микроскопия золотистого стафилококка. Выявление скоплений грамположительных кокков и полиморфно-нуклеар-ных лейкоцитов при исследовании окрашенных мазков клинического материала может служить основанием для предварительного диагноза. Следует помнить, что результаты микроскопии нельзя считать достаточными для выдачи окончательного заключения.

Выделение золотистого стафилококка

Посев золотистого стафилококка проводят на простые питательные среды, обычно на тио-гликолевую среду и КА. Если существует риск контаминации образца, применяют дифференциально-диагностические среды. Наиболее часто используют молочно-солевой (или молочно-жел-точно-солевой) агар и солевой агар с маннитом, на них рост контаминирующей микрофлоры угнетает высокая концентрация NaCl. Кроме того, на молочно-солевом агаре (МСА) хорошо проявляется способность к пигментообразованию и разложению лецитина (лецитовителазная активность). В последнее время широкое распространение в качестве дифференциально-диагностической среды нашёл агар с колистином и налидиксовой кислотой.

Стафилококки хорошо растут на бульоне, сначала вызывая его равномерное помутнение, а затем образуя рыхлый хлопьевидный осадок. Они дают весьма характерный рост в желатине; через 24-28 ч (наряду с обильным ростом по ходу укола микробиологической иглы) наблюдают начальное разжижение среды, а на 4-5-е сутки образуется открытая вниз воронка, заполненная разжиженной средой.

Для внутривидовой дифференцировки золотистого стафилококка ( S. aureus ) применяют коагулазный тест (на наличие свёртывающего фактора), положительный у 95% изолятов (рис. 12-3). Существует ещё несколько дифференцирующих признаков.

Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.

1. Стафилококки, их свойства, патогенез, лечение, профилактика и микробиологическая диагностика стафилококковых инфекций.

2. Стрептококки, их свойства, патогенез, лечение, профилактика и микробиологическая диагностика стрептококковых инфекций. Скарлатина и ревматизм.

3. Менингококки, их свойства, патогенез, лечение, профилактика и микробиологическая диагностика менингококковых инфекций.

4. Гонококки, их свойства, патогенез, лечение, профилактика и микробиологическая диагностика гонореи.

Программа занятия:

1. Изучить колонии, выросшие на шоколадном агаре после посева отделяемого из зева:

а) сделать мазок из колонии стрептококка, окрасить по Граму, промикроскопировать, зарисовать,

б) сделать пересев из колонии стрептококка на сахарный бульон для выделения чистой культуры,

в) сделать мазок из колонии стафилококка, окрасить по Граму, промикроскопировать, зарисовать,

г) сделать пересев из колонии стафилококка на скошенный столбик питательной среды для

выделения чистой культуры.

2. Изучить колонии, выросшие на шоколадном агаре после посева отделяемого из носа:

а) сделать мазок из колонии стафилококка, окрасить по Граму, промикроскопировать, зарисовть,

б) сделать пересев из колонии стафилококка на скошенный столбик питательной среды для

выделения чистой культуры.

3. Промикроскопировать демонстрационные препараты пневмококков, менингококков, гонококков, зарисовать.

4. Изучить препараты, применяющиеся для лечения, профилактики и диагностики заболеваний, вызываемых стафилококками, стрептококками, пневмококками, менингококками и гонококками.

1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология / Под ред. А.А. Воробьева – МИА – 2008. – с.329-340, 342-354.

2. Л.Б. Борисов. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология - м - 2002.- с. 352-368, 370-376.

4. Руководство к лабораторным занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии / Борисов Л.Б., Козьмин-Соколов Б.Н., Фрейдлин И С - М Медицина, 1993.- с. 126-130, 164-166, 170-173, 191-193.

5. Н.Б. Ефейкина. Возбудители бактериальных инфекций верхних дыхательных путей – Чебоксары – 2008. – с. 32-38, 40-49.

6. Лекционный материал.

Занятие 3

Микробиологическая диагностика стафилококковых (продолжение) и стрептококковых (окончание) инфекций. Микробиологическая диагностика туберкулеза,

Лепры и газовой анаэробной инфекции.

Вопросы для подготовки:

1. Возбудители туберкулеза: классификация, свойства. Патогенез, лечение, профилактика и микробиологическая диагностика туберкулеза.

2. Возбудитель лепры: классификация, свойства. Патогенез, лечение и профилактика лепры.

Микобактериозы.

Возбудители газовой анаэробной инфекции: классификация, свойства. Патогенез, лечение, профилактика и микробиологическая диагностика газовой анаэробной инфекции.

Программа занятия:

1. Проверить чистоту культуры стафилококков, выделенных из зева и носа.

2. Определить признаки патогенности выделенных культур стафилококков:

а) коагулазную активность,

б) лецитиназную активность,

в) способность сбраживать глюкозу и маннит в анаэробных условиях.

3. Проверить чистоту культуры стрептококка, выделенного из зева (приготовить мазок, окрасить фуксином).

4. Промикроскопировать препарат из мокроты больного туберкулезом, окрашенный по Цилю-Нильсену, зарисовать.

5. Диагностика газовой анаэробной инфекции:

а) приготовить мазок из раневого отделяемого, окрасить по Граму, промикроскопировать, зарисовать.

б) произвести посев раневого отделяемого в среду Китта-Тароцци.

6. Изучить препараты, применяемые для диагностики, профилактики и лечения газовой анаэробной инфекции, туберкулеза и лепры.

1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология / Под ред. А.А. Воробьева – МИА – 2008. – с.430-438, 451-469

3. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии / под ред Борисова Л Б -М.: Медицина, 1984.- с. 142-148, 164-169.

4. Руководство к лабораторным занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии / Борисов Л.Б., Козьмин-Соколов Б.Н., Фрейдлин И С - М Медицина, 1993 - с. 132-138, 182-186.

Методы микробиологической диагностики стафилококковых заболеваний отражены в схеме 1. Выполняется следующий комплекс методов исследования.

Бактериоскопический метод– микроскопия мазков из материала от больного, окрашенных по Граму. Выявление в мазках кокков, располагающихся небольшими группами по 2-3 бактерии; типичное расположение в виде гроздьев винограда характерно для чистых культур стафилококка (рис. 1 – цветная вкладка).

Бактериологический метод. Исследуемый материал засевают на чашки с желточно-солевым (ЖСА) и кровяным МПА, инкубируют при 37 0 С сутки. На 2 день учитывают характер

роста колоний на обеих средах. На желточно-солевом агаре колонии стафилококка имеют ровные края, гладкую поверхность, вокруг колонии образуется радужный венчик в результате расщепления лецитина яичного желтка ферментом лецитовителлазой; цвет пигмента колоний варьирует от золотистого до белого. На кровяном МПА вокруг колоний образуются зоны

гемолиза. Из типичных для стафилококка колоний делают мазок, окрашивают его по Граму, микроскопируют. Оставшуюся часть колонии пересевают на скошенный МПА для получения чистой культуры. На 3 день проводят идентификацию выделенной культуры стафилококка с дифференциацией основных видов в соответствии с таблицей 2, определяют чувствительность к антибиотикам методом бумажных дисков и фаговар (набор для фаготипирования состоит из фагов 21 типа, разделенных на 4 группы; при внутрибольничных инфекциях наиболее часто встречаются фаговары 77 и 80).

Таблица 1. Этиология бактериальных раневых и гнойно-воспалительных инфекций

Грамположительные бактерии

Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Erysipelotrix rhusiopathiae

Грамотрицательные бактерии

Burkholderia cepacia, Citrobacter koseri, Edwardsiella tarda, Eikenella corrodens, Enterobacter spp, Escherichia coli, Haemophylus influence, Klebsiella spp, Listeria monocytogenes, Moraxella catarrhalis, Proteus spp, Pseudomonas spp, Salmonella enterica, Serratia spp, Spirillum minus, Streptobacillus moniliformis, Vibrio vulnificus

Неспорообразующие грамположительные бактерии

Bacteroides spp, Prevotella spp, Porphiromonas spp, Fusobacterium spp, Veilonella spp

Неспорообразующие грамотрицательные бактерии

Peptostreptococcus spp, Propionibacterium spp

Cпорообразующие грамположительные бактерии

Clostridium perfringens, Clostridium novy, Clostridium oedematiens, Clostridium septicum, Clostridium sordelli, Clostridium histolyticum, Clostridium sporogenes, Clostridium ramosum

Схема 1. Микробиологическая диагностика стафилококковых инфекций

Материал: гной, раневое отделяемое, пунктаты из полостей и абсцессов, кровь, мокрота, моча, ликвор, рвотные массы, испражнения, остатки пищи.

Выявление грамположительных кокков (группами по 2-3 клетки) в мазках из материала от больного, окрашенных по Граму

РНГА или РН для определения α-антитоксина в сыворотке крови больных хроническими стафилококковыми инфекциями. ИФА для определения антител к стафилококку. Имеет вспомогательное значение

1 день. Посев материала на чашки с желточно-солевым (ЖСА), кровяным МПА, сахарным МПБ.

2 день - учет характера роста колоний. На ЖСА колонии стафилококка с ровными краями, гладкой поверхностью, радужным венчиком вокруг, цвет - от золотистого до белого.

На кровяном МПА - зоны гемолиза, в МПБ –равномерное помутнение. В мазке из колоний в окраске по Граму – кокки в виде гроздьев винограда. Пересев оставшейся части колонии на скошенный МПА для получения чистой культуры, а с сахарного МПБ на кровяной МПА и ЖСА для получения изолированных колоний.

3 день - идентификация выделенной культуры стафилококка, дифференциация видов по биохимическим свойствам, определение чувствительности к антибиотикам и фаговара. Выделение чистой культуры с ЖСА и кровяного МПА.

4 день. Заключение о виде стафилококка. Идентификация культуры, выделенной из сахарного МПБ

5 день. Заключение о виде стафилококка, выделенного из сахарного МПБ.

Таблица 2.Дифференциация основных видов стафилококка

S. epidermidis

S. saprophyticus

Анаэробная ферментация глюкозы

Анаэробная ферментация маннита

Чувствительность к новобиоцину

Обозначения: (+) – наличие признака; (-) – отсутствие признака; S- чувствительный;R– резистентный.

Для выявления плазмокоагулазыцитратную плазму крови кролика разводят в 2 раза, разливают по 0,4 мл в пробирки, куда вносят петлей культуру стафилококков. Результаты регистрируют через 2, 4, 24 часа. При наличии плазмокоагулазы образуется сгусток.

В некоторых случаях у выделенных чистых культур стафилококка определяют наличие ДНК-азы, каталазы, лизоцимной активности, фибринолизина, гиалуронидазы.

Лизоцимную активностьвыявляют по зонам просветления вокруг колоний стафилококка при его посеве на МПА в чашках Петри с культуройMicrococcus luteus.

Каталазный тест.Чистую культуру стафилококка вносят в каплю 3%-10%-го раствора перекиси водорода на стекле и растирают круговыми движениями. При наличии каталазы перекись водорода разлагается с образованием пузырьков кислорода.

Cерологический метод в диагностике стафилококковых инфекций имеет вспомогательное значение, используясь, в основном, для диагностики хронических процессов (остеомиелит, септикопиемия и др.). Для определения антител к токсину стафилококка применяют РНГА с эритроцитарным диагностикумом, нагруженным α-токсином стафилококка или РН (реакция нейтрализации гемолитической активности стафилококкового токсина антитоксинами сыворотки крови больного в присутствии эритроцитов кролика). У здоровых лиц титр стафилококкового антитоксина составляет 0,5-4 АЕ. Разработан также ИФА.

Клинически значимые виды стафилококка

Коагулазоположительные: S. aureus, S. hyicus

Коагулазоотрицательные: S. epidermidis, S. saprophyticus, S. haemolyticus,

Различают 3 вида стафилококков. Основной ущерб организму человека наносят Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus. Эти микроорганизмы входят в семейство Micrococcaceae, род Staphylococcus.

Материалом для исследований служит: гной, кровь, отделяемое слизистой оболочки, спинномозговая жидкость, мокрота, моча, а при пищевых отравлениях - рвотные массы, промывные воды желудка.

Отбор патологического материала обычно выполняют стерильными квачами, которые вносят в пробирку с транспортной питательной средой для контроля стерильности (СКС). Из закрытых гнойных очагов материал берут с помощью шприца. Мокроту, мочу, рвотные массы и промывные воды желудка помещают в стерильные пробирки, банки. Кровь засевают непосредственно у постели больного в питательную среду на основе СКС в соотношении 1:10.

Используют микроскопический и бактериологический методы.

Микроскопический метод. Из исследуемого материала (исключая кровь) готовят мазки, окрашивают по Граму. Стафилококки имеют шаровидную форму, диаметром 0,5-1,5 мкм, грамположительные. Располагаются в мазках чаще всего в виде скоплений, напоминающих гроздья винограда. Также они могут располагаться в одиночку, парами, короткими цепочками.

Микроскопическое исследование не позволяет идентифицировать стафилококки, но дает возможность сориентироваться в выборе питательных сред для выделения чистой культуры бактерий.

Бактериологический метод. Включает выделение чистой культуры микробов из исследуемого материала и их идентификацию.

Через сутки изучают колонии, выросшие на питательной среде. Стафилококки образуют выпуклые непрозрачные колонии средней величины (1-3 мм), гомогенной структуры, гладкие с ровными краями.

Колонии S. aureus на кровяном агаре окружены зоной гемолиза и часто имеют золотистый пигмент. На желточно-солевом агаре (ЖСА) колонии этого вида стафилококков окружены радужным венчиком помутнения среды, поскольку эти микроорганизмы способны продуцировать лецитиназу.

Для дифференцировки S. aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus ставят реакцию плазмокоагуляции, определяют ДНК-азную активность, фосфатазу, способность расщеплять маннит в анаэробных условиях, вызывать некроз кожи кролика.

Реакция плазмокоагуляции. В пробирку наливают 0,5 мл разведенной 1:5 кроличьей плазмы и петлей вносят в нее суточную агаровую культуру стафилококка. Пробирку помещают в термостат. Появление желеобразного сгустка свидетельствует о наличии у изучаемого штамма фермента плазмокоагулазы. Это характерно для S. aureus.

Определение ДНК-азы. На поверхность мясопептонного агара, содержащего ДНК, высевают штрихом суточную агаровую культуру стафилококка и помещают в термостат на 24 часа. После инкубации поверхность агара заливают 1 N раствором соляной кислоты. Если стафилококки продуцируют ДНК-азу, то вокруг колоний остается зона просветления.

Токсигенность выделенных культур стафилококков определяют в опыте in vitro с помощью реакции диффузной преципитации в геле.

Для установления источника инфекции определяют фаговар патогенных стафилококков.

Микробиологическая диагностика стрептококковых заболеваний

Наиболее частыми возбудителями стрептококковых заболеваний являются: S.pyogenes, S. agalactiae, S. bovis, стрептококки группы C и G, которые входят в семейство Streptococcaceae, род Streptococcus.

Материалом для исследования служит гной, отделяемое из зева и носа, ликвор, мокрота, кровь, моча, содержимое везикул, пустул.

Материал отбирают одноразовым шприцем или стерильным ватным тампоном, который помещают в пробирку с транспортной питательной средой (СКС- среда для контроля стерильности).

Кровь для бактериологического исследования в объеме 5-10 мл засевают в сахарный бульон непосредственно у постели больного таким образом, чтобы соотношение крови и питательной среды было не менее 1:10 - 1:20. Срок передачи патологического материала в бактериологическую лабораторию не должен превышать двух часов.

Микробиологическую диагностику стрептококковых заболеваний проводят микроскопическим, бактериологическим и серологическим методами.

Микроскопический метод. Из исследуемого материала готовят мазок, окрашивают его по Граму. При микроскопии в мазке обнаруживаются грамположительные кокки, которые располагаются короткими цепочками, иногда попарно или в виде единичных кокков. На основании изучения только морфологических и тинкториальных свойств невозможно определить род выявленных в препарате микробов.

Для выявления патогенного стрептококка в материале от больного используют реакцию имунофлюоресценции (РИФ). В этом случае используют специфические сыворотки, в которых антитела против стрептококков мечены флюорохромом (см. приложение).

На кровяном агаре стрептококки образуют мелкие (1-2 мм в диаметре) прозрачные или полупрозрачные колонии серовато-белого цвета. По типу гемолиза на кровяном агаре стрептококки разделяют на три группы.

Первая группа представлена β-гемолитическими стрептококками, способными вызывать полный лизис эритроцитов (полное просветление среды) вокруг колоний. Колонии прозрачные, слизистые, круглой формы, напоминают капли росы. Это характерно для свежевыделенных штаммов S. pyogenes. Блестящие колонии характерны для многих штаммов S.agalactiae.

Вторая группа представлена α-гемолитическими стрептококками, которые вызывают на кровяном агаре неполный гемолиз в виде полупрозрачной зоны зеленоватого оттенка. Зеленящие стрептококки растут в виде мелких колоний серого цвета с гладкой или шероховатой поверхностью. Такой рост характерен для многих видов стрептококков, вегетирующих на слизистой оболочке полости рта (S.salivarius, S.mutans, S.oralis и др.)

Третья группа представлена негемолитическими γ-стрептококками. Они не вызывают изменений кровяного агара в процессе своего роста и имеют слабо выраженную вирулентность.

Проба на каталазу. Тест основан на способности микроорганизмов, которые имеют этот фермент, расщеплять перекись водорода с образованием кислорода и воды. Для постановки этого теста чистую культуру помещают в каплю 3-10% раствора перекиси водорода на предметном стекле и растирают круговыми движениями. В положительном случае наблюдают выделение пузырьков газа. В отличие от стафилококков, стрептококки не имеют этого фермента.

Желчно-эскулиновый тест. Используется для предварительной идентификации стрептококков S.bovis, которые растут на желчно-эскулиновом агаре с образованием колоний темно-коричневого или черного цвета.

Рост в бульоне с 6,5% раствором NaCl. S.agalactiae в отличие от других стрептококков устойчив к высокой концентрации хлористого натрия и дает рост в бульоне через 24-48 часов инкубации в термостате при температуре 37°С.

PYR - тест. В основе теста лежит выявление фермента пиролидониламидазы, которая есть у большинства штаммов S. pyogenes и не встречается у других стрептококков. Исследуемую культуру вносят петлей в питательный бульон, содержащий 0,01% L-пиролидонил-β-нафтиламид и инкубируют при температуре 37°С в течение 4 часов. После добавления одной капли диметиламиноациннамальдегида в положительном случае появляется ярко-красная окраска.

Гидролиз гипурата натрия. В основе данного теста лежит способность S. agalactiae вызывать гидролиз гипурата натрия. Выделенную чистую культуру с помощью петли диспергируют в 1% водном растворе гипурата натрия. Через 2 часа инкубации при температуре 37°С добавляют 3,5% раствор нингидрина в смеси бутанола и ацетона (1: 1). При положительном результате после инкубации в течение 10 мин. появляется пурпурное окрашивание.

Дифференцирование стрептококков по антигенной структуре. Основывается на выявлении полисахаридного антигена клеточной стенки стрептококка. Применяют реакцию преципитации с группоспецифическими сыворотками групп А, В, С, G. Эти сыворотки наливают в 4 узкие преципитационные пробирки. Экстракт, полученный после обработки центрифугата чистой культуры стрептококка раствором хлористоводородной кислоты, осторожно, не смешивая жидкости, наслаивают на группоспецифические сыворотки. При положительной реакции на границе двух жидкостей появляется белое кольцо. Реакция преципитации проявляется через 5-30 мин.

Серологический метод диагностики стрептококковых заболеваний нашел применение в случае установления диагноза ревматизма. Для этого в сыворотке крови больного определяют титр антител к экстрацеллюлярным продуктам стрептококка - стрептолизину-О. Исследуют парные сыворотки больного с интервалом 7-10 дней. Препарат стрептолизин-О, который выпускают в сухом виде, растворяют и вносят в каждую пробирку с разведенной сывороткой. В день постановки опыта готовят 5% взвесь эритроцитов дефибринированной крови кролика и также вносят в каждую пробирку.

Реакция основана на нейтрализации способности стрептолизина-О лизировать эритроциты in vitro в случае присутствия в сыворотке больного антител против стрептококка (антистрептолизина-О). Максимальное разведение сыворотки, обеспечивающее задержку гемолиза эритроцитов, указывает на соответствующее количество антистрептолизина-О.

Титр антистрептолизина-О у практически здоровых лиц не превышает 250 международных единиц. При острых и хронических стрептококковых инфекциях он нарастает, причем при наличии ревматизма или нефрита с первых дней заболевания отмечается очень высокий титр антител (500 ед. и выше).

Грамположительные кокки представлены стафилококками и стрептококками — основными возбудителями гнойно-воспалительных поражений у человека.

Отличительные особенности стафилококков и стрептококков:
• отсутствие способности к спорообразованию,
• сферическая форма,
• положительная окраска по Граму.

Стафилококки. Особенности стафилококков. Отличительные особенности стафилококков

Стафилококки относят к отделу Firmicutes, семейству Microсоссасеае, роду Staphylococcus. Стафилококки распространены повсеместно; колонизируют кожные покровы и поверхности слизистых оболочек человека и животных. Первых представителей рода выделили Кох (1878) и Пастер (1880) из очагов гнойных поражений у человека.

Стафилококки представлены неподвижными клетками диаметром 0,5-1,5 мкм (рис. 12-1). В мазках стафилококки расположены одиночно, парами или гроздьями (рис. 12~2).

Свойство стафилококков образовывать скопления, напоминающие гроздья винограда в результате деления во взаимно перпендикулярных плоскостях, определило их название [от греч. staphyle, виноградная гроздь, + kokkos, зерно, ягода].

Основные дифференцировочные признаки стафилококков — характерная морфология и положительная окраска по Граму. Температурный оптимум стафилококков 30-37 °С.

Образующиеся липохромные пигменты защищают бактерии от действия токсических кислородных радикалов. Стафилококки каталаза-положительны; содержат цитохромы, но обычно оксидаза-отрицательны. Стафилококки проявляют высокую биохимическую активность: восстанавливают нитраты, вырабатывают Н₂S, разлагают мочевину и ферментируют многие углеводы с образованием кислоты.

Таблица 12-1. Основные инфекционные заболевания человека, вызываемые стафилококками

Антигены стафилокков

У стафилококков выделяют более 50 антигенных субстанций, разделяемых на родовые, видовые и типовые Аг. Многие стафилококки признаны аллергенами. Родовые Аг нередко способны перекрёстно реагировать с изоантигенами клеток организма человека (эритроцитов, почек и др.), что может привести к развитию аутоиммунной патологии. Видоспецифичными Аг стафилококков могут служить тейхоевые кислоты. Для S. aureus видоспецифичным Аг также является белок А. Стафилококки хорошо переносят высушивание, сохраняя вирулентность; погибают при прямом воздействии солнечного света в течение 10—12 ч. Они довольно устойчивы к нагреванию— при 70-80 X погибают за 20-30 мин, при 150 X— за 10 мин; сухой жар убивает их за 2 ч. Бактерии менее устойчивы к действию дезинфицирующих средств, но резистентны к чистому этанолу. По наличию коагулазы все стафилококки разделяют на две группы.

Среди коагулаза-положительных стафилококков поражения у человека вызывает лишь S. aureus; среди коагулаза-отрицательных видов — S. epidermidis и S. saprophyticus.

Читайте также: