Набор диагностикумов респираторно-синцитиальной инфекции крс

Обновлено: 27.03.2024

Респираторно-синцитиальная инфекция (PC-инфекция) крупного рогатого скота — контагиозная, остро протекающая болезнь, характеризующаяся повышением температуры, преимущественным поражением органов дыхания. Регистрируется во многих странах мира, в том числе и в России.

В естественных условиях болеет крупный рогатый скот. Заболевание наиболее ярко проявляется у 1—3-месячных телят. PC-инфекция часто осложняется вторичной бактериальной инфекцией, особенно пастереллезом. Многие исследователи считают, что в этиологии массовых пневмоний молочных телят основная роль принадлежит PC-вирусу, который обнаруживали гораздо чаще, чем вирусы ринотрахеита, диареи и парагриппа-3. Отмечено, что особенно чувствителен к PC-вирусу чистокровный крупный рогатый скот герефордской породы. PC-вирус часто участвует в смешанных респираторных инфекциях с другими вирусами и бактериями.

Характеристика возбудителя. Вирус относится к семейству Paramyxoviridae, подсемейству Pneumovirinae, роду Pneumovirus. Вирионы вируса состоят из нуклеокапсида спиральной симметрии и липопротеидной оболочки, содержащей липиды и полисахариды. Вирус имеет единую односпиральную линейную минус-РНК. По размеру и форме вирионы неоднородны, однако многие из них имеют округлую форму.

Устойчивость к физико-химическим воздействиям. Вирус очень нестоек в окружающей среде. Он высокочувствителен к эфиру, хлороформу, дезоксихолату, трипсину, низким значениям pH (pH 3,0) и к замораживанию. При 4 °С он сохраняет активность в течение 7 дней, при минус 70 °С — до 2 мес. Инактивация его наступает при 56 °С за 30 мин. В лиофилизированном виде вирус сохраняет активность до одного года.

Антигенная структура. Изучена недостаточно. Установлено, что вирус не содержит нейраминидазы. Показано, что гликопротеид и F-белок имеют решающее значение для формирования защитного иммунитета.

Антигенная вариабельность. Вирус в иммунологическом отношении однороден. Штаммы PC-вируса крупного рогатого скота родственны человеческим штаммам этого вируса.

Антигенная активность. Вирус вызывает образование вируснейтрализующих, комплементсвязывающих и преципитирующих антител. Отмечена линейная корреляция между титрами комплементсвязывающих и нейтрализующих антител. PC-инфекция может развиваться на фоне циркулирующих антител. Показано, что антитела играют защитную роль при наличии их в титрах не ниже 1 : 128 в сыворотке крови.

Культивирование вируса. PC-вирус культивируется в первичных культурах клеток почки, тестикул, легких и селезенки крупного рогатого скота. При первичном выделении из патологического материала его удается выделить на третьем-четвертом пассажах, в которых на 3—7-й дни проявляются выраженные цитопатические изменения: очаги зернистых сморщенных клеток, синцитии, в большинстве которых имеются ацидофильные цитоплазматические включения. Вирус также культивируется в перевиваемых линиях клеток, полученных из слизистой оболочки носа, легких, почек (Таурус-1) крупного рогатого скота и клеток Vero. Куриные эмбрионы к PC-вирусу нечувствительны.

Гемагглютинирующие свойства. У вируса они не установлены.

Экспериментальная инфекция. Ее можно вызвать при итраназальном и интратрахеальном заражении месячных телят, у которых на 5-й день появляются характерные признаки болезни. У зараженных животных с третьего дня РИФ выявляли вирусный антиген в эпителиальных клетках носовой полости, трахеи, бронхов, бронхиол и альвеолярных макрофагах. Кроме того, выделяли вирус из слизистых носа, бронхов и легких. Удавалось воспроизвести экспериментальную инфекцию на ягнятах, обезьянах, хорьках, норках и морских свинках.

Клинические признаки. Вспышки болезни чаще наблюдают в переходные осенне-зимние и зимне-весенние периоды с охватом большого поголовья животных.

Симптомы болезни обычно проявляются слабо и могут быть незамеченными. Проявление клинических признаков болезни зависит от многих предрасполагающих и осложняющих факторов: условий содержания и кормления животных, их физиологического состояния, вирулентности и дозы вируса, присутствия других инфекционных агентов и др.

Болезнь обычно сопровождается повышением температуры тела до 41 °С, затрудненным дыханием, кашлем, слюноотделением, серозными истечениями из носа и развитием бронхопневмонии разной тяжести. Отмечено, что PC-вирус может вызвать аборт. У молодняка болезнь обычно продолжается не более 3—5, а у взрослых животных — 8—10 дней. Прогноз болезни, как правило, благоприятный, если нет бактериальных осложнений и созданы оптимальные условия содержания животных.

Патологоанатомические изменения. При вскрытии вынужденно убитых животных обнаруживают признаки эмфиземы легких и пневмонии, увеличение бронхиальных лимфатических узлов. При гистологическом исследовании в эпителии альвеол и бронхиол выявляют многоядерные, гигантские клетки.

Локализация вируса. Изучена недостаточно. PC-вирус в течение первой недели после заражения выделяли из носовых и конъюнктивальных смывов. Нередко его изолируют от новорожденных телят. Возможно длительное вирусоносительство.

Из организма больных животных вирус выделяется с носовым экссудатом и выдыхаемым воздухом.

Источник инфекции — больные животные. Инфекция передается воздушно-капельным путем. Считают, что естественная внутриутробная инфекция поддерживает циркуляцию в стаде РС-вируса.

Диагностика. Диагноз на PC-инфекцию ставят на основании эпизоотологических, клинических патологоанатомических данных и лабораторных исследований.

Взятие и подготовка материала. Они идентичны таковым при аденовирусной инфекции. Следует отметить, что PC-вирус очень нестоек, поэтому лучшие результаты выделения вируса получают, проводя заражение культур клеток как можно быстрее после взятия материала и избегая его замораживания до исследования.

Лабораторная диагностика. Диагностику PC-инфекции проводят с использованием набора диагностикума, выпускаемого биопромышленностью. Ее проводят параллельно с исследованием материала на парагрипп-3, аденовирусную инфекцию, инфекционный ринотрахеит и вирусную диарею.

Индикация вируса. В патологическом материале ее проводят путем обнаружения вирусного антигена в мазках, отпечатках из органов или в клетках, полученных после центрифугирования смывов, в РИФ.

Изоляцию вируса патологического материала выполняют в первичной культуре клеток ТБ, ПЭК, ЛЭК или в перевиваемых культурах клеток Таурус 1, ПЛЭК и др. Проводят не менее трех пассажей.

Идентификацию выделенного вируса проводят в PH, РИФ, редко в РДП, РСК.

Обнаруживают антитела в сыворотке крови больных и переболевших животных (ретроспективная диагностика) в РИГА, ИФА, PH, РДП.

Дифференциальный диагноз. Следует исключить парагрипп-3, вирусную диарею, инфекционный ринотрахеит, аденовирусную инфекцию, хламидиоз, так как эпизоотологические, клинические и патологоанатомические данные очень сходны с РС-инфекцией. Необходимо учитывать вероятность смешанного течения этих инфекций.

Иммунитет и специфическая профилактика. Иммунитет при PC-инфекции изучен недостаточно. У крупного рогатого скота, перенесшего болезнь, вырабатываются антитела, однако уровень гуморальных антител не может быть надежным критерием оценки напряженности иммунитета. Для PC-инфекции характерны повторные заболевания даже при наличии в крови антител, что свидетельствует о второстепенной роли сывороточных антител в иммунитете. Важное значение в иммунитете, вероятно, принадлежит секреторным антителам слизистой оболочки респираторного тракта и клеточным факторам.

Материнские антитела слабо предохраняют потомство от инфекции, но частота и тяжесть болезни обратно пропорциональны уровню специфических материнских антител.

В нашей стране вакцины против этой инфекции не разработаны. В зарубежных странах применяют живые вакцины.

3. БОЛЕЗНИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

ВИРУСНЫЕ РЕСПИРАТОРНО-КИШЕЧНЫЕ ИНФЕКЦИИ

3.5. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ВИРУСНЫХ РЕСПИРАТОРНО-КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

РЕКОМЕНДОВАНЫ 25 июля 1978 г., б/н

1. Общие положения

1.1. Настоящие Методические указания распространяются на следующие вирусные респираторно-кишечные инфекции (пневмоэнтериты) крупного рогатого скота: инфекционный ринотрахеит (ИРТ), парагрипп-3 (ПГ-3), вирусную диарею (ВД), аденовирусную инфекцию (адено), респираторно-синцитиальную инфекцию (PC), грипп.

1.2. Лабораторная диагностика вирусных респираторно-кишечных инфекций заключается в:

- обнаружении антигена в патологическом материале методами иммунофлуоресценции (ИФ), реакции связывания комплемента (РСК), реакции диффузионной преципитации (РДП);

- выделении возбудителя из патологического материала в культуре клеток или на куриных эмбрионах и его идентификации в одной из серологических реакций: РСК, РДП, реакции торможения гемагглютинации (РТГА), реакции торможения гемадсорбции, (РТГАд), реакции нейтрализации (РН), реакции торможения непрямой гемагглютинации (РТНГА), ИФ;

- выявлении антител в крови больных и переболевших животных (ретроспективная диагностика) в одной из серологических реакций: реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), РДП, РН, РТГА, РСК, реакции нейтрализации вирусных гемагглютининов (РНВГ).

1.3. Схема исследований при лабораторной диагностике вирусных респираторно-кишечных инфекций крупного рогатого скота (см. стр.209, 210).

1.4. При лабораторной диагностике вирусных респираторно-кишечных инфекций крупного рогатого скота используют соответствующие каждой инфекции диагностические наборы, выпускаемые биологической промышленностью.

1.5. Диагностика вирусных пневмоэнтеритов проводится параллельно с исследованием материала на бактериальные и хламидийную инфекции.

1.6. Лабораторный диагноз на вирусные респираторно-кишечные инфекции ставится на основании положительных результатов обнаружения антигена в патологическом материале с помощью одной из серологических реакций (ИФ, РДП, РСК) или выделения и идентификации возбудителя в одной из реакций, указанных в схеме п.1.3, или установления четырехкратного прироста антител в крови переболевших животных.

Обнаружение антигена

Выделение вируса

Идентификация вируса (реакция)

Ретроспек-
тивная диагностика

исследуемый патологический материал

Слизистая носа, трахеи, легкие, головной мозг, органы абортированного плода

В культуре клеток:

Слизистая носа, трахеи, легкие, селезенка

В культуре клеток:

ПЭК, ПТ, ТБ, ЛЭК, СЭК

ИФ, РТГА, РГАд, РТГАд

Слизистая носа, кишечника, преджелудков, трахеи, легкие, почка

В культуре клеток:

В культуре клеток:

ИФ, РСК, РДП, РТНГА

Слизистая носа, трахеи, легкие

В культуре клеток:

На куриных эмбрионах

Обозначения: ПЭК - почка эмбриона коров; ПТ - почка телят; ТБ - тестикулы бычков; СЭК - селезенка эмбриона коров; ЛЭК - легкие эмбриона коров.

Диагноз на вирусные пневмоэнтериты считают установленным по результатам лабораторного исследования с учетом эпизоотологических и клинических данных и патологоанатомических изменений.

1.7. Для постановки лабораторного диагноза путем обнаружения антигена в патологическом материале требуется 2. 3 дня, с помощью выделения вируса и его идентификации - до 30 дней, а путем выявления прироста антител в крови животных - от 2 до 4 недель.

2. Взятие и подготовка материала для исследования

2.1. В лабораторию для исследования направляют патологический материал от больных животных, взятый в период максимального проявления у них клинических признаков (температурная реакция, угнетение, воспалительные процессы в верхних дыхательных путях, сопровождающиеся серозными или слизистыми истечениями из носовой полости, поносы, иногда аборты), или от вынужденно убитых или павших животных, взятый не позднее чем через 2 ч после их гибели.

2.2. От больных животных берут: 1) тампонами мазки со слизистой носовой полости (при ИРТ - со слизистой глаз, влагалища, препуция) для реакции иммунофлуоресценции и для выделения возбудителя; 2) фекалии - для выделения возбудителя и 3) пробы крови - для выявления в ней титра антител.

Тампоны с материалом помещают в пенициллиновые флаконы с 2…5 мл питательной среды для культуры клеток или раствора Хенкса, содержащие 1000 ЕД/мл пенициллина и 1000 мкг/мл стрептомицина.

Кровь в объеме не менее 5,0 мл берут в пробирки, после свертывания доставляют в лабораторию.

2.3. От павших и вынужденно убитых животных берут кусочки носовой перегородки, трахеи, легких, селезенки, почки, средостенные и брыжеечные лимфатические узлы и при поносах - кусочки тонкого отдела кишечника. От абортированных плодов берут кусочки паренхиматозных органов, околоплодную жидкость.

2.4. Флаконы с патологическим материалом доставляют в лабораторию в термосе со льдом.

2.5. В лаборатории флаконы с тампонами встряхивают 2. 3 мин, тампоны отжимают и удаляют, а содержимое флакона центрифугируют при 2 тыс. об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость отсасывают в стерильную пробирку, куда вносят по 500 ЕД/мл пенициллина и 500 мкг/мл стрептомицина, выдерживают при 4°С в течение 2. 4 ч и используют для заражения культуры клеток или куриных эмбрионов. Из осадка центрифугата готовят мазки для исследования методом иммунофлуоресценции.

2.6. Флаконы с фекалиями замораживают при температуре -20°С (в морозилке холодильника) в течение 18 ч, после чего оттаивают при 37°С и центрифугируют при 5 тыс. об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость отсасывают в стерильную пробирку, вносят 1000 ЕД/мл пенициллина, 1000 мкг/мл стрептомицина и 50 ЕД/мл нистатина, выдерживают при 4°С в течение 2. 4 ч, дополнительно центрифугируют и используют для заражения культуры клеток или куриных эмбрионов.

2.7. Со слизистой носовой перегородки, трахеи, влагалища, бронхов и кишечника делают скальпелем соскобы, вносят их в центрифужную пробирку с 5 мл физиологического раствора и центрифугируют при 2 тыс. об/мин в течение 10 мин. Осадок клеток суспендируют в 0,5 мл того же раствора и готовят мазки на обезжиренных предметных стеклах для исследования методом иммунофлуоресценции.

Из кусочков легкого и лимфатических узлов готовят отпечатки на предметных стеклах или срезы толщиной 5 микрон для исследования тем же методом.

2.8. Из кусочков органов готовят 10. 20%-ную суспензию для выделения возбудителя и приготовления комплементсвязывающего и преципитирующего антигенов.

2.9. Для получения суспензии (с целью выделения вируса) ткань измельчают, растирают в ступке со стеклянным песком, разводят раствором Хенкса, содержащим антибиотики, центрифугируют при 5 тыс. об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость отсасывают, выдерживают при температуре 4°С в течение 2. 4 ч и используют для заражения культуры клеток или куриных эмбрионов.

2.10. Для изготовления испытуемого комплементсвязывающего антигена ткань измельчают в ступке или специальном микроизмельчителе, разводят 1:5 содержащим антибиотики физиологическим раствором, рН 7,2. 7,4. Полученную 20%-ную суспензию замораживают при температуре -20°С в течение 16. 18 ч, быстро оттаивают при температуре 37°С, повторно растирают или гомогенизируют, а затем центрифугируют при 5 тыс. об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость отсасывают и далее используют, как указано в п.5.1.

3. Обнаружение вирусных антигенов в патологическом материале методом иммунофлуоресценции

3.1. Метод иммунофлуоресценции для обнаружения вируса применяется при диагностике всех респираторно-кишечных инфекций, указанных в п.1.1.

3.2. Полученные мазки, отпечатки и срезы подсушивают на воздухе, фиксируют в ацетоне в течение 5 мин и окрашивают флуоресцирующими сыворотками, имеющимися в наборах диагностикумов. Каждой сывороткой окрашивают по 4 препарата из каждого органа.

3.3. Окрашивание препаратов ведут во влажной камере при температуре 37°С в течение 45 мин. Затем препараты споласкивают в трех сменах физиологического раствора, рН 7,2. 7,4, и в дистиллированной воде, подсушивают на воздухе. На препараты наносят нефлуоресцирующее масло и исследуют их под люминесцентным микроскопом.

3.4. Для контроля специфичности свечения ставят реакцию подавления иммунофлуоресценции. Для этого на два препарата из органа, при исследовании которого получена положительная реакция иммунофлуоресценции, наносят соответствующую выявленному вирусу сыворотку в разведении 1:10 и выдерживают их в термостате во влажной камере в течение 30 мин.

Препараты споласкивают в трех сменах физиологического раствора, рН 7,2. 7,4, и окрашивают флуоресцирующей сывороткой.

3.5. Учет реакции. Положительным результатом исследования методом ИФ считается наличие специфической флуоресценции, которая характеризуется тем, что в препаратах, окрашенных флуоресцирующей сывороткой, ткань флуоресцирует тусклым зеленовато-серым цветом, а вирусный антиген при этом выявляется в виде ярких зеленовато-желтых различных по величине гранул или в виде диффузного свечения в цитоплазме или (при ИРТ, адено) в ядре.

В контрольных препаратах, обработанных последовательно специфической и флуоресцирующей сыворотками, специфическая флуоресценция должна отсутствовать.

Диагноз на вирусную респираторно-кишечную инфекцию ставят при обнаружении специфической флуоресценции не менее чем в трех полях зрения при наличии в каждом из них 3. 5 и более флуоресцирующих клеток или при наличии 15. 20% флуоресцирующих клеток при подсчете не менее 100 клеток в препарате. При выявлении меньшего числа флуоресцирующих клеток диагноз подтверждают исследованием антител в парных пробах сывороток крови больных животных или выделением возбудителя.

3.6. При исследовании материала от животных, привитых живыми вакцинами против инфекций, на которые проводятся диагностические исследования, положительные результаты ИФ во всех случаях следует подтверждать исследованием парных проб сывороток крови.

4. Обнаружение антигена вируса ИРТ в РДП

4.1. РДП ставят в агаровом геле.

4.2. Компоненты реакции: специфическая преципитирующая сыворотка; контрольная отрицательная сыворотка; исследуемый материал от больных животных; специфический антиген.

4.3. Агаровую среду готовят по прописи: агар - 1,0, физиологический раствор рН 7,4 - 100,0 мл. Агар расплавляют на водяной бане и разливают в чашки Петри по 25 мл или на обезжиренные предметные стекла. В слое застывшего агара при помощи штампа нарезают лунки - одну центральную и 6 вокруг нее на расстоянии 0,5. 0,7 см.

4.4. Постановка реакции. В центральную лунку вносят специфическую сыворотку, в лунки по окружности - испытуемый материал. Параллельно испытуемый материал исследуют с отрицательной сывороткой.

1) контрольный положительный антиген + специфическая сыворотка;

2) контрольный положительный антиген + отрицательная сыворотка.

Чашки Петри или предметные стекла помещают во влажную камеру, выдерживают при температуре 37°С в течение 18. 24 ч и затем при комнатной температуре в течение такого же времени.

4.5. Учет реакции. Реакцию считают положительной при условии образования ясно выраженной линии преципитации между лунками с исследуемым антигеном и специфической сывороткой, а также между контрольным положительным антигеном и специфической сывороткой при отрицательном результате с отрицательной сывороткой.

5. Обнаружение антигена адено в патологическом материале в РСК

5.1. Комплементсвязывающий антиген готовят из 20%-ной суспензии патологического материала, обработанной, как указано в п.2.10. Для этого к ней добавляют 1%-ный раствор гексаметафосфата натрия до конечной концентрации 0,05% и раствор 1 н. НСl для снижения рН до 4,1.

Респираторно-синцитиальная инфекция (PC-инфекция) крупного рогатого скота — контагиозная, остро протекающая болезнь, характеризующаяся повышением температуры, преимущественным поражением органов дыхания. Регистрируется во многих странах мира, в том числе и в России.

В естественных условиях болеет крупный рогатый скот. Заболевание наиболее ярко проявляется у 1—3-месячных телят. PC-инфекция часто осложняется вторичной бактериальной инфекцией, особенно пастереллезом. Многие исследователи считают, что в этиологии массовых пневмоний молочных телят основная роль принадлежит PC-вирусу, который обнаруживали гораздо чаще, чем вирусы ринотрахеита, диареи и парагриппа-3. Отмечено, что особенно чувствителен к PC-вирусу чистокровный крупный рогатый скот герефордской породы. PC-вирус часто участвует в смешанных респираторных инфекциях с другими вирусами и бактериями.

Характеристика возбудителя. Вирус относится к семейству Paramyxoviridae, подсемейству Pneumovirinae, роду Pneumovirus. Вирионы вируса состоят из нуклеокапсида спиральной симметрии и липопротеидной оболочки, содержащей липиды и полисахариды. Вирус имеет единую односпиральную линейную минус-РНК. По размеру и форме вирионы неоднородны, однако многие из них имеют округлую форму.

Устойчивость к физико-химическим воздействиям. Вирус очень нестоек в окружающей среде. Он высокочувствителен к эфиру, хлороформу, дезоксихолату, трипсину, низким значениям pH (pH 3,0) и к замораживанию. При 4 °С он сохраняет активность в течение 7 дней, при минус 70 °С — до 2 мес. Инактивация его наступает при 56 °С за 30 мин. В лиофилизированном виде вирус сохраняет активность до одного года.

Антигенная структура. Изучена недостаточно. Установлено, что вирус не содержит нейраминидазы. Показано, что гликопротеид и F-белок имеют решающее значение для формирования защитного иммунитета.

Антигенная вариабельность. Вирус в иммунологическом отношении однороден. Штаммы PC-вируса крупного рогатого скота родственны человеческим штаммам этого вируса.

Антигенная активность. Вирус вызывает образование вируснейтрализующих, комплементсвязывающих и преципитирующих антител. Отмечена линейная корреляция между титрами комплементсвязывающих и нейтрализующих антител. PC-инфекция может развиваться на фоне циркулирующих антител. Показано, что антитела играют защитную роль при наличии их в титрах не ниже 1 : 128 в сыворотке крови.

Культивирование вируса. PC-вирус культивируется в первичных культурах клеток почки, тестикул, легких и селезенки крупного рогатого скота. При первичном выделении из патологического материала его удается выделить на третьем-четвертом пассажах, в которых на 3—7-й дни проявляются выраженные цитопатические изменения: очаги зернистых сморщенных клеток, синцитии, в большинстве которых имеются ацидофильные цитоплазматические включения. Вирус также культивируется в перевиваемых линиях клеток, полученных из слизистой оболочки носа, легких, почек (Таурус-1) крупного рогатого скота и клеток Vero. Куриные эмбрионы к PC-вирусу нечувствительны.

Гемагглютинирующие свойства. У вируса они не установлены.

Экспериментальная инфекция. Ее можно вызвать при итраназальном и интратрахеальном заражении месячных телят, у которых на 5-й день появляются характерные признаки болезни. У зараженных животных с третьего дня РИФ выявляли вирусный антиген в эпителиальных клетках носовой полости, трахеи, бронхов, бронхиол и альвеолярных макрофагах. Кроме того, выделяли вирус из слизистых носа, бронхов и легких. Удавалось воспроизвести экспериментальную инфекцию на ягнятах, обезьянах, хорьках, норках и морских свинках.

Клинические признаки. Вспышки болезни чаще наблюдают в переходные осенне-зимние и зимне-весенние периоды с охватом большого поголовья животных.

Симптомы болезни обычно проявляются слабо и могут быть незамеченными. Проявление клинических признаков болезни зависит от многих предрасполагающих и осложняющих факторов: условий содержания и кормления животных, их физиологического состояния, вирулентности и дозы вируса, присутствия других инфекционных агентов и др.

Болезнь обычно сопровождается повышением температуры тела до 41 °С, затрудненным дыханием, кашлем, слюноотделением, серозными истечениями из носа и развитием бронхопневмонии разной тяжести. Отмечено, что PC-вирус может вызвать аборт. У молодняка болезнь обычно продолжается не более 3—5, а у взрослых животных — 8—10 дней. Прогноз болезни, как правило, благоприятный, если нет бактериальных осложнений и созданы оптимальные условия содержания животных.

Патологоанатомические изменения. При вскрытии вынужденно убитых животных обнаруживают признаки эмфиземы легких и пневмонии, увеличение бронхиальных лимфатических узлов. При гистологическом исследовании в эпителии альвеол и бронхиол выявляют многоядерные, гигантские клетки.

Локализация вируса. Изучена недостаточно. PC-вирус в течение первой недели после заражения выделяли из носовых и конъюнктивальных смывов. Нередко его изолируют от новорожденных телят. Возможно длительное вирусоносительство.

Из организма больных животных вирус выделяется с носовым экссудатом и выдыхаемым воздухом.

Источник инфекции — больные животные. Инфекция передается воздушно-капельным путем. Считают, что естественная внутриутробная инфекция поддерживает циркуляцию в стаде РС-вируса.

Диагностика. Диагноз на PC-инфекцию ставят на основании эпизоотологических, клинических патологоанатомических данных и лабораторных исследований.

Взятие и подготовка материала. Они идентичны таковым при аденовирусной инфекции. Следует отметить, что PC-вирус очень нестоек, поэтому лучшие результаты выделения вируса получают, проводя заражение культур клеток как можно быстрее после взятия материала и избегая его замораживания до исследования.

Лабораторная диагностика. Диагностику PC-инфекции проводят с использованием набора диагностикума, выпускаемого биопромышленностью. Ее проводят параллельно с исследованием материала на парагрипп-3, аденовирусную инфекцию, инфекционный ринотрахеит и вирусную диарею.

Индикация вируса. В патологическом материале ее проводят путем обнаружения вирусного антигена в мазках, отпечатках из органов или в клетках, полученных после центрифугирования смывов, в РИФ.

Изоляцию вируса патологического материала выполняют в первичной культуре клеток ТБ, ПЭК, ЛЭК или в перевиваемых культурах клеток Таурус 1, ПЛЭК и др. Проводят не менее трех пассажей.

Идентификацию выделенного вируса проводят в PH, РИФ, редко в РДП, РСК.

Обнаруживают антитела в сыворотке крови больных и переболевших животных (ретроспективная диагностика) в РИГА, ИФА, PH, РДП.

Дифференциальный диагноз. Следует исключить парагрипп-3, вирусную диарею, инфекционный ринотрахеит, аденовирусную инфекцию, хламидиоз, так как эпизоотологические, клинические и патологоанатомические данные очень сходны с РС-инфекцией. Необходимо учитывать вероятность смешанного течения этих инфекций.

Иммунитет и специфическая профилактика. Иммунитет при PC-инфекции изучен недостаточно. У крупного рогатого скота, перенесшего болезнь, вырабатываются антитела, однако уровень гуморальных антител не может быть надежным критерием оценки напряженности иммунитета. Для PC-инфекции характерны повторные заболевания даже при наличии в крови антител, что свидетельствует о второстепенной роли сывороточных антител в иммунитете. Важное значение в иммунитете, вероятно, принадлежит секреторным антителам слизистой оболочки респираторного тракта и клеточным факторам.

Материнские антитела слабо предохраняют потомство от инфекции, но частота и тяжесть болезни обратно пропорциональны уровню специфических материнских антител.

В нашей стране вакцины против этой инфекции не разработаны. В зарубежных странах применяют живые вакцины.

Инфекция КРС Здоровая ферма

Респираторно-синцитиальная инфекция КРС (PC-инфекция) — контагиозная, остро протекающая болезнь, характеризующаяся повышением температуры, преимущественным поражением органов дыхания. Регистрируется во многих странах мира, в том числе и в Беларуси.

респираторно-синцитиальная инфекция КРС

В естественных условиях болеет крупный рогатый скот. Заболевание наиболее ярко проявляется у 1—3-месячных телят. Респираторно-синцитиальная инфекция КРС часто осложняется вторичной бактериальной инфекцией, особенно пастереллезом. Многие исследователи считают, что в этиологии массовых пневмоний молочных телят основная роль принадлежит PC-вирусу, который обнаруживали гораздо чаще, чем вирусы ринотрахеита, диареи и парагриппа-3.

Отмечено, что особенно чувствителен к PC-вирусу чистокровный крупный рогатый скот герефордской породы. Респираторно-синцитиальная инфекция КРС часто участвует в смешанных респираторных инфекциях с другими вирусами и бактериями.

Характеристика возбудителя.

Вирус относится к семейству Paramyxoviridae, подсемейству Pneumovirinae, роду Pneumovirus. Вирионы вируса состоят из нуклеокапсида спиральной симметрии и липопротеидной оболочки, содержащей липиды и полисахариды. Вирус имеет единую односпиральную линейную минус-РНК. По размеру и форме вирионы неоднородны, однако многие из них имеют округлую форму.

PC-вирус КРС

Устойчивость к физико-химическим воздействиям. Вирус очень нестоек в окружающей среде. Он высокочувствителен к эфиру, хлороформу, дезоксихолату, трипсину, низким значениям pH (pH 3,0) и к замораживанию. При 4 °С он сохраняет активность в течение 7 дней, при минус 70 °С — до 2 мес. Инактивация его наступает при 56 °С за 30 мин. В лиофилизированном виде вирус сохраняет активность до одного года.

Антигенная активность. Вирус вызывает образование вируснейтрализующих, комплементсвязывающих и преципитирующих антител. Отмечена линейная корреляция между титрами комплементсвязывающих и нейтрализующих антител. PC-инфекция может развиваться на фоне циркулирующих антител. Показано, что антитела играют защитную роль при наличии их в титрах не ниже 1 : 128 в сыворотке крови.

Культивирование вируса. PC-вирус культивируется в первичных культурах клеток почки, тестикул, легких и селезенки крупного рогатого скота. При первичном выделении из патологического материала его удается выделить на третьем-четвертом пассажах, в которых на 3—7-й дни проявляются выраженные цитопатические изменения: очаги зернистых сморщенных клеток, синцитии, в большинстве которых имеются ацидофильные цитоплазматические включения. Вирус также культивируется в перевиваемых линиях клеток, полученных из слизистой оболочки носа, легких, почек (Таурус-1) крупного рогатого скота и клеток Vero. Куриные эмбрионы к PC-вирусу нечувствительны.

Гемагглютинирующие свойства. У вируса они не установлены.

Экспериментальная инфекция. Ее можно вызвать при итраназальном и интратрахеальном заражении месячных телят, у которых на 5-й день появляются характерные признаки болезни. У зараженных животных с третьего дня РИФ выявляли вирусный антиген в эпителиальных клетках носовой полости, трахеи, бронхов, бронхиол и альвеолярных макрофагах. Кроме того, выделяли вирус из слизистых носа, бронхов и легких. Удавалось воспроизвести экспериментальную инфекцию на ягнятах, обезьянах, хорьках, норках и морских свинках.

Клинические признаки.

Вспышки болезни чаще наблюдают в переходные осенне-зимние и зимне-весенние периоды с охватом большого поголовья животных.

Симптомы болезни обычно проявляются слабо и могут быть незамеченными. Проявление клинических признаков болезни зависит от многих предрасполагающих и осложняющих факторов: условий содержания и кормления животных, их физиологического состояния, вирулентности и дозы вируса, присутствия других инфекционных агентов и др.

Болезнь обычно сопровождается повышением температуры тела до 41 °С, затрудненным дыханием, кашлем, слюноотделением, серозными истечениями из носа и развитием бронхопневмонии разной тяжести. Отмечено, что PC-вирус может вызвать аборт. У молодняка болезнь обычно продолжается не более 3—5, а у взрослых животных — 8—10 дней. Прогноз болезни, как правило, благоприятный, если нет бактериальных осложнений и созданы оптимальные условия содержания животных.

Патологоанатомические изменения.

При вскрытии вынужденно убитых животных обнаруживают признаки эмфиземы легких и пневмонии, увеличение бронхиальных лимфатических узлов. При гистологическом исследовании в эпителии альвеол и бронхиол выявляют многоядерные, гигантские клетки.

Локализация вируса. Изучена недостаточно. PC-вирус в течение первой недели после заражения выделяли из носовых и конъюнктивальных смывов. Нередко его изолируют от новорожденных телят. Возможно длительное вирусоносительство.

Из организма больных животных вирус выделяется с носовым экссудатом и выдыхаемым воздухом.

Источник инфекции — больные животные. Инфекция передается воздушно-капельным путем. Считают, что естественная внутриутробная инфекция поддерживает циркуляцию в стаде РС-вируса.

Диагностика.

Диагноз на PC-инфекцию ставят на основании эпизоотологических, клинических патологоанатомических данных и лабораторных исследований.

Взятие и подготовка материала. Они идентичны таковым при аденовирусной инфекции. Следует отметить, что вирус респираторно-синцитиальная инфекция КРС очень нестоек, поэтому лучшие результаты выделения вируса получают, проводя заражение культур клеток как можно быстрее после взятия материала и избегая его замораживания до исследования.

Лабораторная диагностика. Диагностику PC-инфекции проводят с использованием набора диагностикума, выпускаемого биопромышленностью. Ее проводят параллельно с исследованием материала на парагрипп-3, аденовирусную инфекцию, инфекционный ринотрахеит и вирусную диарею.

Индикация вируса. В патологическом материале ее проводят путем обнаружения вирусного антигена в мазках, отпечатках из органов или в клетках, полученных после центрифугирования смывов, в РИФ.

Изоляцию вируса патологического материала выполняют в первичной культуре клеток ТБ, ПЭК, ЛЭК или в перевиваемых культурах клеток Таурус 1, ПЛЭК и др. Проводят не менее трех пассажей.

Идентификацию выделенного вируса проводят в PH, РИФ, редко в РДП, РСК.

Обнаруживают антитела в сыворотке крови больных и переболевших животных (ретроспективная диагностика) в РИГА, ИФА, PH, РДП.

Дифференциальный диагноз. Следует исключить парагрипп-3, вирусную диарею, инфекционный ринотрахеит, аденовирусную инфекцию, хламидиоз, так как эпизоотологические, клинические и патологоанатомические данные очень сходны с РС-инфекцией. Необходимо учитывать вероятность смешанного течения этих инфекций.

Иммунитет и специфическая профилактика.

Иммунитет при респираторно-синцитиальной инфекции КРС изучен недостаточно. У крупного рогатого скота, перенесшего болезнь, вырабатываются антитела, однако уровень гуморальных антител не может быть надежным критерием оценки напряженности иммунитета. Для PC-инфекции характерны повторные заболевания даже при наличии в крови антител, что свидетельствует о второстепенной роли сывороточных антител в иммунитете. Важное значение в иммунитете, вероятно, принадлежит секреторным антителам слизистой оболочки респираторного тракта и клеточным факторам.

Материнские антитела слабо предохраняют потомство от инфекции, но частота и тяжесть болезни обратно пропорциональны уровню специфических материнских антител.

В нашей стране вакцины против этой инфекции не разработаны. В зарубежных странах применяют живые вакцины.

Лечение.

Для лечения используют гипериммунные сыворотки и сыворотки реконвалесцентов, в которых имеются антитела к РС-вирусу одновременно с антибактериальными и иммуностимулирующими препаратами. Применяют также симптоматические методы лечения.

Профилактика и меры борьбы.

Для специфической профилактики используют живые и инактивированные моно- и ассоциированные вакцины, гипериммунные сыворотки. Для ликвидации заболевания используют общие противоэпизоотические мероприятия – ограничение движения скота, дезинфекция, карантинирование больных животных.

Организация Здоровая Ферма консультирует и обучает ветеринаров в области животноводства сельского хозяйства по всей Беларуси. А также, мы помогаем хозяйствам значительно улучшить показатели продуктивности в области животноводства. Звоните нам или оставляйте свои данные на нашем сайте.

3. БОЛЕЗНИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

ВИРУСНЫЕ РЕСПИРАТОРНО-КИШЕЧНЫЕ ИНФЕКЦИИ

3.5. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ВИРУСНЫХ РЕСПИРАТОРНО-КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

РЕКОМЕНДОВАНЫ 25 июля 1978 г., б/н

1. Общие положения

1.1. Настоящие Методические указания распространяются на следующие вирусные респираторно-кишечные инфекции (пневмоэнтериты) крупного рогатого скота: инфекционный ринотрахеит (ИРТ), парагрипп-3 (ПГ-3), вирусную диарею (ВД), аденовирусную инфекцию (адено), респираторно-синцитиальную инфекцию (PC), грипп.

1.2. Лабораторная диагностика вирусных респираторно-кишечных инфекций заключается в:

- обнаружении антигена в патологическом материале методами иммунофлуоресценции (ИФ), реакции связывания комплемента (РСК), реакции диффузионной преципитации (РДП);

- выделении возбудителя из патологического материала в культуре клеток или на куриных эмбрионах и его идентификации в одной из серологических реакций: РСК, РДП, реакции торможения гемагглютинации (РТГА), реакции торможения гемадсорбции, (РТГАд), реакции нейтрализации (РН), реакции торможения непрямой гемагглютинации (РТНГА), ИФ;

- выявлении антител в крови больных и переболевших животных (ретроспективная диагностика) в одной из серологических реакций: реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), РДП, РН, РТГА, РСК, реакции нейтрализации вирусных гемагглютининов (РНВГ).

1.3. Схема исследований при лабораторной диагностике вирусных респираторно-кишечных инфекций крупного рогатого скота (см. стр.209, 210).

1.4. При лабораторной диагностике вирусных респираторно-кишечных инфекций крупного рогатого скота используют соответствующие каждой инфекции диагностические наборы, выпускаемые биологической промышленностью.

1.5. Диагностика вирусных пневмоэнтеритов проводится параллельно с исследованием материала на бактериальные и хламидийную инфекции.

1.6. Лабораторный диагноз на вирусные респираторно-кишечные инфекции ставится на основании положительных результатов обнаружения антигена в патологическом материале с помощью одной из серологических реакций (ИФ, РДП, РСК) или выделения и идентификации возбудителя в одной из реакций, указанных в схеме п.1.3, или установления четырехкратного прироста антител в крови переболевших животных.

Обнаружение антигена

Выделение вируса

Идентификация вируса (реакция)

Ретроспек-
тивная диагностика

исследуемый патологический материал

Слизистая носа, трахеи, легкие, головной мозг, органы абортированного плода

В культуре клеток:

Слизистая носа, трахеи, легкие, селезенка

В культуре клеток:

ПЭК, ПТ, ТБ, ЛЭК, СЭК

ИФ, РТГА, РГАд, РТГАд

Слизистая носа, кишечника, преджелудков, трахеи, легкие, почка

В культуре клеток:

В культуре клеток:

ИФ, РСК, РДП, РТНГА

Слизистая носа, трахеи, легкие

В культуре клеток:

На куриных эмбрионах

Обозначения: ПЭК - почка эмбриона коров; ПТ - почка телят; ТБ - тестикулы бычков; СЭК - селезенка эмбриона коров; ЛЭК - легкие эмбриона коров.

Диагноз на вирусные пневмоэнтериты считают установленным по результатам лабораторного исследования с учетом эпизоотологических и клинических данных и патологоанатомических изменений.

1.7. Для постановки лабораторного диагноза путем обнаружения антигена в патологическом материале требуется 2. 3 дня, с помощью выделения вируса и его идентификации - до 30 дней, а путем выявления прироста антител в крови животных - от 2 до 4 недель.

2. Взятие и подготовка материала для исследования

2.1. В лабораторию для исследования направляют патологический материал от больных животных, взятый в период максимального проявления у них клинических признаков (температурная реакция, угнетение, воспалительные процессы в верхних дыхательных путях, сопровождающиеся серозными или слизистыми истечениями из носовой полости, поносы, иногда аборты), или от вынужденно убитых или павших животных, взятый не позднее чем через 2 ч после их гибели.

2.2. От больных животных берут: 1) тампонами мазки со слизистой носовой полости (при ИРТ - со слизистой глаз, влагалища, препуция) для реакции иммунофлуоресценции и для выделения возбудителя; 2) фекалии - для выделения возбудителя и 3) пробы крови - для выявления в ней титра антител.

Тампоны с материалом помещают в пенициллиновые флаконы с 2…5 мл питательной среды для культуры клеток или раствора Хенкса, содержащие 1000 ЕД/мл пенициллина и 1000 мкг/мл стрептомицина.

Кровь в объеме не менее 5,0 мл берут в пробирки, после свертывания доставляют в лабораторию.

2.3. От павших и вынужденно убитых животных берут кусочки носовой перегородки, трахеи, легких, селезенки, почки, средостенные и брыжеечные лимфатические узлы и при поносах - кусочки тонкого отдела кишечника. От абортированных плодов берут кусочки паренхиматозных органов, околоплодную жидкость.

2.4. Флаконы с патологическим материалом доставляют в лабораторию в термосе со льдом.

2.5. В лаборатории флаконы с тампонами встряхивают 2. 3 мин, тампоны отжимают и удаляют, а содержимое флакона центрифугируют при 2 тыс. об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость отсасывают в стерильную пробирку, куда вносят по 500 ЕД/мл пенициллина и 500 мкг/мл стрептомицина, выдерживают при 4°С в течение 2. 4 ч и используют для заражения культуры клеток или куриных эмбрионов. Из осадка центрифугата готовят мазки для исследования методом иммунофлуоресценции.

2.6. Флаконы с фекалиями замораживают при температуре -20°С (в морозилке холодильника) в течение 18 ч, после чего оттаивают при 37°С и центрифугируют при 5 тыс. об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость отсасывают в стерильную пробирку, вносят 1000 ЕД/мл пенициллина, 1000 мкг/мл стрептомицина и 50 ЕД/мл нистатина, выдерживают при 4°С в течение 2. 4 ч, дополнительно центрифугируют и используют для заражения культуры клеток или куриных эмбрионов.

2.7. Со слизистой носовой перегородки, трахеи, влагалища, бронхов и кишечника делают скальпелем соскобы, вносят их в центрифужную пробирку с 5 мл физиологического раствора и центрифугируют при 2 тыс. об/мин в течение 10 мин. Осадок клеток суспендируют в 0,5 мл того же раствора и готовят мазки на обезжиренных предметных стеклах для исследования методом иммунофлуоресценции.

Из кусочков легкого и лимфатических узлов готовят отпечатки на предметных стеклах или срезы толщиной 5 микрон для исследования тем же методом.

2.8. Из кусочков органов готовят 10. 20%-ную суспензию для выделения возбудителя и приготовления комплементсвязывающего и преципитирующего антигенов.

2.9. Для получения суспензии (с целью выделения вируса) ткань измельчают, растирают в ступке со стеклянным песком, разводят раствором Хенкса, содержащим антибиотики, центрифугируют при 5 тыс. об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость отсасывают, выдерживают при температуре 4°С в течение 2. 4 ч и используют для заражения культуры клеток или куриных эмбрионов.

2.10. Для изготовления испытуемого комплементсвязывающего антигена ткань измельчают в ступке или специальном микроизмельчителе, разводят 1:5 содержащим антибиотики физиологическим раствором, рН 7,2. 7,4. Полученную 20%-ную суспензию замораживают при температуре -20°С в течение 16. 18 ч, быстро оттаивают при температуре 37°С, повторно растирают или гомогенизируют, а затем центрифугируют при 5 тыс. об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость отсасывают и далее используют, как указано в п.5.1.

3. Обнаружение вирусных антигенов в патологическом материале методом иммунофлуоресценции

3.1. Метод иммунофлуоресценции для обнаружения вируса применяется при диагностике всех респираторно-кишечных инфекций, указанных в п.1.1.

3.2. Полученные мазки, отпечатки и срезы подсушивают на воздухе, фиксируют в ацетоне в течение 5 мин и окрашивают флуоресцирующими сыворотками, имеющимися в наборах диагностикумов. Каждой сывороткой окрашивают по 4 препарата из каждого органа.

3.3. Окрашивание препаратов ведут во влажной камере при температуре 37°С в течение 45 мин. Затем препараты споласкивают в трех сменах физиологического раствора, рН 7,2. 7,4, и в дистиллированной воде, подсушивают на воздухе. На препараты наносят нефлуоресцирующее масло и исследуют их под люминесцентным микроскопом.

3.4. Для контроля специфичности свечения ставят реакцию подавления иммунофлуоресценции. Для этого на два препарата из органа, при исследовании которого получена положительная реакция иммунофлуоресценции, наносят соответствующую выявленному вирусу сыворотку в разведении 1:10 и выдерживают их в термостате во влажной камере в течение 30 мин.

Препараты споласкивают в трех сменах физиологического раствора, рН 7,2. 7,4, и окрашивают флуоресцирующей сывороткой.

3.5. Учет реакции. Положительным результатом исследования методом ИФ считается наличие специфической флуоресценции, которая характеризуется тем, что в препаратах, окрашенных флуоресцирующей сывороткой, ткань флуоресцирует тусклым зеленовато-серым цветом, а вирусный антиген при этом выявляется в виде ярких зеленовато-желтых различных по величине гранул или в виде диффузного свечения в цитоплазме или (при ИРТ, адено) в ядре.

В контрольных препаратах, обработанных последовательно специфической и флуоресцирующей сыворотками, специфическая флуоресценция должна отсутствовать.

Диагноз на вирусную респираторно-кишечную инфекцию ставят при обнаружении специфической флуоресценции не менее чем в трех полях зрения при наличии в каждом из них 3. 5 и более флуоресцирующих клеток или при наличии 15. 20% флуоресцирующих клеток при подсчете не менее 100 клеток в препарате. При выявлении меньшего числа флуоресцирующих клеток диагноз подтверждают исследованием антител в парных пробах сывороток крови больных животных или выделением возбудителя.

3.6. При исследовании материала от животных, привитых живыми вакцинами против инфекций, на которые проводятся диагностические исследования, положительные результаты ИФ во всех случаях следует подтверждать исследованием парных проб сывороток крови.

4. Обнаружение антигена вируса ИРТ в РДП

4.1. РДП ставят в агаровом геле.

4.2. Компоненты реакции: специфическая преципитирующая сыворотка; контрольная отрицательная сыворотка; исследуемый материал от больных животных; специфический антиген.

4.3. Агаровую среду готовят по прописи: агар - 1,0, физиологический раствор рН 7,4 - 100,0 мл. Агар расплавляют на водяной бане и разливают в чашки Петри по 25 мл или на обезжиренные предметные стекла. В слое застывшего агара при помощи штампа нарезают лунки - одну центральную и 6 вокруг нее на расстоянии 0,5. 0,7 см.

4.4. Постановка реакции. В центральную лунку вносят специфическую сыворотку, в лунки по окружности - испытуемый материал. Параллельно испытуемый материал исследуют с отрицательной сывороткой.

1) контрольный положительный антиген + специфическая сыворотка;

2) контрольный положительный антиген + отрицательная сыворотка.

Чашки Петри или предметные стекла помещают во влажную камеру, выдерживают при температуре 37°С в течение 18. 24 ч и затем при комнатной температуре в течение такого же времени.

4.5. Учет реакции. Реакцию считают положительной при условии образования ясно выраженной линии преципитации между лунками с исследуемым антигеном и специфической сывороткой, а также между контрольным положительным антигеном и специфической сывороткой при отрицательном результате с отрицательной сывороткой.

5. Обнаружение антигена адено в патологическом материале в РСК

5.1. Комплементсвязывающий антиген готовят из 20%-ной суспензии патологического материала, обработанной, как указано в п.2.10. Для этого к ней добавляют 1%-ный раствор гексаметафосфата натрия до конечной концентрации 0,05% и раствор 1 н. НСl для снижения рН до 4,1.

Читайте также: