Молоко и молочные продукты методы определения стафилококка гост

Обновлено: 28.03.2024

Настоящий стандарт распространяется на молоко и молочные продукты, закваски, бактериальные концентраты и препараты и устанавливает два метода определения Staphylococcus aureus в определенном объеме или навеске продукта - определение количества с предварительным обогащением; определение количества без предварительного обогащения.

Метод определения Staphylococcus aureus с предварительным обогащением основан на высеве навески продукта и разведении его в жидкую селективную среду, инкубировании посевов, учете положительных пробирок (колб), пересеве на плотные селективные среды с последующим подтверждением принадлежности выросших колоний к Staphylococcus aureus .

Метод определения количества Staphylococcus aureus без предварительного обогащения посевом на агаризованные селективные среды основан на высеве продукта или разведении его на поверхности плотной среды, инкубировании, подсчете типичных колоний Staphylococcus aureus с последующим подтверждением выросших колоний к Staphylococcus aureus по плазмокоагулирующей способности.

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 9225-84 Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа

ГОСТ 10444.11-89 Продукты пищевые. Методы определения молочнокислых микроорганизмов

ГОСТ 27583-88 Яйца куриные пищевые. Технические условия

сухая плазма кроличья, цитратная;

контрольный штамм Staphylococcus aureus ;

калия теллурит [2], раствор с массовой концентрацией 10 г/дм 3 ;

глицин [1], раствор с массовой концентрацией 200 г/дм 3 ;

натрия пируват [8], раствор с массовой концентрацией 200 г/дм 3 ;

литий хлористый, гексагидрат [4];

экстракт дрожжевой [3] или

экстракт дрожжевой, очищенный [7];

фуксин основной [5], спиртовой раствор с массовой концентрацией 50 г/дм 3 ;

3.2 Питательные среды

3.2.3 Желточную эмульсию готовят следующим образом.

3.2.4 Солевой бульон*:

Состав: натрий хлористый ( NaCl ) - 7,5 г;

питательный сухой бульон - 1,5 г;

или гидролизованное молоко - 100 см 3 .

Приготовление: в 100 см 3 дистиллированной воды вносят 1,5 г сухого питательного бульона, кипятят 1-2 мин, фильтруют через ватный тампон, добавляют 7,5 г NaCl , устанавливают рН (6,9 ± 0,1).

Разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при температуре (121 ± 1) °С в течение (10 ± 1) мин.

Или к 100 см 3 гидролизованного молока добавляют 7,5 г NaCl , устанавливают рН (6,9 ± 0,1), разливают и стерилизуют, как указано выше.

3.2.5 Желточно-солевой агар**

Состав: питательный агар***

для культивирования микроорганизмов (на основе гидролизата кильки) [10] - 35 г

питательный агар II ***

(на основе гидролизата кормовых дрожжей) [10] - 24 г;

натрий хлористый ( NaCl ) - 75 г;

эмульсия желточная - 50,0 см 3 ;

вода дистиллированная - 1 дм 3 .

Приготовление: в 1 дм 3 дистиллированной воды вносят 36 г питательного агара для культивирования микроорганизмов или 24 г питательного агара сухого II , добавляют 75 г хлористого натрия ( NaCl ), кипятят до полного расплавления агара, фильтруют через ватный тампон, разливают во флаконы или колбы и стерилизуют при температуре (121 ± 1) °С в течение (20 ± 1) мин. После стерилизации охлаждают до температуры (45 ± 1) °С и добавляют 50 см 3 предварительно подготовленной желточной эмульсии. Смесь тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Чашки со средой хранят в холодильнике не более 5 сут.

3.2.6 Молочно-солевой агар**

Состав: питательный агар*** для культивирования микроорганизмов (на основе гидролизата кильки) [10] - 35 г

или питательный агар II *** (на основе гидролизата кормовых дрожжей) [10] - 24,0 г; натрий хлористый ( NaCl ) - 75,0 г;

молоко обезжиренное - 100 см 3 ;

вода дистиллированная - 1 дм 3 .

Приготовление: среду готовят, указано в 3.2.5, но после охлаждения до температуры (45 ± 1) °С добавляют вместо желточной эмульсии 100 см 3 стерильного обезжиренного молока. Смесь тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Чашки со средой хранят в холодильнике не более 5 сут.

3.2.7 Агар Байрд-Паркера * 4

Состав. Основа среды:

дрожжевой экстракт [3] - 1,0 г;

* Допускается применение солевого бульона [9], который готовится согласно указанию на этикетке.

** Допускается использовать солевой агар [9], который готовится согласно указанию на этикетке и к которому после стерилизации добавляется желточная эмульсия или обезжиренное молоко.

*** При изменении заводом-изготовителем количества вносимой среды на 1 дм дистиллированной воды, количество среды вносится согласно указанию на этикетке.

* 4 Допускается использовать агар Байрд-Паркера [9]. Среда готовится согласно указанию на этикетке.

мясной экстракт - 5,0 г;

литий хлористый, гексагидрат [4] - 5,0 г;

вода дистиллированная - 1 дм 3 .

Раствор пирувата натрия:

пируват натрия [8] - 20,0 г;

вода дистиллированная - 100 см 3 .

вода дистиллированная - 100,0 см 3 .

3.2.7.1 Приготовление основы среды: в 1 дм 3 дистиллированной воды вносят 10 г триптона, 5 г мясного экстракта, 1 г дрожжевого экстракта, 5 г хлористого лития, 20 г агара.

При отсутствии мясного экстракта, триптона и дрожжевого экстракта вместо дистиллированной воды применяют 1 дм 3 мясопептонного бульона или питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой или питательный агар сухой II [10].

Все компоненты, внесенные в 1 дм 3 дистиллированной воды (мясопептонный бульон), нагревают и перемешивают до полного растворения, охлаждают до температуры 50-60 °С. Устанавливают рН (7,2 ± 0,1), разливают в колбы или бутылки по 90 см 3 и стерилизуют при температуре (121 ± 1) °С в течение (20 ± 1) мин.

При использовании сухой среды в 1 дм 3 дистиллированной воды вносят 36 г питательного агара для культивирования микроорганизмов или 24 г питательного агара сухого II , добавляют 5 г хлористого лития. Нагревают до полного растворения, охлаждают до температуры 50-60 °С, устанавливают рН (7,2 ± 0,1), разливают и стерилизуют, как указано выше.

Готовую основу среды хранят не более 30 сут при температуре (6 ± 2) °С.

3.2.7.2 Перед использованием к 90 см 3 расплавленной основы среды добавляют асептически стерилизованные фильтрованием через мембранный фильтр растворы: 6,3 см 3 раствора глицина, 5 см 3 раствора пирувата натрия; 1 см 3 раствора теллурита калия; 5 см 3 желточной эмульсии.

Допускается растворы глицина, пирувата натрия, теллурита калия и желточную эмульсию готовить в асептических условиях на стерильной дистиллированной воде.

После тщательного перемешивания приготовленную среду разливают в чашки Петри.

Чашки со средой можно хранить не более 48 ч.

4.1 Приготовление растворов и реактивов

4.1.1 Раствор плазмы кроличьей цитратной готовится согласно инструкции по применению плазмы, прилагаемой к упаковке.

4.1.3 Приготовление реактивов для окраски по Грому

4.1.3.1 Приготовление реактива 1

В 100 см 3 этилового спирта растворяют 0,5 г кристаллического фиолетового [6].

4.1.3.2 Приготовление реактива 2

К 96 см 3 спиртового раствора йодистого калия массовой концентрацией 5 г/дм 3 добавляют 2 см 3 спиртового раствора основного фуксина [5] массовой концентрацией 50 г/дм 3 и 2 см 3 спиртового раствора йода массовой концентрацией 50 г/дм 3 .

Йодистый калий растворяют в спирте на водяной бане при температуре (45 ± 5) °С при постоянном помешивании.

5.1 Метод определения количества Staphylococcus aureus с предварительны м обогащением

5.1.1 Подготовка и проведение контроля

5.1.1.1 Из навески продукта готовят ряд десятикратных разведений по ГОСТ 9225 так, чтобы можно было определить наличие или отсутствие Staphylococcus aureus в определенной массе (объеме), указанной в нормативном документе на конкретный продукт.

5.1.1.2 Навеску продукта или его разведения засевают по 1 см 3 в пробирки или колбочки с солевым бульоном (3.2.4).

Соотношение между количеством высеваемого продукта или его эквивалентным разведением и питательной средой 1 : 10.

Пробирки и колбочки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 24 ч.

5.1.1.3 Для подтверждения принадлежности микроорганизмов, выросших на солевом бульоне, к Staphylococcus aureus делают пересев петлей из бульона для получения изолированных колоний на чашки Петри с подсушенными средами типа Байрд-Паркера (3.2.7), желточно-солевой агар или молочно-солевой агар (3.2.5; 3.2.6).

Чашки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 24-48 ч.

5.1.1.4 После термостатирования посевы просматривают и отмечают рост характерных колоний.

На желточно-солевом агаре колонии Staphylococcus aureus имеют форму плоских дисков диаметром 2-4 мм белого, желтого, кремового, лимонного, золотистого цвета с ровными краями; вокруг колоний образуется радужное кольцо и зона помутнения среды.

На молочно-солевом агаре колонии Staphylococcus aureus растут в виде непрозрачных круглых колоний, окрашенных от белого до оранжевого цвета, диаметром 2-4 мм, слегка выпуклых.

На среде Байрд-Паркера колонии Staphylococcus aureus растут в виде черных, блестящих, выпуклых колоний диаметром 1-1,5 мм, окруженных зоной просветления среды шириной 1-3 мм.

5.1.1.5 С каждой чашки Петри отбирают не менее пяти характерных колоний и пересеивают на поверхность скошенного питательного агара, как указано в 3.2.5, но без добавления хлористого натрия и желточной эмульсии.

Посевы выдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 24 ч. У выросших колоний определяют отношение к окраске по Граму и коагулированию плазмы кролика.

5.1.1.6 Из пяти изолированных, характерных для Staphylococcus aureus колоний, делают препараты, окрашивают по Граму и микроскопируют.

Для приготовления препарата на чистое и охлажденное после фламбирования предметное стекло наносят петлей каплю дистиллированной воды, в которую вносят петлей небольшое количество агаровой культуры, не размешивая в воде. Затем вносят петлей каплю реактива 1, приготовленного по 4.1.3.1. Смесь распределяют на участке примерно 1 см 2 , просушивают при температуре (20 ± 2) °С и фиксируют, медленно пронося предметное стекло над пламенем горелки. На одном стекле можно готовить по шесть - восемь мазков, отделяя их один от другого линиями, проведенными с лицевой стороны стекла.

Препарат ополаскивают водой и тщательно просушивают фильтровальной бумагой.

После просушивания на препарат наносят с избытком реактив 2, приготовленный по 4.1.3.2 так, чтобы жидкость покрыла всю поверхность стекла. Продолжительность окрашивания 0,5 -1 мин. После окрашивания препарат быстро ополаскивают проточной водой, направляя струю под углом на стекло, помещенное вертикально. Препарат просушивают фильтровальной бумагой и просматривают под микроскопом с иммерсионной системой. Микробы, красящиеся по Граму, будут темно-фиолетового цвета, не красящиеся по Граму - красного цвета.

Стафилококки окрашиваются по Граму положительно (темно-фиолетового цвета), имеют шарообразную форму и располагаются скоплениями, чаще всего напоминающими гроздья винограда.

5.1.1.7 Постановка реакции плазмокоагуляции

В пробирку с 0,5 см 3 разведенной кроличьей плазмы вносят петлю суточной агаровой культуры. Внесенную культуру тщательно размешивают. Одну пробирку с плазмой оставляют незасеянной, а в другую засевают контрольный штамм Staphylococcus aureus (коагулазоположительный стафилококк). Пробирки помещают в термостат и выдерживают при температуре (37 ± 1) °С в течение 3-6 ч. Если через 6 ч коагуляции плазмы не произошло, то оставляют эти пробирки до 24 ч. Если через 24 ч плазма не свернулась, то испытуемую культуру стафилококка относят к коагулазоотрицательной.

При определении коагулазной активности реакцию считают отрицательной в тех случаях, когда в плазме не образуются отдельные нити или сгустки, или в тех случаях, когда в плазме появились отдельные нити (реакцию плазмокоагуляции оценивают на один плюс).

Реакцию считают положительной, если:

+ + + - сгусток, имеющий небольшой отсек;

+ + - сгусток в виде взвешенного мешочка.

Все три варианта являются положительным результатом.

При получении положительной реакции считают, что в посевах обнаружен Staphylococcus aureus .

5.1.2 Обработка результатов контроля

Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

5.1.3 Оформление результатов контроля

Морфологические, культуральные свойства и положительная реакция плазмокоагуляции свидетельствуют о присутствии коагулазоположительных стафилококков в засеянной массе продукта.

5.2 Метод определения количества Staphylococcus aureus без предварительного обогащения

5.2.1 Проведение контроля

5.2.1.1 1 см 3 жидкого продукта или его разведения (5.1.1) наносят на поверхность питательных сред (3.2.5 или 3.2.6 или 3.2.7) в 3 чашки Петри, тщательно растирают шпателем по поверхности питательной среды. Посевы инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение 24-48 ч. Чашки Петри с посевами инкубируют дном вверх.

5.2.1.2 После термостатирования подсчитывают количество характерных колоний на каждой чашке Петри (5.1.4). С каждой чашки Петри отбирают не менее пяти характерных и/или подозрительных колоний Staphylococcus aureus , а в случае роста менее пяти - все колонии характерные для Staphylococcus aureus и пересевают на поверхность скошенного питательного агара, разлитого в пробирки, как указано в 3.2.5, но без добавления хлористого натрия и желточной эмульсии. Пробирки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 24 ч.

У выросших культур определяют отношение к окраске по Граму и коагулированию плазмы кролика в соответствии с требованиями 5.1.6 и 5.1.7.

5.2.2 Обработка результатов контроля

Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

Если при изучении характерных колоний в 80 % случаев, то есть не менее чем в 4 из 5 колоний подтвержден рост Staphylococcus aureus , то считают, что все характерные колонии, выросшие на чашках Петри (5.1.7), принадлежат к Staphylococcus aureus . В остальных случаях количество Staphylococcus aureus определяют, исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных колоний, взятых для подтверждения.

5.2.3 Оформление результатов контроля

Количество колоний Staphylococcus aureus в 1 г или 1 см 3 Х после определения его в определенной навеске продукта вычисляют по формуле

где - количество колоний, выросших на всех чашках Петри в пределах одного разведения или засеянного объема;

п - число десятикратных разведений.

Подсчитываем количество колоний Staphylococcus aureus , выросших на трех засеянных чашках при посевах продукта или его разведений:

1 г или 1 см 3 продукта - 84 96 72

10 -1 разведение - 9 10 7

10 -1 разведение - 84 96 72

10 -2 разведение - 99 10 7

[1] ТУ 6-09-09-200-84 Глицин для медицинских целей

[2] ТУ 6-09-2060-77 Калий теллуристокислый водный

[3] ТУ 6-09-3462-73 Экстракт дрожжевой. Технические условия

[4] ТУ 6-09-3751-83 Литий хлорид 1-водный. Технические условия

[5] ТУ 6-09-3804-82 Фуксин основной для микробиологических целей. Технические условия

[6] ТУ 6-09-4119-75 Кристаллический фиолетовый. Технические условия

[7] ТУ 6-09-4510-77 Экстракт дрожжевой очищенный. Технические условия

[9] ТУ 10-02-02-789-176-94 Среды питательные сухие для определения Staphylococcus aureus . Технические условия

Ключевые слова : питательные среды, коагулазоположительные стафилококки, характерные колонии, окраска по Граму, коагулирование плазмы

ГОСТ 27583-88. На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 52121-2003. Яйца куриные пищевые. Технические условия

МОЛОКО И МОЛОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ

Методы определения Staphylococcus aureus

Milk and milk products. Methods for determination of staphylococcus aureus

1 РАЗРАБОТАН Всероссийским научно-исследовательским институтом мясной промышленности (ВНИМИ) и Межгосударственным и техническим комитетом по стандартизации МТК 186 "Молоко и молочные продукты"

ВНЕСЕН Госстандартом Российской Федерации

2 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол N 11 от 25 апреля 1997 г.)

За принятие проголосовали:

Наименование национального органа по стандартизации

Главная государственная инспекция Туркменистана

3 Постановлением Государственного комитета Российской Федерации по стандартизации, метрологии и сертификации от 25 сентября 1997 г. N 341 межгосударственный стандарт ГОСТ 30347-97 введен в действие непосредственно в качестве государственного стандарта Российской Федерации с 1 июля 1998 г. с правом досрочного введения

4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

5 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Август 2009 г.

1 ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

Настоящий стандарт распространяется на молоко и молочные продукты, закваски, бактериальные концентраты и препараты и устанавливает два метода определения Staphylococcus aureus в определенном объеме или навеске продукта - определение количества с предварительным обогащением; определение количества без предварительного обогащения.

Метод определения Staphylococcus aureus с предварительным обогащением основан на высеве навески продукта и разведении его в жидкую селективную среду, инкубировании посевов, учете положительных пробирок (колб), пересеве на плотные селективные среды с последующим подтверждением принадлежности выросших колоний к Staphylococcus aureus.

Метод определения количества Staphylococcus aureus без предварительного обогащения посевом на агаризованные селективные среды основан на высеве продукта или разведении его на поверхности плотной среды, инкубировании, подсчете типичных колоний Staphylococcus aureus с последующим подтверждением выросших колоний к Staphylococcus aureus по плазмокоагулирующей способности.

2 НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 9225-84 Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа

ГОСТ 10444.11-89 Продукты пищевые. Методы определения молочнокислых микроорганизмов

ГОСТ 27583-88* Яйца куриные пищевые. Технические условия

* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 52121-2003.

3 СРЕДСТВА КОНТРОЛЯ И ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ УСТРОЙСТВА

3.1 Аппаратура, материалы, реактивы

по ГОСТ 9225 со следующими дополнениями:

сухая плазма кроличья, цитратная;

контрольный штамм Staphylococcus aureus;

калия теллурит [2], раствор с массовой концентрацией 10 г/дм;

глицин [1], раствор с массовой концентрацией 200 г/дм;

кристаллический фиолетовый [6];

натрия пируват [8], раствор с массовой концентрацией 200 г/дм;

литий хлористый, гексагидрат [4];

экстракт дрожжевой [3] или

экстракт дрожжевой, очищенный [7];

фуксин основной [5], спиртовой раствор с массовой концентрацией 50 г/дм;

яйца куриные пищевые по ГОСТ 27583;

витаминный препарат "ЭКД" сухой [11].

3.2 Питательные среды

3.2.1 Гидролизованное и стерильное обезжиренное молоко по ГОСТ 10444.11 (3.3.1 и 3.3.3).

3.2.2 Среды питательные сухие для определения Staphylococcus aureus [9] или питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой и питательный агар сухой II, выпускаемые Дагестанским НПО "Питательные среды" [10].

3.2.3 Желточную эмульсию готовят следующим образом

Свежее куриное яйцо моют водопроводной водой, затем протирают ваткой, смоченной в спирте, и обсушивают. Отделяют желток и вносят его в 100 см стерильного раствора хлористого натрия по ГОСТ 9225. Тщательно перемешивают. Приготовленная эмульсия может храниться при температуре 0-5 С° не более 72 ч.

3.2.4 Солевой бульон*:

* Допускается применение солевого бульона [9], который готовится согласно указанию на этикетке.

Состав: натрий хлористый (NaCl) - 7,5 г;

питательный сухой бульон - 1,5 г;

или гидролизованное молоко - 100 см.

Приготовление: в 100 см дистиллированной воды вносят 1,5 г сухого питательного бульона, кипятят 1-2 мин, фильтруют через ватный тампон, добавляют 7,5 г NaCl, устанавливают рН (6,9±0,1).

Разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение (10±1) мин.

Или к 100 см гидролизованного молока добавляют 7,5 г NaCl, устанавливают рН (6,9±0,1), разливают и стерилизуют, как указано выше.

3.2.5 Желточно-солевой агар*

* Допускается использовать солевой агар [9], который готовится согласно указанию на этикетке и к которому после стерилизации добавляется желточная эмульсия или обезжиренное молоко.

Состав: питательный агар*

для культивирования микроорганизмов (на основе гидролизата кильки) [10] - 35 г

питательный агар II*

(на основе гидролизата кормовых дрожжей) [10] - 24 г;

натрий хлористый (NaCl) - 75 г;

эмульсия желточная - 50,0 см;

вода дистиллированная - 1 дм.

* При изменении заводом-изготовителем количества вносимой среды на 1 дм дистиллированной воды, количество среды вносится согласно указанию на этикетке.

Приготовление: в 1 дм дистиллированной воды вносят 36 г питательного агара для культивирования микроорганизмов или 24 г питательного агара сухого II, добавляют 75 г хлористого натрия (NaCl), кипятят до полного расплавления агара, фильтруют через ватный тампон, разливают во флаконы или колбы и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение (20±1) мин. После стерилизации охлаждают до температуры (45±1) °С и добавляют 50 см предварительно подготовленной желточной эмульсии. Смесь тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Чашки со средой хранят в холодильнике не более 5 сут.

3.2.6 Молочно-солевой агар*

* Допускается использовать солевой агар [9], который готовится согласно указанию на этикетке и к которому после стерилизации добавляется желточная эмульсия или обезжиренное молоко.

Состав: питательный агар* для культивирования микроорганизмов (на основе гидролизата кильки) [10] - 35 г

или питательный агар II* (на основе гидролизата кормовых дрожжей) [10] - 24,0 г;

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 28 ноября 2016 г. N 1824-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 30347-2016 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 сентября 2017 г.

ВНЕСЕНА поправка, опубликованная в ИУС N 5, 2017 год

Поправка внесена изготовителем базы данных

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на молоко и молочную продукцию и устанавливает методы определения Staphylococcus aureus (S. aureus) в определенном объеме или навеске продукта - определение с предварительным обогащением и определение без предварительного обогащения.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты*

* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 12.1.019-2009

ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ 5962-2013 Спирт этиловый ректификационный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ 33951-2016 Молоко и молочная продукция. Методы определения молочнокислых микроорганизмов

ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов

ГОСТ 26809.1-2014 Молоко и молочная продукция. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 1. Молоко, молочные, молочные составные и молокосодержащие продукты

ГОСТ 32901-2014 Молоко и продукты переработки молока. Методы микробиологического анализа

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применен следующий термин с соответствующими определениями:

3.1 коагулазоположительные стафилококки: Грамположительные, каталазоположительные микроорганизмы, которые образуют типичные и/или атипичные колонии на или в селективно-диагностической питательной среде, дающие положительную реакцию на коагулазу на кроличьей плазме.

3.2 Staphylococcus aureus (S. aureus): Коагулазоположительные стафилококки, образующие ацетоин и ферментирующие мальтозу в аэробных условиях при определении этих биохимических тестов по методам, приведенным в настоящем стандарте.

4 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда и реактивы

4.1 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда и реактивы - по ГОСТ 32901 со следующими дополнениями:

Текст ГОСТ 31710-2012 Молоко и продукты на основе молока. Обнаружение термонуклеазы, образуемой коагулазоположительными стафилококками

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ. МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION. METROLOGY AND CERTIFICATION

31710-

(ISO 8870:2006)

МОЛОКО И ПРОДУКТЫ НА ОСНОВЕ МОЛОКА

Обнаружение термонуклеазы, образуемой коагулазоположительными стафилококками

(ISO 8870:2006, MOD)


Стенда ртинформ 2013

Предисловие

Сведения о стандарте

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 1 октября 2012 г. №51)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 31ВВ) 004—97

Код страны по МК(ИС0 31вв) 004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Госстандарт Республики Беларусь

Госстандарт Республики Казахстан

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2012 г. № 1770-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 31710—2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2013 г.

5 Настоящий стандарт модифицирован по отношению к международному стандарту ISO 8370:2006 Milk and mik-based products — Detection of themrmoneuclease produced by coagulase-positive staphylococci (Молоко и продукты на основе молока. Обнаружение термонуклеаэы, образуемой коагулазоположигельными стафилококками) путем изменения отдельных фраз (слов, значений показателей, ссылок), которые выделены в тексте курсивом.

Степень соответствия — модифицированная (MOD).

Стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 52832—2007

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен. тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

Содержание


ГОСТ 31710—2012 (ISO 8870:2006)

МОЛОКО И ПРОДУКТЫ НА ОСНОВЕ МОЛОКА Обнаружение термоиуклеаэы, образуемой коагулазоположительными стафилококками

Milk and milk-based products.

Detection of themrmoneuclease produced by coagulase-positive staphylococci

Дата введения — 2013—07—01

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает качественный метод определения гермонуклеазы. образу* емой коагулазоположительными стафилококками в молоке и продуктах на основе молока.

Наличие в молоке и продуктах на основе молока термонуклеазы может использоваться как индикатор достижения роста стафилококков опасного уровня и может отражать вероятное присут* ствие стафилококкового энтеротоксина.

2 Нормативные ссылки

8 настоящем стандарте использованы ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОС Т ISO 7218— 11 Микробиология продуктов питания и кормовых продуктов. Общие правила микробиологических исследований

ГОСТ 9225—84 Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа

ГОСТ 26809—86 Молокоимолочныелродукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу

3 Термины и определения

8 настоящем стандарте применен следующий термин с соответствующим определением:

3.1 термонуклеаэа (thermonuclease>: Фермент, образуемый коагулазоположительными стафилококками. гидролизирующий дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) при условиях, описанных в настоящем стандарте.

4 Сущность метода

Метод основан на расщеплении ДНКтермонуклеаэой. при котором цвет агара изменяется ссинего на розовый. Цветная реакция обусловлена метахроматичесхимисеойствамитолуидиновогосинегоО.

5 Подготовка к испытанию

5.1 Основные материалы

Для текущей лабораторной практики см. ГОСТ 9225.

Используют реактивы только аналитического качества, если не оговорено иначе, и только дистиллированную или деминерализованную воду, или воду аналогичной чистоты.

Если приготовленные среды и реактивы не используют немедленно, их хранят, если не оговорено иначе, в защищенном от света месте при температуре от 0 *С до 5 *С не более 1 мес в условиях, предотвращающих любые изменения в их составе.

5.2 Толуидиновый синий О-ДНК агар

трис(гидроксиметил)аминометан (C4H11N03) — 6,06 г: хлорид кальция (CaCi2) — 0.11г. вода —1000 см 3 .

Растворяюттрис(гидроксиметил )аминометан и хлорид кальцияе 980 см 3 воды. Доводят рНдоЭ.Ои воду до 1000 см 5 .

5.2.2 Основа среды

дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) — 0.3 г: хлорид натрия (NaCI) —Ю.О г; агар —10.0 г:

трис-буфер (см. 5.2.1)— 1000 см 3

5.2 2.2 Приготовление

Компоненты нагревают на водяной бане (см. 6.2) до полного растворения ДНКи агара (около 1.5 ч).

5.2.3 Раствор толуидинового синего О

толуидиновый синий О (CtsH16N3SCI) s > — 0.31 г: вода — 10 см 3 .

Толуидиновый синий О растворяют в воде при слабом нагревании и фильтруют через марлю (см. 6.12).

5.2.4 Полная среда

основа среды (см. 5.2.2) —1000 см 3 ;

раствор толуидинового синего О (см. 5.2.3) — 3 см 3

Основу среды охлаждают до (50 ± 1) "С. добавляют профильтрованный раствор толуидинового синего О и перемешивают.

Полная среда может храниться маленькими порциями в закупоренных колбах или бутылях несколько месяцев в защищенном от света месте при температуре от О *С до 5 *С.

5.2.5 Приготовление чашек со средой

В чашки Петри (см. 6.6) вносят по 13 см 3 свежей полной среды (см. 5.2.4) или хранившейся среды, предварительно расплавленной при (50 ± 1) *С. Дают агару застыть.

Приготовленные среды могут храниться не более 2 мес (дном кверху и защищенными от высыхания) в защищенном от света месте при температуре от 0 в С до 5 *С.

5.3 Соляная кислота. c(HCL) = 2 мольЛЭм 3 .

5.4 Гидроокись натрия. c(NaOH) - 2 мольЛЭм 3 .

5.5 Трихлоруксусная кислота. с(СС/3СООН) * 3 моль/дм 3 .

Растворяют 49,02 г трихлоруксусной кислоты в 100 см 3 воды.

5.6 Обезжиренное сухое молоко

Обезжиренное сухое молоко должно быть свободно от термонуклеаэы. Наличие термонуклеаэы проверяют в каждой новой партии, используя метод, приведенный в настоящем стандарте.

5.7 Бульон на основе сердечно-мозгоеого перевара (ВН! бульон)

ферментативный перевар животных тканей —Ю.О г;

Толуидиновый синий О (цветовой индекс: C.I. основной синий 17; C.l. No. 52040).

обезвоженный перевар телячьего мозга — 12.5 г.

обезвоженный перевар бычьего сердца — 5.0 г;

хлорид натрия — 5.0 г;

моногидрофосфат натрия, безводный (Na2HP04) — 2.5 г;

вода — 1000 см 3

Растворяют компоненты среды или готовую дегидратированную питательную среду в воде, при необходимости подогревают. Устанавливают такой уровень pH. чтобы после стерилизации он соответствовал 7,410.2 при температуре 25 *С.

Среду разливают по 5 см 3 в пробирки (см. 6.11).

Среду стерилизуют при (121 ± 1) *С в течение 15 мин.

5.8 Тест-микроб (положительный контроль)

8 качестве положительного контроля используют любой штамм Staphylococcus aureus, образующий термокуклеазу.

6 Оборудование и лабораторная посуда

Используют оборудование, необходимое для подготовки проб согласно ГОСТ ISO 7218. обычное лабораторное оборудование, а также следующее:

6.1 Термостат, поддерживающий температуру (37 ± 1) в С.

6.2 Водяная баня, поддерживающая температуру (5011) в С, а также температуру кипячения (для разогрева и охлаждения питательных сред и реактивов до необходимой температуры).

6.3 Центрифуга с частотой вращения более 27 000 мин* 1 .

6.4 Центрифуга с частотой вращения более 2 800 мин -1 .

6.5 Металлический цилиндрический пробойник диаметром около 2 мм для прореэания лунок в толуидиноеом синем О-ДНК агаре.

6.6 Микропипетки емкостью 0,01 см 3 .

6.7 Бактериологические петли из проволоки платино-иридиевого или никельхромового сплава диаметром около Змм.

6.8 Чашки Петри, стеклянные или пластиковые, диаметром 90 и 100 мм.

6.9 Мерные цилиндры вместимостью 10.100 и 1000 см 3 .

6.10 Бутыли с пробками для хранения толуидиноеого синего О-ДНК агара.

6.11 Пробирки диаметром 15 мм и длиной 100 мм.

При одинаковой спецификации одноразовое оборудование предпочтительнее многоразового.

Стеклянная лабораторная посуда должна выдерживать повторные циклы стерилизации и быть химически инертной.

7 Отбор проб

Отбор проб не является частью метода, приведенного в настоящем стандарте. Рекомендуемым методом отбора проб является метод, приведенный в ГОСТ 26809.

Образцы хранят в условиях, предотвращающих их порчу и любые изменения в составе.

8 Проведение испытания

Величину pH молока, восстановленного сухого молока или гомогенизированных продуктов на основе молока после добавки обезжиренногосухого молока доводят до 3.8 и центрифугируют. Супернатант осаждают трихлоруксусной кислотой. Центрифугируют. pH осадка доводят до pH 8,5 и добавляют трис-буфер. Раствор прогревают на кипящей водяной бане в течение 15 мин иопределяют наличие тер-монуклеаэной активности на толуидиноеом синем О-ДНК агаре.

8.1 Подготовка образцов

pH пробы молока объемом 100 см 3 доводят соляной кислотой (см. 5.3) до З.в.

8.1.2 Продукты на основе молока

Суспензируют 20 г образца и 5 г обезжиренного сухого молока (см. 5.6) в 50 си 3 воды. pH пробы доводят соляной кислотой (см. 5.3) до 3.8.

Добавление обезжиренного сухого молока не является обязательным для всех продуктов на основе молока. При исследовании, например, сухого обезжиренного молока, цельного сухого молока или казенное его можно не добавлять. Добавление обязательно в случае сухой сыворотки, йогурта, фруктового йогурта и фруктового мороженого. Для остальных продуктов на основе молока добавление обезжиренного сухого молока также рекомендуется.

Для испытания сыра можно использовать альтернативную процедуру. Суспензируют с помощью блендера 20 гсыра в 100 см 3 теплой (45 *С) воды. После смешивания pH пробы доводят соляной кислотой (6 моль/л) до 4.5. Суспензию переносят в плоскодонную колбу объемом 750 см 3 . Добавляют воды до конечного объема, в 12,5 раза большего массы сыра. Суспензию встряхивают в течение ночи (16 ч) на водяной бане при температуре (25 ± 1) в С. Снова доводят pH до 4.5. Суспензию центрифугируют и фильтруют. Отбирают 100 см 3 фильтрата и проводят испытание согласно 8.1.3.

Если сухое обезжиренное молоко не добавляется, суспензируют 20 г в 40 см 3 воды. pH пробы доводят соляной кислотой (см. 5.3) до 3.8.

8.1.3 Общий ход испытания

8.1.3.1 Центрифугируют (см. 6.3) пробу с частотой вращения от 27000 мин- 1 до 34000 мин- 1 при 5 *С в течение 20 мин.

8.1.3.2 Супернатант декантируют. Добавляют 0,05 см 3 холодной трихлорацетоуксусной кислоты (см. 5.5) на 1 см 3 пробы и смешивают.

8.1.3.3 Центрифугируют с частотой вращения от 27000 мин 1 до 34000 мин - 1 при 5 *С в течение 20 мин.

8.1.3.4 Осадок растворяют в 1 см 3 трис-буфера (см. 5.2.1). pH доводят до 8.5 с помощью гидроокиси натрия (см. 5.4). Раствор разводят трис-буфером до 2 см 3 , перемешивают.

8.1.3.5 Раствор прогревают в кипящей водной бане (см. 6.2) в течение 15 мин.

8.2 Приготовление тест-культуры (положительный контроль)

8.2.2 Супернатант прогревают на кипящей водяной бане (см. 6.2) в течение 15 мин. Прогретый супернатант может храниться при температуре 5 в С не более четырех недель.

При необходимости любой штамм Staphylococcus aureus (например, выделенный из молока или продуктов на основе молока) может быть исследован на наличие термонуклеазы методом, приведенным выше для тест-культуры.

8.3 Приготовление толуидинового синего О-ДНК агара

Цилиндрическим пробойником (см. 6.5) в агаре (см. 5.2.5) прорезают бее лунки. Агар поверхностью вниз подсушивают в термостате (см. 6.1) со снятой крышкой и в течение 60 мин при температуре (37 ± 1) *С.

При испытании нескольких образцов в одном агаре прорезают до 10 лунок.

8.4 Определение термонуклеазы

8.4.1 В одну из лунок вносят 10 мм 3 положительного контроля (см. 8.2.2), в остальные — по 10 мм 3 проб (см. 8.1.3.5).

8.4.2 Чашки Петри с крышками сверху инкубируют (см. 6.1)4 ч при температуре (37 ± 1) *С. При отрицательном результате чашки инкубируют до 24 ч.

9 Обработка результатов

Розовое гало (ореол или зона свечения) диаметром более 1 мм вокруг лунки свидетельствует о наличии термонуклеазы (необходимо сравнитьс положительным контролем). Гало любого иного цвета, кроме розового, не считается признаком термонуклеаэной активности.

Положительный тест на термонуклеазу указывает на рост коагулаэоположительных стафилококков в количестве до 10 е КОЕ/r и более, что приводит* образованию знтеротоксина.

Таков количество коагулаэоположительных стафиллококков может выработать знтвроток-сине концентрации, достаточнойдляразвитиязаболевания. Молоко и продукты на основе молока, в которых при использовании настоящего метода испытаний выявлена термонуклеаза, образуемая коагулазоположительными стафилококками, в обязательном порядке подлежат проверке на наличие знтеротоксина.

10 Протокол испытания

8 протоколе испытания указывают:

• всю информацию, необходимую для полной идентификации образца;

• метод отбора проб:

• использованный метод испытания со ссылкой на настоящий стандарт:

• все детали исследования, не оговариваемые в настоящем стандарте. или рассматриваемые как необязательные, а также детали иного свойства, могущие оказать влияние на результаты исследований;

• полученные результаты и повторяемость (если определялась), окончательный уточненный результат испытания.

УДК 637.544:006.354 МКС 67.100.01 Н09 MOD

Редактор Н.В. Галанова Технический редактор Н.С. Гришанове Корректор И.А. Королева Компьютерная верстка Л.А. Круговой

Сдано в набор 22.04.2013. Подписано а печать 22.05.2013. Формат б0> 64X Гарнитура Ариал.

Уел. печ. л. 1,40. Уч.-иад. л. 0,75. Тираж 163экз. За*. 505

. 123095 Москва. Гранатный пер.. 4.

Набрано во на ПЭВМ


Превью ГОСТ 31710-2012 Молоко и продукты на основе молока. Обнаружение термонуклеазы, образуемой коагулазоположительными стафилококками

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

1 ПОДГОТОВЛЕН ОАО "Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации" совместно с ГУ "Ярославская государственная испытательная лаборатория молочного сырья и продукции" на основе аутентичного перевода на русский язык международного стандарта, указанного в пункте 4

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 1 октября 2012 г. N 51)

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97 Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97 Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Беларусь BY Госстандарт Республики Беларусь
Казахстан KZ Госстандарт Республики Казахстан
Кыргызстан KG Кыргызстандарт
Молдова MD Молдова-Стандарт
Российская Федерация RU Росстандарт
Таджикистан TJ Таджикстандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2012 г. N 1770-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 31710-2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2013 г.

5 Настоящий стандарт модифицирован по отношению к международному стандарту ISO 8870:2006* Milk and mik-based products - Detection of themrmoneuclease produced by coagulase-positive staphylococci (Молоко и продукты на основе молока. Обнаружение термонуклеазы, образуемой коагулазоположительными стафилококками) путем изменения отдельных фраз (слов, значений показателей, ссылок), которые выделены в тексте курсивом**.

* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым здесь и далее по тексту, можно получить перейдя по ссылке

** В бумажном оригинале обозначения и номера стандартов и нормативных документов в "Предисловии" и разделе 6 приводятся обычным шрифтом, остальные по тексту документа выделены курсивом.

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта публикуется в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты".

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты"

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает качественный метод определения термонуклеазы, образуемой коагулазоположительными стафилококками в молоке и продуктах на основе молока.

Наличие в молоке и продуктах на основе молока термонуклеазы может использоваться как индикатор достижения роста стафилококков опасного уровня и может отражать вероятное присутствие стафилококкового энтеротоксина.

2 Нормативные ссылки

* На территории Российской Федерации документ не действует. Действует ГОСТ Р 53430-2009, здесь и далее по тексту.

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов по указателю "Национальные стандарты", составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

3.1 термонуклеаза (thermonuclease): Фермент, образуемый коагулазоположительными стафилококками, гидролизирующий дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) при условиях, описанных в настоящем стандарте.

4 Сущность метода*

Метод основан на расщеплении ДНК термонуклеазой, при котором цвет агара изменяется с синего на розовый. Цветная реакция обусловлена метахроматическими свойствами толуидинового синего О.

Читайте также: