Обнаружение возбудителей лептоспироза и мелиоидоза в мясе

Обновлено: 17.04.2024

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Лабораторная диагностика мелиоидоза

Дата введения: 2010 г.

1. Методические указания разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека; (Ю.В.Демина, Н.Д.Пакскина); ФГУЗ "Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт" Роспотребнадзора (В.И.Илюхин, В.В.Алексеев, Н.П.Храпова, В.А.Антонов, Т.В.Сенина, В.Н.Андрус, Н.И.Погасий, Г.А.Ткаченко, В.В.Алексеева, С.С.Савченко, Е.В.Шубникова, Т.В.Булатова, Ю.И.Сорокина).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. УТВЕРЖДЕНЫ И ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 6 декабря 2010 г.

4. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.

Список сокращений

бычий сывороточный альбумин

гуаниновые и цитидиновые нуклеотиды

двутретьосновная соль гипохлорита кальция

жидкая минимальная среда с антибиотиками

мясо-пептонный агар (бульон) с глицерином

минимальная подавляющая концентрация

метод флуоресцирующих антител

нейтральный гипохлорит кальция

нормальная кроличья сыворотка

нормальная лошадиная сыворотка

нитроцеллюлозная мембрана (фильтр)

показатель повреждения нейтрофилов

полимеразная цепная реакция

реакция непрямой гемагглютинации

реакция связывания комплемента

реакция торможения непрямой гемагглютинации

твердофазный иммуноферментный анализ (метод)

триптиказосоевый агар (бульон)

цитратно-фосфатный буферный раствор

1. Область применения

1.1. Методические указания предназначены для специалистов лабораторного звена как в системе органов, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор, так и в системе лечебно-профилактических учреждений независимо от форм собственности.

1.2. В методических указаниях определены порядок забора, транспортирования и выполнения лабораторных исследований биологического материала от больных и умерших людей, животных с подозрением на мелиоидоз, материала из объектов окружающей среды, подозрительного на контаминацию возбудителем данного заболевания.

2. Нормативные ссылки

2.1. Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности): СП 1.3.1285-03. М., 2003.

2.2. Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности: СП 1.2.036-95. М., 1996.

2.3. Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности: МУ 1.3.1794-03*. М., 2004.

* На территории Российской Федерации документ не действует. Действуют МУ 1.3.2569-09. - Примечание изготовителя базы данных.

2.4. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам: МУК 4.2.1890-04. М., 2004.

2.5. Обеззараживание биологического материала и объектов внешней среды, зараженных бактериями I-IV групп патогенности, при исследованиях методом ПЦР: МУ 3.5.5.1034-01*. М., 2001.

2.6. Методические рекомендации "Лабораторная диагностика, лечение и профилактика мелиоидоза". Волгоград, 1994.

2.7. Методическое пособие для проведения практических занятий по лабораторной диагностике мелиоидоза с использованием штамма-имитатора Burkholderia thailandensis КM-161. Волгоград, 2008.

2.8. Методические рекомендации по проведению профилактических и противоэпидемических мероприятий в завозных очагах мелиоидоза. Волгоград, 1982.

2.9. Специфическая индикация патогенных биологических агентов: Практическое руководство. М., 2006.

2.10. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней: Практическое руководство. М., "Медицина", "Шико", 2009.

3. Общие сведения

Мелиоидоз - тропический бактериоз, протекающий с явлениями сепсиса и образованием абсцессов в органах и тканях.

Естественным резервуаром возбудителя являются домашние животные (козы, овцы, свиньи, коровы, лошади, собаки, кошки и др.), среди которых могут возникать эпизоотии, а также некоторые виды грызунов. Инфицированные животные, выделяя возбудителя с естественными жидкостями и экссудатом раневых поверхностей, обсеменяют объекты окружающей среды. В. pseudomallei длительно сохраняется в воде и почве, активно участвуя в процессах денитрификации.

Основной механизм заражения человека - контактный, реализуется при контакте поврежденной кожи или слизистых оболочек с инфицированными почвой и водой (например, при работе на рисовых плантациях, купанием в стоячих водоемах).

Необходимость разработки мероприятий по индикации дополнительно усиливается сведениями о возможности использования возбудителя мелиоидоза в качестве агента биотерроризма.

Возбудитель мелиоидоза В. pseudomallei относится к роду Burkholderia. Это палочка с закругленными концами размером (0,5-0,8)·(2,0-6,0) мкм, однако могут встречаться также коккобациллярные и нитевидные формы. Подвижен за счет наличия нескольких жгутиков на одном конце клетки (лофотрих).

В. pseudomallei - факультативный аэроб, растет при температуре 37 °С на простых питательных средах. Добавление глицерина (1-5%) улучшает ростовые качества сред. Может размножаться в анаэробных условиях в присутствии нитрата. В отличие от возбудителя сапа растет при температуре 42 °С. В бульоне дает помутнение с образованием к концу первых суток нежной слизистой пленки с более толстым пристеночным ободком. Быстро утолщаясь (до 1 мм), пленка приобретает серовато-желтый цвет. При старении культуры на дне пробирки образуется слизистый осадок.

На плотных питательных средах отмечается морфологическая диссоциация колоний. S-форма - колонии вначале круглые, прозрачные, выпуклые, с ровными краями, к 48 ч они достигают диаметра 1-3 мм и начинают диссоциировать (теряют прозрачность, становятся серовато-белыми с металлическим блеском, поверхность - шероховатая). В отдельных случаях появляются мукоидные колонии. При сливном росте наблюдается гладкий, слизистый, блестящий, непрозрачный налет, приподнимающийся над поверхностью агара. R-форма - серовато-желтые непрозрачные колонии диаметром 2-4 мм с морщинистой поверхностью и неровным зубчатым краем. На скошенном агаре образуется морщинистый, сухой, непрозрачный налет серовато-белого цвета. При выращивании на среде Эшдауна мелиоидозные колонии приобретают темно-красный цвет за счет сорбции из среды нейтрального красного, вокруг колоний наблюдается просветление среды.

Все известные штаммы В. pseudomallei, выделенные из клинического материала и внешней среды, резистентны к полимиксину В и гентамицину, МПК более 50 и 4 мкг/мл, соответственно.

Антигенная структура возбудителя мелиоидоза достаточно сложна. В настоящее время у микроба выявлены жгутиковый (Н), соматический (О), капсульный (К) и слизистый (М) антигены. В составе соматических (липополисахаридных) О-антигенов имеются компоненты, близкородственные антигенам возбудителя сапа.

В. pseudomallei патогенен для человека, обезьян, диких грызунов (хомяков, хорьков, крыс, мышей) и лабораторных животных (кроликов, морских свинок, белых крыс и мышей). При внутрибрюшинном заражении самцов лабораторных животных может наблюдаться феномен Штрауса (скротальная реакция).

Возбудитель мелиоидоза термолабилен: при температуре 58 °С погибает в течение 15 мин, на холоде (при температуре 4 °С) отмирает в течение 2-3 недель. Устойчив к высушиванию. В гниющих материалах остается жизнеспособным от 8 до 27 дней, в воде - до 44 дней. Дезинфектанты (3-5% фенол, 5% формалин) убивают возбудителя мелиоидоза в течение суток. По морфологическим, биологическим и особенно антигенным свойствам возбудитель мелиоидоза сходен с бактериями сапа. Для их дифференциации используют совокупность фенотипических признаков и серологические реакции.

4. Материал для исследования, отбор и транспортирование проб

Вся работа с исследуемым материалом, подозрительным на зараженность возбудителем мелиоидоза, проводится в соответствии с требованиями по безопасности работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (санитарными правилами СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)" и СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности", а также методическими указаниями МУ 1.3.2569-09 "Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности").

Идентификация возбудителя мелиоидоза предусматривает выделение возбудителя (или выявление его антигенов) из объектов исследования и определение специфических антител в крови людей и животных. Схема лабораторной диагностики мелиоидоза (рис.1).

Рис.1. Схема исследования материала на наличие в нем В. pseudomallei

У больных животных и человека возбудитель мелиоидоза может быть выделен из содержимого абсцессов, мокроты, гнойного отделяемого язв, рвотных масс. При острой септической форме возбудитель обнаруживается в крови, моче, цереброспинальной жидкости и в полостных экссудатах.

В пробы, отобранные для бактериологического исследования, с целью подавления роста посторонней микрофлоры добавляют полимиксин В (50 мкг/мл) и гентамицин (4 мкг/мл). До начала исследования материал следует хранить при комнатной температуре. Пробы изучают параллельно согласно представленной ниже схеме бактериологическими и серологическими методами (рис.1).

Забор проб воды и почвы в эндемичных районах проводят в хорошо прогреваемых сырых местах, вблизи водопоев скота, навозохранилищ и жижесборников, на полях орошения. Воду с поверхности луж, рисовых полей, мелких водоемов и искусственных емкостей отбирают в стерильные флаконы в объеме 50-100 мл. Почву в количестве 5-10 г забирают с глубины 20-40 см в пробирки.

При необходимости пересылки (транспортировки) материала для исследования используют жидкую минимальную среду с антибиотиками (см. раздел 5.1). Контейнеры с объектами содержат при комнатной температуре, патогенные буркхольдерии при низких температурах (4 °С) отмирают в течение недели. Температурный режим необходимо учитывать и при пересылке чистых культур на плотных питательных средах для окончательной идентификации.

Лептоспирозявляется природно-очаговым зоонозным инфекционным заболеванием, характеризующимся лихорадкой, поражением печени, почек и нервной системы на фоне общей интоксикации. Нередко сопровождается геморрагическим симптомом и желтухой. Возбудитель лептоспироза может проникнуть в организм через слизистые оболочки или травмированные кожные покровы. От заражения до первых клинических проявлений лептоспироза может пройти от нескольких дней до месяца. В ранней диагностике лептоспироза большую роль играет микроскопическое обнаружение лептоспир в препарате крови, результаты бакпосева зачастую носят ретроспективное значение [1].

Инкубационный период составляет от четырех до четырнадцати дней. Заболевание поражает внезапно, без каких либо предвестников. Происходит быстрое повышение температуры до 40 градусов, появляется озноб.

Лептоспироз вызывает Leptospira interrogans. Это грамотрицательная аэробная подвижная спиралевидная палочка, напоминающая спирохету. В настоящее время выделено более 230 сероваров лептоспиры. Бактерии обладают умеренной устойчивостью в окружающей среде, патогенные лептоспиры погибают при воздействии солнечного света, высоких температур. В воде разные штаммы могут существовать от нескольких часов до месяца. В сухой почве жизнеспособность лептоспиры сохраняется 2 часа, в заболоченной - до 10 месяцев. Могут переносить замораживание, во влажной почве и водоемах способны пережить зиму. На пищевых продуктах лептоспиры сохраняются 1-2 дня. Погибают с течение 20 минут при воздействии однопроцентной хлороводородной кислотой и полупроцентным раствором фенола.

Лептоспироз распространяется с помощью фекально-орального механизма преимущественно водным путем. Кроме того, можно отметить вероятность передачи контактным и пищевым (кормовым) путем.

Современная лабораторная диагностика лептоспирозов основана на комплексе микробиологических и иммунологических методов, которые используются в различных комбинациях в зависимости от фазы заболевания и диагностических возможностей лаборатории.

Материалом для исследования являются кровь, моча, спинномозговая жидкость (СМЖ) больного, а при летальных исходах - паренхиматозные органы, грудной и брюшной транссудат.

Метод прямой микроскопии

Лептоспиры плохо воспринимают окраску, поэтому все наблюдения проводят с живыми возбудителями в темном поле зрения микроскопа. С этой целью используют конденсор темного поля (например, ОИ-13) и осветитель ОИ-19 или другой системы.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Принцип метода. В основе метода ПЦР лежит многократное копирование (амплификация) специфического фрагмента ДНК-мишени, который является маркерным для данного вида.

Бактериологическим методом исследуют тот же материал и в те же сроки, что и при использовании метода микроскопии.

Дифференциация патогенных лептоспир от сапрофитных проводится по результатам биопробы и культурально-биохимическим тестам.

Биологический метод в диагностике лептоспирозов используется редко.

Серологические исследования - основа лабораторной диагностики лептоспирозов.

Выделенные на местах штаммы лептоспир идентифицируются до серогруппы с помощью набора диагностических агглютинирующих сывороток [2].

Переболевшие лептоспирозом животные приобретают стойкий и напряженный иммунитет, длящийся годами. Но после переболевания у части животных с мочой долгое время выделяются лептоспиры, т.е. иммунитет нестерильный. У другой части животных – иммунитет стерильный.

При лептоспирозе развивается как клеточный, так и гуморальный иммунитет.

В целях своевременного выявления лептоспироза проводят исследование сыворотки крови животных в реакции микроагглютинации (РМА): на племпредприятиях, станциях (пунктах) искусственного осеменения и в племенных хозяйствах (фермах) всех производителей 2 раза в год; свиней, крупный и мелкий рогатый скот, лошадей - перед вводом (ввозом) и выводом для племенных и пользовательных целей (за исключением животных на откорм) поголовно; во всех случаях при подозрении на лептоспироз.

При остром и подостром течении лептоспироза применяют сыворотку поливалентную гипериммунную против лептоспироза животных, стрептомицин, канамицин, антибиотики тетрациклинового ряда. Для санации лептоспироносителей используют стрептомицин, а у свиней - дитетрациклин. При осложнениях после абортов лептоспирозной этиологии проводят симптоматическое лечение. Патогененическая терапия направлена на детоксикацию и лечение осложнений. У мелких домашних животных применяют плазмаферез, гемосорбцию, экстракорпоральный диализ [3].

Кисленко В. Н. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии. – М.: КолосС, 2010. – 232с.

Асонов Н. Р. Микробиология. – 4-е изд. И доп. – М.: КолосС, 2011г. – 352с.

Андреев Г.М., "Справочник ветеринарного врача", Санкт- Петербург, 2011г., 895с.

Мелиоидоз (ложный сап, болезнь Уитмора) - острая инфекционная болезнь, протекающая в виде тяжелого сепсиса с образованием множественных абсцессов в различных органах или в виде относительно доброкачественных легочных форм. Возбудитель - Pseudomonas pseudomallei (бацилла Уитмора), представляет собой грамотрицательную, биполярно окрашивающуюся палочку длиной 2-6 мкм и шириной 0,5-1 мкм. Аэроб имеет жгутики, подвижен, хорошо растет на питательных средах. Возбудитель длительно сохраняется во внешней среде. Во влажной среде выживает до 30 дней, в гниющих материалах - 24 дня, в воде - до месяца и более. Погибает при нагревании и под воздействием дезинфицирующих средств. Различают 2 антигенных типа возбудителя: тип I (азиатский), широко распространенный повсюду, включая Австралию, и тип II (австралийский), распространенный преимущественно в Австралии. Патогенность этих типов существенно не различается. Возбудитель чувствителен к левомицетину, тетрациклину, канамицину, некоторым сульфаниламидным препаратам.

Существует точка зрения, что серопозитивность населения Юго-Восточной Азии к мелиоидозу может быть связана с менее патогенным близкородственным микроорганизмом - В. thailandensis широко распространенным в северных территориях Таиланда и отсутствующим в других регионах, в частности, в Австралии. Однако, несмотря на высокие показатели серопозитивности, в Таиланде смертность от мелиоидоза составляет около 50 %, а в Австралии лишь 20 % .Связано ли это с предрасположенностью населения Таиланда к заболеванию или циркуляцией в этом регионе более вирулентных штаммов B.pseudomallei на сегодняшний день остается предметом дискуссий специалистов.

Спорадические случаи и очаги заболевания выявлены в странах Центральной и Южной Америки, Западной Африки и даже в Европе. Причем, в Сальвадоре и Чили возбудитель мелиоидоза признан как этиологический агент нозокомиальных и оппортунистических инфекций с неблагоприятным прогнозом.

Актуальность создания эффективных средств диагностики мелиоидоза определяется реальной угрозой их заноса на территорию России из эндемичных стран в связи со значительным ростом транспортных связей, возросшими грузо- и пассажиропотоками, расширением туристических поездок российских граждан в эндемичные регионы, привлечением иностранной рабочей силы и незаконной миграцией населения. Появление возбудителей так же возможно за счёт завоза больных животных, учитывая, что В.mallei и B.pseudomallei являются микробами с достаточно широким спектром патогенности, а число видов животных, способных болеть сапом и мелиоидозом, гораздо шире, чем это предполагалось ранее. Возбудитель мелиоидоза может быть завезен в Россию с почвой и водой при транспортировке экзотических животных и аквариумных рыбок, а также пищевых продуктов, контаминированных B.pseudomallei. Примером этого могут служить публикации об особенностях формирования вторичных очагов мелиоидоза во Франции, обусловленных завозом в зоопарк больной лошади Пржевальского. Способность к длительной бессимптомной персистенции возбудителя в организме являются дополнительными причинами расширения ареала инфекции в результате миграции людей и животных с латентной формой заболевания.

На сегодняшний день можно констатировать, что существующие методы обнаружения патогенных буркхольдерий оказываются недостаточно эффективными для экспресс-диагностики, а идентификация возбудителей мелиоидоза по-прежнему является трудоемкой задачей. Традиционная лабораторная диагностика, направленная на выделение чистой культуры возбудителей с последующей ее идентификацией, позволяет дать положительный ответ лишь через 36-48 ч. Серологические методики дают более быстрые результаты, но обладают относительно низкой чувствительностью и недостаточной специфичностью из-за возможных перекрёстных реакций с гетерологичными видами микроорганизмов и антигенной вариабельности штаммов. Кроме того, диагностическая ценность иммунологических методов имеет ограничения при выявлении патогенных бурк-хольдерий на ранних стадиях инфекционного процесса.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

Методы лабораторной диагностики лептоспироза

Agricultural animals. Methods of laboratory diagnostics of leptospirosis

Дата введения 1993-01-01

1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия

2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Комитета стандартизации и метрологии СССР от 27.12.91 N 2240

3. СРОК ПРОВЕРКИ - 1996 г.

5. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

Обозначение НТД, на который дана ссылка

2.2.2.1; 2.2.2.3; 2.2.2.4; 2.2.2.6

2.2.2.8; 2 2.2.9; 2.2.2.11

2.2.2.8; 2.2.2.9; 2.2.2.10; 2.2.2.11

2.2.2.8; 2.2.2.9; 2 2.2.10; 2.2.2.11

2.1.1.1; 2.2.2.4; 2.2.2.6; 2.2.2.8; 2.2.2.9; 2.2.2.10

2.2.2.2; 2.2.2.3; 2.2.2.4; 2.2.2.5; 2.2.2.6; 2.2.2.7; 2.2.2.8; 2.2.2.10; 2.2.2.13

Настоящий стандарт распространяется на методы лабораторной диагностики инфекционной болезни - лептоспироза, вызываемой возбудителем вида Leptospira interrogans.

Диагноз на лептоспироз устанавливают на основании эпизоотологических, эпидемиологических, клинических и патологоанатомических данных с обязательным подтверждением диагноза лабораторными исследованиями.

1. МЕТОД ОТБОРА ПРОБ

1.1. Материалом для исследований служит кровь, моча, органы и ткани, а также трупы мелких животных. От трупов крупных животных берут сердце, кусочки паранхиматозных органов, почку, транссудат из грудной и брюшной полостей, перикардиальную жидкость, мочевой пузырь с содержимым, спинномозговую жидкость.

Абортированный плод доставляют в лабораторию целиком или берут желудок с содержимым, сердце и паренхиматозные органы плода.

1.2. Кровь для серологического исследования берут в количестве 5-10 см не ранее чем через 5-7 сут после проявления клинических признаков болезни или через 90 сут - для крупного рогатого скота, 60 сут - для свиней и животных других видов после введения вакцины. Кровь для бактериологического исследования берут в период лихорадки на 1-7 сут болезни.

1.3. Мочу собирают при естественном мочеиспускании в чистые пробирки. У коров и свиноматок допускается брать мочу катетером.

Мочу микроскопируют непосредственно в хозяйствах.

1.4. Почку извлекают в невскрытой капсуле. Сердце, мочевой пузырь и желудок плода берут с содержимым, для чего накладывают лигатуры на соответствующие сосуды и сфинктеры. Каждый орган или кусочек органа заворачивают в целлофановый пакет.

1.5. Ликвор, транссудат, спинномозговую жидкость и другие жидкие субстраты насасывают стерильным шприцем или пипеткой в стерильные пробирки.

1.6. Пробами для гистологического исследования служат кусочки коркового слоя почек и печени объемом не более 1 см, консервированные 10%-ным раствором формалина.

1.7. Пробы патологического материала должны быть исследованы с момента взятия в течение 6 ч в летнее время и 10-12 ч при хранении его в охлажденном состоянии.

1.8. Микроскопия мочи должна быть закончена при температуре: 30-40 °С в течение 3 ч, 25-30 °С - 4-5 ч, 20-25 °С - 6-8 ч, 16-20 °С - 10-12 ч с момента взятия.

1.9. Взятые пробы помещают в ящик, опечатывают и направляют в лабораторию с нарочным (курьером).

В сопроводительном документе к пробам патологического материала указывают время гибели животного или время взятия проб при жизни.

2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Серологический метод

Метод основан на обнаружении специфических антител в крови животных реакцией микроагглютинации (РМА) и реакцией иммуноадсорбции (РИА).

2.1.1. Реакция микроагглютинации

2.1.1.1. Аппаратура, материалы, реактивы

Центрифуга со скоростью вращения не менее 10000 об/мин.

Микроскоп биологический по ГОСТ 8074.

Конденсор темного поля.

Осветитель с точечной лампой.

Пластинки с лунками или пробирки Флоринского.

Пипетки градуированные вместимостью 1, 2, 5 и 10 см по ГОСТ 20292*.

* На территории Российской Федерации действуют ГОСТ 29169-91, ГОСТ 29227-91-ГОСТ 29229-91, ГОСТ 29251-91-ГОСТ 29253-91. - Примечание изготовителя базы данных.

Натрий хлористый х.ч. по ГОСТ 4233 или ч.д.а. 0,85%-ный раствор в дистиллированной воде. Раствор разливают во флаконы или бактериологические пробирки и стерилизуют в автоклаве при температуре 120 °С в течение 30 мин.

Читайте также: