Наследственный аппарат вич представлен

Обновлено: 26.04.2024

Морфология вируса иммунодефицита человека. Антигены вируса иммунодефицита человека.

Зрелые вирионы вируса иммунодефицита человека имеют сферическую форму, их размеры не превышают 100-120 им в диаметре. Геном вируса иммунодефицита человека образуют две нити +РНК; их связывают белки рб и р7 (цифра соответствует молекулярному весу в кД).

Капсид вируса иммунодефицита человека образует белок р24. Сердцевина вириона вируса иммунодефицита человека имеет цилиндрическую или конусовидную формы; её формируют белки р18 и р24.

В сердцевине вируса иммунодефицита человека располагаются РНК, внутренние белки (р7 и р9), обратная транскриптаза (димер из белков р66 и p51) и эндонуклсаза (р31). Матричный белок р17 формирует прослойку между сердцевиной вириона и внешней оболочкой.

Суперкапсид вируса иммунодефицита человека образован двойным липидным слоем, который пронизывают гликопротсиновыс шипы. Каждый шип состоит из белков gp41 и gp 120. Гликопротеины gpl20 локализованы в выступающей части шипа и взаимодействуют с молекулами CD4 на мембранах клеток.

Гликопротеины gp41 (белки слияния) вируса иммунодефицита человека располагаются внутри оболочки и обеспечивают её слияние с клеточной мембраной.

Антигенная структура вируса иммунодефицита человека

У вируса иммунодефицита человека главными антигенами выступают группо- и видоспецифичные антигены [сердцевинные (gag-) белки p24; типоспецифичные антигены [оболочечные (env-) белки gp41 и gp120].

В соответствии с их структурой выделяют два типа и более 10 сероваров вируса иммунодефицита человека. Вирус иммунодефицита человека отличается высокой антигенной изменчивостью, и в результате сбоев обратной транскриптазы из организма больного можно выделить серологически различные вирусы.

Главные антигены вируса иммунодефицита человека — поверхностные gp41 и gpl20, a также сердцевинный (ядерный) gp24.

Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.

Важность исследования строения генома ВИЧ обусловлена тем, что в основе всех патологических процессов, происходящих при заражении вирусом, лежит экспрессия вирусных генов.

Изучение структуры генетического аппарата ВИЧ с помощью молекулярного клонирования выявило его сложную организацию и значительные различия между изолятами. ДНК провируса имеет 9283 пары нуклеотидов (п.н.) и окружена длинными концевыми повторами — LTR — в 638 п.н. В LTR выявляются все обычные регуляторные элементы.

В чем опасность ЗППП
Венерические заболевания
Группы риска заражения ЗППП
Диагностика ЗППП
ЗППП - заболевания, передающиеся половым путем
Инкубационный период ЗППП
Инфекционные заболевания
ИППП – инфекции, передающиеся половым путем
Легенды и мифы о венерических заболеваниях
Лечение ЗППП
Подготовка к анализам на инфекции
Последствия и осложнения ЗППП
Профилактика заболеваний, передающихся половым путем (ЗППП)
Профилактика ЗППП
Пути передачи ЗППП
Симптомы и признаки ЗППП
СПИД
- Анализы на ВИЧ и СПИД
- Взаимодействие ВИЧ с другими клетками организма
- Взаимодействие ВИЧ с моноцитами
- Взаимодействие ВИЧ с Т-супрессорами
- ВИЧ-2
- ВИЧ-инфекция
- Влияние ВИЧ на Т-хелперы
- Возможности разработки вакцин
- Гены и белки ВИЧ
- Диагностика ВИЧ инфекции
- Заключение
- Клинические проявления ВИЧ инфекции
- Ко-факторы ВИЧ-инфекции
- Лечение ВИЧ и СПИД
- Лечение ВИЧ инфекции
- Макрофаги и вич
- Механизмы взаимодействия ВИЧ с различными звеньями иммунной системы
- Новые варианты вируса СПИД
- Оппортунистические инфекции и опухоли
- Особенности инфицирования и заболевания детей
- Патогенез и клиника ВИЧ инфекции
- Передача ВИЧ инфекции
- Последствия ВИЧ и СПИДа
- Профилактика СПИДа и ВИЧ-инфекции
- Пути передачи ВИЧ
- Регуляция экспрессии вирусных генов
- Результаты взаимодействия ВИЧ с В-клетками
- Симптомы ВИЧ
- Система интерферона при ВИЧ инфекции
- СПИД-ассоциированный комплекс
- Строение вирусной частицы ВИЧ
- Строение генома и экспрессия генов ВИЧ
До 30 апреля "Знакомство с доктором" на первичный прием врача скидка 20%
* Подробности уточняйте у администраторов

Первая открытая рамка кодирует внутренние белки вириона. Эти белки вместе с белками, кодируемыми геном pol, прочитываются, как и у других ретровирусов, с полноразмерной РНК в 9300 нуклеотидов. В результате трансляции этой иРНК образуется предшественник с мол. Массой 55 кД. В процессе дальнейшего протеолитического расщепления этот белок нарезается на p17, p24, p9 и р7. Согласно наблюдениям, в сыворотках больных СПИД обнаруживаются антитела ко всем этим продуктам. Значительную фракцию составляют антитела к р24 — основному внутреннему белку вириона. Антитела к р24 обычно появляются на ранних стадиях заболевания и часто исчезают по мере его прогрессирования.

Ген pol кодирует 3 фермента: протеазу (р22), обратную транскриптазу (р64/53) и эндонуклеазу (р31). Эти белки образуются в результате протеолитического расщепления предшественника с молю массой 150кД. Несмотря на относительно небольшое количество этих белков в вирионе (примерно 2 молекулы на вирион), антитела к ним выявляются в сыворотках больных СПИДом. Наиболее ярко выражена реакция с р31.

Sor .Tретья открытая рамка перекрывается с 3`-концом гена pol и кодирует белок с молю массой 23 кД. Антитела к этому белку удается выявить в сыворотках больных СПИДом. По-видимому, белок транслируется со сплайсированных полиаденилированных РНК размером 5500 × 5000 нуклеотидов. Как показали опыты с использованием инфекционной провирусной ДНК ВИЧ, мутации в области гена практически не влияли на способность вируса реплицироваться и оказывать цитопатогенное действие на CD4-клеточную линию, если не считать небольшого замедления этих процессов по сравнению с исходным вирусом. Тем не менее, высокая консервативность нуклеотидной последовательности гена sor указывает на наличиекакой-то функции продукта этого гена в жизненном цикле вируса. Возможно, эта функция важна при репликации в нелимфоидных клетках, например в нервных и ретикулоэпителиальных.

Env. и РНК, кодирующая белки оболочки вириона, образуется в результате сплайсинга, приводящего к удалению из геномной РНК большого интрона, содержащего гены gag, pol и sor. Образующаяся иРНК размером 4300 нуклеотида содержит открытую рамку с типичным инициирующим AUG, которая может направлять синтез белка, состоящего из 861 аминокислотного остатка с мол. массой 97.5 кД. Этот белок предшественник в дальнейшем обильно гликозилируется, в результате чего его мол. масса возрастает до 160 кД. Предшественник содержит 3 гидрофобные области, характерные для оболочечных белков других ретровирусов. Первый гидрофобный участок (с 17-й по 31-ю аминокислоты) соответствует сигнальному пептиду, второй находится в районе сайта протеолитического расщепления белка-предшественника, третий является частью трансмембранного белка. В результате протеолитического расщепления образуется 2 сильно гликозилированных белка: наружный белок оболочки gp120 и трансмембранный белок gp41. Интересной особенностью трансмембранного белка является наличие необычно длинной последовательности (длиной в 150 аминокислотных остатков) гидрофильных аминокислот вслед за гидрофобной частью трансмембранного белка. Эта последовательность, по-видимому, является внутриклеточным фрагментом gp41. Еще, как показали исследования, правильный процессинг gp160 происходит не во всех клеточных линиях. От чего это зависит, пока неизвестно.

3`-orf. Эта открытая рамка расположена между 8347-м и 8992-м нуклеотидами и простирается, таким образом, в U3 область 3`-LTR. Кодируемый этим геном белок имеет мол. массу 27 кД и транслируется со сплайсированной иРНК размером 1800 нуклеотидов.

Хотя антитела к этому белку удается выявить в крови больных СПИДом, он не является абсолютно необходимым для репликации вируса. Продукт 3`-orf оказывает влияние на цитопатогенность вируса.

Tat-3. Явление трансактивации было впервые описано для ретровирусов человека HTLV-1 и HTLV-2. Белок, осуществляющий функцию трансактивации, кодируется у этих вирусов небольшой открытой рамкой, расположенной на 3`-конце генома после гена env. Механизм его действия заключается в активации транскрипции структурных генов вируса, вследствие чего ген, кодирующий белок-трансактиватор, был назван tat (transactivator of transcription).

Феномен трансактивации выражен у ВИЧ на несколько порядков сильнее, чем у HTLV-1 и HTLV-2. Как сейчас стало ясно, за этот процесс у ВИЧ отвечают по крайней мере, 2 гена: tat-3 и art (trs). Первый из них кодируется иРНК размером около 2000 нуклеотидов, образующейся в результате сложного сплайсинга. Механизм действия белка tat-3 у ВИЧ значительно сложнее, чем у аналогичных белков tat вирусов HTLV-1 и HTLV-2.

Продукт гена tat-3 — белок с мол. массой 14 кД, выявляемый с помощью сывороток больных СПИД. Мутации в 5`-области первого кодирующего экзона tat-3 нарушают способность вируса синтезировать структурные белки и реплицироваться. Эти мутации могут быть комплементированы в клеточных линиях, постоянно экспрессирующих tat-3 белок. Сейчас получены линии как В- так и Т-лимфоцитов, стабильно трансформированных tat-3 геном и продуцирующих белок-трансактиватор. Другие клеточные линии, например HeLa, продуцирующие функциональный tat-3 белок, также могут поддерживать размножение мутантного по tat-3 ВИЧ. Использование подобных клеточных линий и клонированных провирусных ДНК, содержащих различного размера делеции в tat-3 гене, позволило изучить механизмы действия кодируемого этим геном белка.

Art (trs). Другим белком, участвующим в регуляции экспрессии структурных генов ВИЧ является продукт гена art (antirepression transactivator — антирепрессорный трансактиватор). Транслируется он, по-видимому, с иРНК, принадлежащей к тому же классу молекул размером 2000 нуклеотидов, что и иРНКtat-3. Кодирующие экзоны гена art перекрываются экзонамиtat-3, а при сплайсинге используются те же акцепторные и донорные сайты. Однако при трансляции art функционирует инициаторный AUG с координатой 5500, а не 5412, как для гена tat-3. В результате, art читается со сдвигом рамки отностительно tat-3, что приводит к уменьшению ее кодирующей рамки в первом транслируемом экзоне с 214 до 76 нуклеотидов и к увеличению во втором с 44 до 271 нуклеотида. Синтезируемый белок состоит из 116 аминокислотных остатков, причем основная доля приходится на аминокислоты, проявляющие основные свойства. Подобные белки обладают сродством к нуклеиновым кислотам и часто регулируют экспрессию генов.

Действие продукта art осуществляется на посттранскрипционном уровне. По-видимому, он активирует трансляцию иРНК структурных генов gag и env, снимая действие специфических негативных регуляторов. Наряду с этим продукт art участвует и в регуляции сплайсинга РНК, в связи с чем для указанного гена было предложено другое название — trs (transregulator of splicing — трансрегулятор сплайсинга).

Обзор

Распространенность СПИДа в мире на 2009 год.

Автор

Редакторы

Спонсор конкурса — дальновидная компания Thermo Fisher Scientific. Спонсор приза зрительских симпатий — фирма Helicon.

Иммунная система

Рисунок 1. Упрощенная схема иммунного ответа. Молниями указано, как один тип клеток активирует другие. Мф — макрофаг, Б — бактерия, ТХ — Т-хелпер, ВКл — B-клетка, ПлКл — плазматическая клетка, Ат — антитела, Б+Ат — бактерия, покрытая антителами, привлекающими макрофагов, В — вирус, ЗМф — зараженный макрофаг, ТК — Т-киллер, ЗК — клетка, зараженная вирусом, УК — умирающая (апоптотирующая) клетка, В+Ат — вирус, покрытый антителами.

рисунок автора статьи

Жизненный цикл ВИЧ

Видео. Жизненный цикл ВИЧ.

Таким образом, после того как копия вируса в геноме клетки начинает действовать, на её поверхности появляются знакомые нам белки gp41 и gp120, в цитоплазме — остальные вирусные белки и вирусная РНК. И через некоторое время от зараженной клетки начинают отпочковываться всё новые и новые копии ВИЧ.

Способы уничтожения иммунной системы

При отпочковывании вирус использует клеточную мембрану клетки, и со временем это должно вызвать ее разрушение. К тому же, вирусный белок Vpu вызывает увеличение проницаемости мембраны клетки [6]. При активации вируса в клетке появляется неинтегрированная в геном двуцепочечная ДНК [19], наличие которой может рассматриваться клеткой как повреждение ее генетического материала и индуцировать ее смерть через апоптоз (С точки зрения организма такая клетка потенциально может стать раковой). Помимо этого, вирусные белки напрямую нарушают баланс про- и противоапоптотических белков в клетке. К примеру, вирусная протеаза p10 может разрезать противоапоптотический фактор Bcl-2. Белки Nef [26], Env [22] и Tat [24] вовлечены в возрастание количества клеточных белков CD95 и FasL, служащих индукторами апоптоза по т.н. Fas-опосредованному пути. Белок Tat положительно регулирует каспазу 8 [2] — ключевой фактор индукции апоптоза.

Если же клетки не погибли сами, они активно уничтожаются Т-киллерами. (Это стандартный ответ иммунитета на заражение любыми вирусами.)

Помимо этого, при производстве gp120 и Tat часть их выбрасывается зараженной клеткой в кровоток, а это оказывает токсическое действие на организм [4], [28]. gp120 оседает на все СD4 + -клетки (в том числе и здоровые), что имеет три последствия:
1. Белок СD4 важен для взаимодействия Т-хелпера с фагоцитом, при слипании же СD4 с gp120 T-хелпер перестает выполнять эту функцию.
2. На gp120 как на чужеродный белок образуются антитела; после оседания gp120 на здоровые клетки, последние маркируются антителами, и иммунная система их уничтожает [9].
3. После обильного связывания Т-хелпером gp120 клетка умирает сама. Дело в том, что CD4 — это корецептор. Он усиливает сигнал от TCR (T-cell receptor) — главного белка, позволяющего выполнять Т-клеткам функцию иммунитета. В норме эти рецепторы активируются вместе. Если же активируется один тип рецепторов, но не активируется другой, это является сигналом, что что-то пошло не так, и клетка умирает посредством апоптоза.
Антитела, призванные препятствовать инфекции, в случае с ВИЧ часто, наоборот, ее усиливают [28]. Почему так происходит — не совсем понятно. Одну причину мы рассмотрели выше. Возможно, дело в том, что антитела сшивают несколько вирусных частиц вместе, и в клетку попадает не один, а сразу много вирусов. Помимо этого, антитела активируют клетки иммунитета, а в активированной клетке вирусные белки синтезируются быстрее.

Вдобавок, gp120 и gp41 имеют участки, похожие на участки некоторых белков, участвующих в иммунитете (например, MHC-II [25], IgG [23], компонент системы комплемента Clq-A [14]). В результате на эти участки образуются антитела, способные помимо вируса маркировать совершенно здоровые клетки (если на них будут эти белки), с соответствующими для них последствиями.

Так как на поверхности зараженной клетки появляется gp120, то она, как и вирусная частица, будет сливаться с другими СD4-содержащими клетками, образуя огромную многоядерную клетку (синцитий), неспособную выполнять какие-либо функции и обреченную на смерть.

На самом деле, помимо Т-хелперов, СD4 содержатся во множестве других клеток — предшественниках Т-киллеров/Т-хелперов, дендритных клетках, макрофагах/моноцитах, эозинофилах, микроглии (последние четыре — разновидности фагоцитов), нейронах (!), мегакариоцитах, астроцитах, олигодендроцитах (последние две — клетки, питающие нейроны), клетках поперечно-полосатых мышц и хорионаллантоиса (присутствует в плаценте) [29]. Все эти клетки способны заражаться ВИЧ, но сильно токсичен он лишь для Т-хелперов. Это и определяет основное клиническое проявление СПИДа — сильное снижение количества Т-хелперов в крови. Однако для других клеток заражение тоже не проходит бесследно — у больных СПИДом часто снижена свертываемость крови, имеются неврологические и психиатрические отклонения [16], наблюдается общая слабость.

Пути заражения ВИЧ

Внимание! Ввиду того, что СПИД является венерическим заболеванием, информация, приведенная в этом разделе, может вас оскорбить либо вызвать неприятные эмоции при прочтении. Будьте осторожны.

Рисунок 3. Пути проникновения ВИЧ в организм при половом контакте. Слева указано примерные временные рамки каждого этапа.

Как же происходит первичное заражение человека ВИЧ? Думаю, что с переливанием крови или с использованием общего шприца при употреблении наркотиков читателю все понятно — вирус доставляется напрямую из зараженной крови в здоровую. При вертикальном способе передачи инфекции (от матери к ребенку) заражение может произойти во время внутриутробного развития, в момент родов или в период кормления ребенка грудью (т.к. вирус и зараженные вирусом клетки содержатся в молоке матери) [17], [20]. Тем не менее, даже у ребенка, рожденного от ВИЧ-инфицированной матери, есть шанс остаться здоровым, особенно если мать использует ВААРТ (высокоактивную антиретровирусную терапию) [5]. А почему же люди заражаются при половом контакте?

Механизмы передачи вируса при половом акте не до конца ясны. Тем не менее, они понятны в общих чертах. Итак, рассмотрим барьеры, которые необходимо преодолеть вирусу, чтобы добраться до макрофагов и Т-хелперов. К сожалению, рассматривать особо нечего: барьер только один — это слой эпителиальных клеток и вырабатываемая ими слизь, находящиеся во влагалище (а также пенисе, прямой кишке, глотке). Барьер этот тонок — он может быть всего одну клетку в толщину, — но для вируса труднопреодолим, доказательством чего может служить сравнительно небольшой процент заражений — примерно 1–2 случая на 100 половых контактов. Итак, и какими же путями преодолевает вирус это препятствие?

Наиболее очевидный механизм — это микротравмы. При обычном половом контакте, а особенно при анальном сексе, почти неизбежно появляются микротрещины; при наличии же венерических заболеваний часто возникают изъязвления слизистой. Через эти микротравмы вирус, содержащийся в сперме и влагалищном секрете, может проникнуть к иммунокомпетентным клеткам [17], [20].

Помимо дендритных клеток, в кишечнике существует другой тип клеток, предназначенный для ознакомления организма с антигенами внешней среды. Это так называемые М-клетки, пропускающие через себя довольно крупные объекты неповрежденными из просвета кишечника. В т.ч. через них может проходить и вирион ВИЧ.

Свой вклад в заражение вносит и провоспалительный процесс, в норме присутствующий в женских половых путях из-за наличия в них спермы. Благодаря ему Т-клетки подвержены активации, что способствует их восприимчивости к инфекции.

Итак, риск заразиться ВИЧ возрастает в ряду (Классический секс → Анальный секс → переливание крови / использование общих шприцов при принятии наркотиков). Что же касается орального секса, то весьма небольшой шанс заразиться есть только у принимающей стороны — слюна и тем более желудочный сок инактивирует ВИЧ. Теоретически, этим способом может заразиться и мужчина, но для этого необходимы ранки на пенисе.

При поцелуях и обычных бытовых контактах вирус не передается — он очень неустойчив в окружающей среде .

Заключение

. Все эти факты позволяют надеяться, что вскоре ВИЧ, как и оспа, останется в прошлом.

Новость

Комплекс-белок Cas9/sgRNA/viral RNA (слева) и модель вируса иммунодефицита человека (справа), построенная коллективом Visual science.

Автор

Редактор

Генеральным спонсором конкурса, согласно нашему краудфандингу, стал предприниматель Константин Синюшин, за что ему огромный человеческий респект!

Спонсор публикации этой статьи — Виктор Татарский.

Врага нужно знать в лицо

Об иммунитете, апоптозе и вообще.

Иммунная система развивалась сотни миллионов лет. По типу реакции ее обычно делят на врожденный (неспецифичный) и приобретенный (специфичный) иммунитет [1], [2]. Считается, что специфичный (то есть вырабатываемый к конкретному патогену) иммунитет впервые появился у челюстноротых (рыб и всех вышестоящих по эволюционному древу таксонов) после отделения от бесчелюстных (миног и миксин), хотя у вторых имеется аналогичная система защиты [3]. К клеткам специфичного иммунитета относят В-лимфоциты, Т-лимфоциты и NK-клетки (естественные киллеры, natural killer cells). Помимо этого существуют моноциты, которые хоть и не являются истинными инструментами приобретенного иммунитета, однако выполняют некоторые функции по нейтрализации патогена: фагоцитоз, презентация антигена, выделение бактерицидных веществ и цитокинов.

Рисунок 1. Взаимодействия Т-киллеров (слева) и Т-хелперов (справа) с зараженными клетками. Для передачи сигнала о заражении необходимо выполнение двух условий: контакт комплекса МНС-патоген с TcR (T-cell Receptor, рецептор Т-клеток) и CD. Двигаясь по организму, Т-лимфоциты проверяют каждую клетку на предмет наличия у нее антигена в комплексе с МНС. Их можно сравнить с подслеповатой глуховатой бабушкой, пришедшей забирать дитятко из детского сада. Для опознания ей надо подойти вплотную и по нескольким (в данном случае по двум) признакам определить, ее ли это чадо или нет.

Т-лимфоциты, в свою очередь, необходимы для уничтожения клеток, зараженных внутриклеточными паразитами, и опухолевых клеток. Они делятся на два основных типа в зависимости от класса рецепторов, находящихся на внешней стороне их мембраны.

Т-киллеры несут CD8 рецепторы и отвечают за:

Т-хелперы имеют CD4 рецепторы и ответственны за секрецию цитокинов, которые:
- активируют макрофаги для борьбы с внутриклеточными паразитами;
- способствуют продукции антител В-лимфоцитами.
Но не менее важна роль Т-хелперов в подготовке зрелых Т-киллеров из клеток-предшественниц, активации NK-клеток и моноцитов.

Как же происходит опознавание антигена на молекулярном уровне? Здесь надо упомянуть еще об одном очень важном классе рецепторов — МНС (Major Histocompability Complex или главном комплексе гистосовместимости). Они бывают двух классов: I и II. МНС I присутствует на поверхности всех ядерных клеток организма человека. Он необходим для опознавания клетки натуральным киллером и Т-киллером (рис. 1, 2). Если по какой-то причине МНС I изменен, несет на себе антиген или отсутствует, клетка будет подвергнута апоптозу. МНС II находится на поверхности В-лимфоцитов, макрофагов и дендритных клеток. Он необходим для презентации антигена Т-хелперам (рис. 1, 2). Жизнь пула Т-хелперов можно представить как прогулку с ребенком в зоопарке, только вместо животных — антигены, вместо ребенка — Т-хелпер, а вместо взрослых, объясняющих, кто есть кто, — три перечисленных типа клеток.

Рисунок 2. Процесс передачи сигнала Т-киллеру и Т-хелперу. Первый этап — сборка комплекса МНС-антиген, второй этап — презентация комплекса на поверхности клетки.

Первый этап проникновения вируса в клетку — взаимодействие вирусного белка gp120 (рис. 3) с рецептором CD4. Отсюда понятно, почему ВИЧ размножается именно в Т-хелперах. Взаимодействию способствуют корецепторы CCR5 и CXCR4 [8]. В норме они являются рецепторами цитокинов, а при взаимодействии ВИЧ с клеткой их связь является необходимым условием проникновения вируса внутрь. Мутации в генах этих рецепторов обеспечивают частичную устойчивость носителей таких мутаций (таких людей около 2%, причем некоторые штаммы вируса все равно могут их поражать) [9]. Затем в мембрану клетки погружается белок gp41, после чего мембрана вируса сливается с клеточной, и происходит распаковка генетического материала. По принципу обратной транскрипции с РНК-матрицы вируса с помощью фермента ревертазы (обратной транскриптазы) синтезируются молекулы кДНК (комплементарной ДНК). Синтезированная кДНК вставляется вирусной интегразой в геном клетки хозяина. После попадания в геном хозяина вирус может никак себя не проявлять до нескольких лет — протекает так называемый инкубационный период. Только когда клетки активно пролиферируют, а значит, синтезируют белки на матрице ДНК, начинается сборка вирусных частиц , выход их из клеток и гибель последних (так как каждая частица забирает с собой часть клеточной мембраны клетки, вирусы попросту разрывают клетку).

Рисунок 3. Строение ВИЧ. Белки gp120 и gp41 участвуют в рецепции вируса клеткой и проникновении вирусной частицы внутрь. Липидная оболочка захватывается от клетки хозяина вместе с частью мембранных белков. Белки матрикса синтезируются в клетке после встраивания кДНК в геном в момент наработки клеточных белков для деления. Протеаза, возможно, необходима для разрезания противоапоптотического фактора Bcl-2 [9]. Ферменты обратная транскриптаза и интеграза создают кДНК на матрице РНК и встраивают кДНК в геном Т-хелпера соответственно. Tat — белок, вовлеченный в индукцию апоптоза. Нуклеокапсид — комплекс из РНК и белков вируса, представляющий собой компактную упакованную форму генома. Капсид — белковая оболочка, защищающая содержимое от воздействия внешних условий.

Как иммунитет бактерий правит геномы

Система редактирования геномов CRISPR/Cas известна уже довольно давно (впервые локус описал в 1987 году Есизуми Исино из университета Осаки), но только недавно (в 2005 году) ученые поняли ее истинное предназначение [11], [12].

Как вы уже поняли, система состоит из двух компонентов: CRISPR-локуса (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats или сгруппированные и регулярно разделенные короткие палиндромные повторы) и белков Cas, которые, являются нуклеотид-специфичными эндонуклеазами (а название получили за работу в команде с CRISPR — Crispr associated).

Помимо CRISPR-локуса и блока генов Cas в ДНК бактерии (не обязательно в нуклеоиде [12]) находится ген tracrРНК (transactivated crispr RNA), частично комплементарной палиндромам.

Для формирования специфичной устойчивости к вирусу бактерия, как и человек, должна встретиться с ним дважды.

Первый раз после внедрения вирусной ДНК в клетку происходит разрезание ДНК белками Cas1 и Cas2 на протоспейсеры и встраивание их в начало CRISPR-локуса. Cas1 и Cas2 формируют при этом комплекс, причем Cas2 играет только структурную роль, удерживая ДНК, тогда как Cas1 встраивает ее. Каждый протоспейсер вставляется в CRISPR-локус так, чтобы от другого (уже имеющегося) спейсера его отделял палиндром.

Соответственно, после транскрипции ДНК всего комплекса образуются три продукта (рис. 4):
- tracrРНК;
- РНК белка Cas (наиболее изученным является Cas9, поэтому далее повествование пойдет о нем), далее транслирующаяся;
- pre-crРНК (poly-spacer precursor crRNA или многоспейсерный предшественник crРНК), которая представляет собой транскрипт спейсеров, разделенных образовавшимися из палиндромов шпильками или петлями.
Рисунок 4. Строение CRISPR-локуса и результат транскрипции. leader — лидерная последовательность, отвечающая за начало транскрипции, со стороны которой вставляется новый спейсер. repeat — палиндромный повтор, который после транскрипции превращается в шпильку или петлю.

Второй этап — образование комплекса pre-crРНК/Cas9/РНКаза III. Очевидно, что вся длинная pre-crРНК не может участвовать в опознавании инвазивной ДНК, так как, во-первых, очень длинна, что конформационно неудобно, а во-вторых, при сравнении спейсеров РНК с протоспейсерами инвазивной ДНК длинный транскрипт начнет путаться и в итоге образует клубок, непригодный для дальнейшей работы. Самое логичное — разделить длинную последовательность на короткие участки, которые могли бы проверятся на соответствие инвазивной ДНК белком Cas9. И тащить за собой не надо, и не запутается.

С помощью фермента РНКазы III и при участии tracrРНК pre-crРНК разделяется по границам повторов так, что в белково-нуклеиновый комплекс входят один спейсер и один повтор, комплементарно связанный с tracrРНК (рис. 5) [13]. Повтор полностью теряет свою вторичную структуру, tracrРНК же оставляет несколько шпилек (обычно три).

Рисунок 5. Белково-нуклеиновый комплекс после созревания транскрипта. crРНК состоит из спейсера (слева) и повтора, соединенного с частью tracrРНК (справа). Три петли на tracrРНК нужны для удержания ее эндонуклеазой Cas9.
- комплементарность спейсера комплекса Cas9/crРНК/tracrРНК протоспейсеру инвазивной (например, вирусной) ДНК;
- наличие в геноме вируса около протоспейсера последовательности из трех нуклеотидов — РАМ (Protospacer Adjacent Motif, прилежащий к протоспейсеру мотив).
Таким образом клетка страхуется от уничтожения своей ДНК. Но даже просто разрезанная в одном месте вирусная ДНК может представлять опасность, поэтому завершает инактивацию негомологическое сращивание концов (non-homologous end joining, NHEJ). При этом происходит инсерция/делеция одного или нескольких нуклеотидов, что приводит к потере инфекционности.

Рисунок 6. Полная схема механизма работы CRISPR/Cas9 системы. а — Транскрипция CRISPR локуса с образованием pre-crРНК. б, в — Разрезание РНК РНКазой III и образование комплексов Cas9/tracrРНК/crРНК. г — Вторичное проникновение в клетку чужеродной ДНК. д — Соединение комплекса с инвазивной ДНК. е — Образование двухнитевого разрыва в протоспейсере.

А где же тут редактирование геномов? А вот где:
- во-первых, таким образом можно просто нокаутировать целевой ген и добиться прекращения экспрессии того или иного белка;
- во-вторых, после создания двухцепочечного разрыва в образовавшуюся брешь можно вставить нужный нам ген и заставить организм синтезировать нужный нам белок.
Рисунок 7. Сравнение искусственной (а) и естественной (б) систем CRISPR/Cas9. Отличие состоит лишь в том, что искусственная РНК едина, а природная — состоит из двух частей, гены которых разделены.

Битва века

Однако вернемся к теме этой статьи.

Так как система редактирования геномов может помочь в избавлении от ВИЧ? Очень просто: вирус можно вырезать! Нацелив Cas9, путем создания sgРНК с последовательностью, комплементарной вирусной кДНК.

Некоторое время назад группа ученых из немецкого Института экспериментальной вирусологии и иммунологии уже пыталась использовать инструмент редактирования геномов для удаления ВИЧ из культуры HeLa [15]. Они модифицировали Cre-рекомбиназу методом направленной эволюции и один из полученных вариантов использовали для удаления вируса путем контролируемой рекомбинации [16]. Однако надо учитывать, что между Т-хелперами и опухолевой HeLa есть немало различий, к тому же, авторы не предлагают вариантов доставки или экспрессии гена Tre-рекомбиназы (усовершенствованный вариант фермента Cre).

С другой стороны, группа американских исследователей опубликовала в марте этого года статью [17], где подробно описывались метод доставки и механизм удаления вируса. Ученые ставили перед собой задачу не только полностью избавить клеточную культуру Т-хелперов от вируса, но и проверить отсутствие цитотоксического действия самой CRISPR/Cas9 системы. Единственный недостаток этого геномного инструмента в том, что из-за сравнительно небольшой длины спейсера, даже при наличии страхующего элемента PAM, в больших геномах могут быть найдены нецелевые сайты, подверженные разрезанию (off-target sites). Именно поэтому исследователи уделяли данной проблеме немало внимания.

Работа проводилась с использованием штамма ВИЧ-1 и клеточной линии Т-хелперов 2D10, зараженной вирусом в покоящейся стадии. Доставка и экспрессия sgРНК/Cas9 осуществлялась с помощью лентивирусного вектора.

Для оценки того, вырезался ли вирус из двух мест встраивания (1-я и 16-я хромосомы), было проведено полногеномное секвенирование. Оно показало, что в клетках, где экспрессировались и гены Cas9, и sgРНК, провирусная ДНК отсутствует.

Был проведен анализ того, могут ли гены, куда встроился провирус (RSBN1 и MSRB1), и близлежащие гены нормально транскрибироваться после его вырезания. Ученые показали, что как RSBN1, так и MSRB1 нормально экспрессируются. Соседние гены также не претерпели изменений.

С помощью биоинформатических методов и анализа баз данных было показано, что sgРНК/Cas9 не проявляет активности по отношению к нецелевым сайтам.

Таким образом, можно с уверенностью сказать, что группа Камински впервые успешно удалила ВИЧ из культуры зараженных Т-хелперов. Данное достижение приблизило человечество к победе на ВИЧ. Да, это только культура клеток. Да, до внедрения данной техники в медицину пройдут годы, а может и десятки лет, но данная работа является уникальной в своем роде, ибо ученые не только бросили вызов одному из страшнейших заболеваний на планете, но и смогли победить его — пусть даже масштаб сражения пока невелик.

Перспективы применения данной технологии очевидны: введя пациенту вектор, содержащий гены Cas9 и sgРНК, мы добьемся их экспрессии и полного удаления вируса из клеток. Современная терапия, направленная против ретровирусов, являющаяся основным средством борьбы с ВИЧ, не удаляет вирус из клеток, так как провирус остается встроенным в ДНК хозяина. В свою очередь, данный подход не оставляет вирусу шансов укрыться.

Читайте также: