Окраска мазков по грамму на сибирскую язву

Обновлено: 26.04.2024

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Порядок организации и проведения лабораторной диагностики сибирской язвы для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней

Дата введения: с момента утверждения

1. Разработаны Федеральным казенным учреждением здравоохранения "Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт" Роспотребнадзора (А.Н.Куличенко, Е.И.Еременко, А.Г.Рязанова, О.В.Малецкая, Н.П.Буравцева, О.И.Цыганкова, Т.В.Таран, Е.А.Цыганкова, Т.М.Головинская); Федеральным казенным учреждением здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Роспотребнадзора: (В.В.Кутырев, С.А.Щербакова, Ю.А.Попов, Н.А.Осина, И.Н.Шарова, Е.С.Казакова, Е.А.Плотникова, В.Е.Куклев, С.А.Портенко); Федеральным казенным учреждением здравоохранения "Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока" Роспотребнадзора (С.В.Балахонов, Т.И.Иннокентьева, З.Ф.Дугаржапова, А.В.Родзиковский, Е.В.Кравец); Федеральным казенным учреждением здравоохранения "Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт" Роспотребнадзора (Ю.М.Ломов, Н.Р.Телесманич, В.И.Прометной, С.Ю.Водяницкая, Н.Л.Пичурина, О.С.Бурлакова); Федеральным казенным учреждением здравоохранения "Противочумный центр" Роспотребнадзора (В.Е.Безсмертный, С.М.Иванова); Федеральным бюджетным учреждением здравоохранения "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора (А.И.Верещагин, М.В.Зароченцев, В.В.Мордвинова); Федеральным бюджетным учреждением науки "Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии" Роспотребнадзора (И.А.Дятлов, Л.И.Маринин, С.Ф.Бикетов, А.Е.Хлынцева, М.В.Храмов, А.И.Борзилов); Федеральным государственным бюджетным учреждением "ГИСК им. Л.А.Тарасевича" Минздравсоцразвития России (И.В.Борисевич, Л.В.Саяпина).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 2.06.2011 N 1).

3 Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 14 июля 2011 г. и введены в действие с 14 июля 2011 г.

4. Введены впервые.

1. Область применения

1.1. Настоящие методические указания определяют порядок организации и проведения лабораторной диагностики сибирской язвы для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней, формы их взаимодействия, номенклатуру и объем исследования, требования к лабораториям, специалистам и персоналу, участвующим в выполнении исследований, материально-техническому обеспечению исследований, биологической безопасности проведения работ.

1.2. Настоящие методические указания предназначены для органов и учреждений, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор, лечебно-профилактических и противочумных учреждений.

2. Нормативные ссылки

* Утратило силу с 1 мая 2012 года на основании постановления Правительства Российской Федерации от 16 апреля 2012 года N 317. - Примечание изготовителя базы данных.

2.6. СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности".

2.7. СанПиН 2.1.7.2790-10 "Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами".

2.8. СанПиН 2.1.3.2630-10 "Санитарно-эпидемиологические требования к организациям, осуществляющим медицинскую деятельность".

2.9. СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)".

2.12. СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".

2.14. СП 3.1.7.2629-10 "Профилактика сибирской язвы".

2.16. МУ 4.2.1890-04 "Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам".

2.17. МУ 3.3.2.2124-06 "Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии".

2.18. МУК 4.2.2316-08 "Методы контроля бактериологических питательных сред".

2.19. МУК 4.2.2413-08 "Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы".

2.20. МУ 1.3.2569-09 "Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности".

2.21. МУ 4.2.2495-09 "Определение чувствительности возбудителей опасных бактериальных инфекций (чумы, сибирской язвы, холеры, туляремии, бруцеллеза, сапа и мелиоидоза) к антибактериальным препаратам".

2.22. ГОСТ 21237-75 "Мясо. Методы бактериологического анализа".

2.23. ГОСТ 9792-73 "Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц. Правила приемки и методы отбора проб".

* На территории Российской Федерации документ не действует. Действует ГОСТ Р 54004-2010. - Примечание изготовителя базы данных.

2.25. ГОСТ Р 51447-99 "Мясо и мясные продукты. Методы отбора проб".

* Вероятно ошибка оригинала. Следует читать: ГОСТ Р 52675-2006. - Примечание изготовителя базы данных.

2.30. Рекомендации по правилам перевозки инфекционных материалов 2009-2010. WHO/HSE/EPR/2008.10.

3. Перечень сокращений

МПБ - мясопептонный бульон.

МПА - мясопептонный агар.

ОФ - отечный фактор.

ПА - протективный антиген.

ЛФ - летальный фактор.

ЛПУ - лечебно-профилактическое учреждение.

СП - санитарные правила.

СанПиН - санитарно-эпидемиологические правила и нормативы.

ООИ - особо опасные инфекции.

МУ - методические указания.

МУК - методические указания по контролю.

ПБА - патогенный биологический агент.

МФА - метод флуоресцирующих антител.

ИФА - иммуноферментный анализ.

ПЦР - полимеразная цепная реакция.

РНГА - реакция непрямой гемагглютинации.

MLVA - мультилокусный анализ областей генома с вариабельным числом тандемных повторов (VNTR).

РЛА - реакция латекс-агглютинации.

ИХ-тест - иммунохроматографический тест.

ЦНС - центральная нервная система.

4. Общие положения

Характеристика болезни и возбудителя сибирской язвы

Сибирская язва (Anthrax) - острая зоонозная особо опасная бактериальная инфекционная болезнь, протекающая в локализованной и генерализованной формах. Характеризуется поражением кожи (везикула, отек, карбункул с черно-бурым струпом), лимфатических узлов и других тканей (развиваются кишечная форма, легочная и др.) и тяжелой интоксикацией. В зависимости от путей заражения у человека развивается кожная или висцеральная (кишечная, легочная) формы сибирской язвы. Любая из этих форм может приводить к развитию сепсиса и осложняться сибиреязвенным менингитом (генерализованная форма).

В соответствии с Международной статистической классификацией болезней и проблем, связанных со здоровьем (Десятый пересмотр. - Женева, 2003. МКБ-10) сибирская язва (А22) относится к группе некоторых бактериальных зоонозов А20-А28. Различают следующие клинические формы:

А22.0 - кожная форма сибирской язвы;

А22.1 - легочная форма сибирской язвы;

А22.2 - желудочно-кишечная форма сибирской язвы;

А22.7 - сибиреязвенная септицемия;

А22.8 - другие формы сибирской язвы;

А22.9 - сибирская язва неуточненная.

Источниками инфекции являются домашние и дикие травоядные животные (крупный и мелкий рогатый скот, лошади, ослы, олени, верблюды, свиньи и др.), нередко и плотоядные животные. Резервуаром возбудителя инфекции служит почва. Больной человек эпидемиологической опасности не представляет (кроме больных лёгочной формой).

Механизм передачи возбудителя преимущественно контактный. Аспирационный и трансмиссивный механизмы передачи возбудителя реализуются воздушно-пылевым и инокуляционным путями передачи. Заражения пищевым путем происходят при употреблении термически необработанных мясопродуктов, содержащих достаточную инфицирующую дозу возбудителя. Значительную эпизоотическую и эпидемическую опасность представляют сибиреязвенные скотомогильники, как естественные резервуары сибиреязвенной инфекции.

Возникновение заболевания возможно при нарушениях режима биологической безопасности в лабораториях и использовании сибиреязвенного микроба в качестве биологического агента во время террористических актов.

В структуре заболеваемости выделяют три эпидемиологических типа: профессионально-сельскохозяйственный (встречается у пастухов, животноводов и ветеринаров), профессионально-индустриальный (наблюдается у лиц, работающих на кожевенных, щетиношерстяных, шерстеобрабатывающих производствах) и бытовой (возможен при ношении меховой и кожаной одежды из инфицированных материалов, использовании инфицированных кисточек для бритья, обработке шерсти в домашних условиях).

Выявление возбудителей Сибирской язвы.
Сущность метода выявления бацилл сибирской язвы заключается в определении их характерной морфологии в мазках-отпечатках, типичного роста на питательных средах и установлении патогенности путем заражения лабораторных животных.
Бациллы сибирской язвы обнаруживают в три последовательных этапа: бактериоскопия мазков из патологического материала; получение и изучение свойств чистой культуры на питательных средах; биологическая проба на лабораторных животных и при необходимости серологическое исследование. В случае доставки загнившего материала исследование проводят только по реакции преципитации.

Микроскопия мазков.
При бактериоскопии мазков из патологического материала обращают внимание на форму и расположение отдельных микробов и наличие капсул. Характерный вид сибиреязвенных палочек и обилие их в мазке нередко позволяют поставить диагноз по результатам бактерйоскопического исследования.
Микроскопическому исследованию подвергают мазки из крови уха или другого материала. Для приготовления мазков из крови уха его рекомендуется приколоть шилом с двух противоположных сторон к доске, застеленной полиэтиленовой пленкой или пергаментом; затем отпрепарировать кожу, подрезать несколько кровеносных сосудов у основания уха и, проведя вдоль по сосуду скальпелем, выдавить каплю крови, которую этим же скальпелем наносят на предметное стекло для мазка и на поверхность агаровой среды у одного края чашки. Подсушенные мазки фиксируют на пламени или химическим методом, затем окрашивают по Граму и на капсулы — по Ребигеру, Ольту, 0,1 %-ным спирто-водным раствором метиленовой сини или другим способом.
В мазках, окрашенных по Граму, возбудитель сибирской язвы — прямая грамположительная палочка. Палочки располагаются короткими цепочками или попарно, концы их, обращенные друг к другу, резко обрублены, свободные концы обычно закруглены. В отдельных случаях в мазках (чаще от свиней) форма микробов сибирской язвы может быть нехарактерна: они имеют вид коротких, толстых, изогнутых или зернистых палочек со вздутием посередине или на концах.
В мазках из свежего патологического материала сибиреязвенные палочки окружены капсулой; в мазках из несвежего материала микробы нередко теряют характерную морфологию — они могут быть несколько увеличены, концы закруглены или наоборот - бациллы и слабоокрашенные капсулы как бы йзъедены.
По результатам микроскопического исследования немедленно дают предварительный ответ.

Культурально-биохимические свойства.
Посевы из крови уха или другого патологического материала проводят не только на МПА в пробирках или чашках, но и на МПБ и выдерживают в термостате при температуре 36—37 °С в течение 18—24 ч. При отсутствии роста посевы оставляют в термостате еще 2 сут.
На МПА микроб образует плоские матово-серые шероховатые (R-форма) колонии с извилистым краем и локонообразными отростками, напоминающими под малым увеличением микроскопа "голову медузы", "львиную гриву". Встречаются и атипичные колонии с менее выраженной шероховатостью и без отростков. Молодые колонии имеют вязкую консистенцию.
МПБ после суточного роста сибиреязвенных микробов остается прозрачным, на дне образуется рыхлый из крупных хлопьев осадок в виде комка ваты. При встряхивании пробирок бульон не мутнеет, осадок, разбивается на мелкие хлопья. Иногда в МПБ возбудитель сибирской язвы дает диффузный рост (легкое помутнение), при встряхивании образуются муаровые волны.
Из бульонной культуры делают мазки, окрашивают по Граму и исследуют под микроскопом. В мазках из типичной бульонной культуры обнаруживают длинные цепочки палочек, в то время как из бульонной культуры с диффузным ростом — отдельные или попарно расположенные палочки и редко — короткие цепочки.
Дифференциацию возбудителя сибирской язвы от сапрофитных бацилл, которые морфологически сходны, проводят по наличию капсул (в мазках из исходного материала или павших зараженных животных). В сомнительных случаях определяют подвижность посевом в полужидкий мясо-пептонный агар, гемолитические свойства на кровяных средах, характер роста на мясо-пептонном желатине, проводят люминесцентную микроскопию, фаготипирование, тест "жемчужного ожерелья", а также заражают лабораторных животных (см.табл.).
Дифференцирующие признаки микробов рода Bacillus

Исследование на подвижность проводят микроскопическим методом раздавленной или висячей капли или лучше путем посева исследуемой культуры уколом в столбик полужидкого агара (0,2—0,3%-ного). Посев ставят на 24 ч в термостат. Рост наблюдается по уколу, возбудитель сибирской язйы неподвижен.
Гемолитическую активность проверяют при посеве исследуемой культуры на кровяной агар или бульон. Результаты учитывают через 16—20 ч инкубации посевов в термостате. Возбудитель сибирской язвы гемолитической активностью не обладает, в то время как большинство сапрофитных спорообразующих бацилл дают бетта-гемолиз на агаре и вызывают гемолиз бульона с кровью.
Люминесцентную микроскопию проводят с использованием флуоресцирующих сибиреязвенных сывороток ”ОКВС” в соответствии с наставлением по их применению.
Фаготипирование проводят в соответствии с наставлением по применению фагов одним из следующих методов: стекающей капли, пробирочным или микрометодом с использованием сибиреязвенных бактериофагов "Гамма-МВА" или "К" ВИЭВ.

Тест "жемчужного ожерелья".
Перед постановкой пробы готовят 3 пробирки по 10 см3 (или 3 колбы по 100 см3) МПА, в две из которых стерильно вносят пенициллин из расчета 0,5 и 0,05 ЕД на 1 см3 среды, третья остается контрольной. Агар разливают в чашки Петри и после застывания пробиркой с ровными краями делают насечки среды или вырезают пластинки 1,5 х 1,5 см, которые переносят на предметные стекла, помещенные в чашки Петри. На каждую пластийку делают высев 3-часовой бульонной культуры. Чашки закрывают крышками и помещают в термостат при 37 °С на 3 ч, а затем просматривают под микроскопом с сухой (объектив х 40) и иммерсионной системами, предварительно накрыв зону роста покровным стеклом. Сибиреязвенные микробы на МПА с пенициллином принимают шаровидную форму, а их цепочки имеют вид "жемчужного ожерелья". Спорообразующие сапрофитные аэробные микробы вырастают в виде обычных форм. На контрольном агаре сибиреязвенные микробы образуют длинные цепочки, состоящие из типичных палочек.
Постановка теста указанным методом чрезвычайно неудобна и создает трудности в соблюдении мер безопасности при работе с патогенными культурами.
В соответствии с действующим в настоящее время ГОСТ 21237—75 постановку теста "жемчужное ожерелье" можно проводить непосредственно в 3 пробирках со скошенным мясо-пептонным агаром: в первой пробирке содержится 0,5, а во второй — 0,05 ЕД пенициллина в 1 см3, третья пробирка остается контрольной (без антибиотика). В каждую пробирку вносят по 0,25 см3 3-часовой бульонной тест-культуры. Посевы выдерживают в термостате при температуре 37 °С в наклонном положении (на деревянных рейках или стеклянных трубках). Через 3 ч петлей или пастеровской пипеткой из конденсационной жидкости берут материал и готовят мазки на предметных стеклах, высушивают их на воздухе, фиксируют спирто-эфирной смесью в течение 15 мин и окрашивают по Граму, метиленовой синью или водным раствором фуксина.
При положительной реакции теста "жемчужное ожерелье" бациллы сибирской язвы образуют цепочки из шарообразных форм, имеющих сходство с ожерельем из бус. Сапрофитные споровые аэробы, как правило, дают отрицательный результат при постановке этого теста, т. е. имеют форму палочек.
Заключительный учет теста в случаях отрицательных результатов рекомендуется проводить через 6 ч после инкубации посевов в термостате при температуре 37 °С.

Постановка реакции преципитации.
Перед постановкой реакции свежий материал предварительно выдерживают в термостате в течение 18 — 24 ч. Несвежий материал экстрагируют без выдерживания в термостате.
Экстрагирование проводят двумя способами: горячим или холодным. При этом следует учитывать, что экстракты, полученные горячим способом, беднее преципитиногенами, чем при холодном.
Горячий способ: кусочки исследуемого материала (1—2 г) помещают в пробирку или колбу, заливают физиологическим раствором в соотношении 1 : 10 и кипятят в течение 30—40 мин.
Холодный способ: кусочки материала (1 —2 г) растирают в ступке с песком, переносят в колбу или баночку, заливают карбонизированным (0,5 %-ным) физиологическим раствором в соотношении 1 : 10 и оставляют на 16 —18 ч при комнатной температуре.
Полученные экстракты фильтруют через асбестовую нейтральную вату до полной прозрачности, причем первые капли фильтрата удаляют.
Реакцию преципитации ставят путем наслаивания или по дотаивания. При наслаивании в узкую пробирку наливают 0,2—0,3 см3 прозрачной преципитирующей сибиреязвенной сыворотки, затем осторожно наслаивают равное количество экстракта так, чтобы между компонентами была ясно выраженная граница (тонкая прямая линия).
При подслаивании в пробирку сначала вносят 0,2—0,3 см.куб. экстракта, затем под него осторожно пастеровской пипеткой подслаивают равное количество преципитирующей сыворотки.
Одновременно ставят контроли: заведомо сибиреязвенный антиген с сибиреязвенной преципитирующей сывороткой; нормальная сыворотка с исследуемым экстрактом и преципитирующая сыворотка с физиологическим раствором. В первом контроле на границе антигена и сыворотки должно образоваться белое кольцо, во втором и третьем — отсутствие кольца,
Реакцию считают положительной, если через 3—8 мин появляется кольцо преципитации; сомнительной, если оно образуется через 10 — 15 мин, и отрицательней — при отсутствии на границе между компонентами кольца.

Постановка биологической пробы.
Заражение лабораторных животных исходным материалом является обязательным и проводится в день поступления материала. Исследуемый патологический материал, суспендированный в небольшом объеме физиологического раствора, вводят двум белым мышам в дозе 0,1 -0,2 см3 (по ГОСТу - 0,5 см3) подкожно в заднюю часть спины или двум морским свинкам в дозе 0,5 — 1 см3 подкожно в область живота. Гибель зараженных животных наступает через 1 -3 сут, иногда позже. Наблюдение за подопытными животными ведут 10 дней.
При исследовании материала от свиней (подчелюстные лимфатические узлы) подопытных животных заражают только полученной чистой культурой,
В случае гибели лабораторных животных их вскрывают, делают мазки и посевы из крови сердца, селезенки, печени, инфильтрата на месте инъекции исследуемого материала.
Срок бактериологического исследования мяса вынужденно убитых животных в ветеринарной лаборатории не должен превышать 3 дней, а при постановке биологической пробы — 10 дней (Инструкция о мероприятиях против сибирской язвы от 5 июня 1981 г. с дополнениями 12 ноября 1982 г.).

Учет результатов исследования.
Диагноз на сибирскую язву считается установленным при получении одного из следующих показателей:
выделение из патологического материала культуры со свойствами, характерными для возбудителя сибирской язвы, и гибель хотя бы одного лабораторного животного из двух зараженных исходным материалом или полученной культурой с последующим выделением ее из органов павшего животного;
отсутствйе в посевах из исходного материала роста культуры, но гибели хотя бы одного лабораторного животного из двух зараженных и выделение из его органов культуры со свойствами, характерными для возбудителя сибирской язвы;
получение положительных результатов методом иммунофлуоресценции с адсорбированной сибиреязвенной сьюороткой и обнаружение капсульных бацилл в мазках из исходного патологического материала;
положительная реакция преципитации при исследовании загнившего патологического материала.

Ветеринарно-санитарная оценка.
При установлении бактериоскопическим исследованием сибирской язвы тушу со всеми органами и шкурой, не ожидая результатов бактериологического исследования, направляют на уничтожение сжиганием при соблюдении установленных ветеринарно-санитарных правил.
Все обезличенные продукты (ноги, уши, вымя, кровь и др.), полученные от убоя других животных, смешанные с продуктами убоя от сибиреязвенного животного сжигают.
Помещение, где проведен убой животного, оборудование, инвентарь подлежат дезинфекции; рабочие проходят санитарную обработку по указанию и под наблюдением медико-санитарного надзора.
Другие туши и продукты убоя, подозреваемые в обсеменении бациллами сибирской язвы по ходу технологического процесса, немедленно подвергают обеззараживанию проваркой, но не позднее 6 ч с момента убоя, в открытых котлах в течение 3 ч с начала закипания, а в закрытых котлах при температуре 112 °С и давлении 0,05 МПа — в течение 2,5 ч. Если отсутствует возможность провести обеззараживание в указанный срок, туши изолируют при температуре не выше 10 °С, а затем направляют на обеззараживание, но не позднее 48 ч с момента убоя. В том случае, когда это выполнить нельзя, туши и продукты убоя, подлежащие обеззараживанию, направляют на утилизацию или сжигание.
При отрицательном результате бактериоскопического исследования тушу, подозреваемую в заражении сибирской язвой, изолируют до получения заключения о результатах бактериологического исследования. После подтверждения диагноза, а также в случае сомнительного результата бактериоскопического исследования и отсутствия возможности изолировать тушу, подозреваемую в заражении сибирской язвой, до установления бактериологического диагноза, тушу животного и зараженные органы утилизируют, после чего проводят дезинфекцию помещения.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы

1. РАЗРАБОТАНЫ: Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (С.Д.Кривуля, Н.Д.Пакскина); ФГУЗ Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (Е.И.Еременко, А.Н.Куличенко, Н.П.Буравцева, О.И.Цыганкова, А.Г.Рязанова, Е.А.Цыганкова, Л.Ю.Аксенова); ФГУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Роспотребнадзора (Н.А.Осина, И.Н.Шарова, В.Е.Куклев, Е.А.Плотникова, Т.В.Бугоркова); ФГУЗ Иркутский научно-исследовательский институт Сибири и Дальнего Востока Роспотребнадзора (А.В.Родзиковский, З.Ф.Дугаржапова); ФГУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (А.В.Липницкий, А.М.Барков, И.А.Баркова, В.В.Алексеев); ФГУЗ Противочумный центр Роспотребнадзора (В.Е.Безсмертный, С.М.Иванова, В.А.Подледнев); ФГУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора (Л.И.Маринин, И.А.Дятлов, Н.А.Шишкова, А.Н.Мокриевич); ФГУН Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора (Г.А.Шипулин, С.Б.Яцышина); ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии (Ю.О.Селянинов, И.Ю.Егорова).

2. РЕКОМЕНДОВАНЫ к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 3 июля 2008 г. N 2).

3. УТВЕРЖДЕНЫ И ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 29 июля 2008 г.

4. Введены в действие с 1 сентября 2008 г.

5. С введением в действие данных методических указаний при осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора методические указания "Лабораторная диагностика сибирской язвы у животных и людей, обнаружение возбудителя в сырье животного происхождения и объектах внешней среды", утвержденные 01.09.86 начальником Главного управления ветеринарии Госагропромкомитета СССР и начальником Главного управления карантинных инфекций Минздрава СССР, применению не подлежат.

1. Область применения

1.1. Настоящие методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы специалистами других заинтересованных организаций.

1.2. В методических указаниях определены порядок забора, хранения, транспортирования и выполнения лабораторных исследований биологического материала от больных и умерших людей, животных с подозрением на сибирскую язву, а также материала из объектов окружающей среды, подозрительного на контаминацию возбудителем данного заболевания.

ВНИИВВиМ - Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии;

ГИСК - Государственный институт стандартизации и контроля;

ГКИ - Государственный контрольный институт;

ДДМ - диско-диффузионный метод;

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

ИФА - иммуноферментный анализ;

ЛФ - летальный фактор;

МПА - мясопептонный агар;

МПБ - мясопептонный бульон;

МПК - минимальная подавляющая концентрация;

МФА - метод флуоресцирующих антител;

ОФ - отечный фактор;

ПА - протективный антиген;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

РНГА - реакция непрямой гемагглютинации;

РТНГА - реакция торможения непрямой гемагглютинации;

"СОПЭК" - среда для сочетанного определения продукции экзотоксина и капсулы;

ЭДТА - этилендиаминтетераацетата динатриевая соль;

DCL - абсолютная летальная доза;

LD - половинная летальная доза;

MLVA - метод анализа областей генома с вариабельным числом тандемных повторов.

2. Нормативные и методические ссылки

2.1. Санитарно-эпидемиологические правила "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности). СП 1.3.1285-03".

2.2. Санитарные правила "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности. СП 1.2.036-95".

2.3. "Сибирская язва. СП 3.1.089-96, ВП 13.3.1320-96".

2.4. Практическое руководство "Специфическая индикация патогенных биологических агентов", 2006.

2.5. Методические указания "Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности. МУ 1.3.1794-03".

2.6. Методические указания "Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. МУК 4.2.1890-04".

2.7. Методические указания "Обеззараживание биологического материала и объектов внешней среды, зараженных бактериями I-IV групп патогенности, при исследованиях методом ПЦР. МУ 3.5.5.1034-01".

2.8. Методические рекомендации по использованию этилового спирта с 3% перекиси водорода для фиксации на предметном стекле возбудителя сибирской язвы, 1984.

2.9. Методические рекомендации по отбору проб почвы для бактериологического исследования на наличие возбудителей сибирской язвы и актиномицетов-антагонистов, 1984.

2.10. Методические рекомендации "Использование 0,05-0,1% раствора Твина-80, как разводящей жидкости, для определения концентрации спор сибиреязвенного микроба", 1986.

2.11. Методические рекомендации "Определение гемолитической активности у сибиреязвенного микроба", 1989.

2.12. Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные положения, Госкомсанэпиднадзор РФ, 1995.

2.13. Методические рекомендации "Забор, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦР-диагностики". МЗ РФ, ЦНИИЭ, 2004.

2.14. Методические рекомендации "Взаимодействие органов управления, учреждений и специализированных формирований при ликвидации последствий террористических актов с применением патогенных биологических агентов и опасных химических веществ. МР 0100/0556-04-34", 2005.

2.15. Инструкция по определению чувствительности возбудителей опасных инфекционных заболеваний к антибиотикам и химиопрепаратам, 1990.

3. Общие положения

Сибирская язва (Anthrax) - это острое инфекционное заболевание животных и человека, относящееся к группе особо опасных инфекций. Основным источником инфекции для человека при сибирской язве являются больные травоядные животные. Они в течение всего периода болезни выделяют возбудитель с мочой, испражнениями и слюной в почву, которая становится его дополнительным резервуаром. Заражение животных происходит главным образом алиментарным (через корм и питьевую воду, инфицированные спорами), реже - трансмиссивным (через укусы кровососущих насекомых) и воздушным путями.

В подавляющем большинстве случаев человек заражается сибирской язвой при разделке туш вынужденно убитого скота; употреблении в пищу полученных от него мяса или мясных продуктов; непосредственном контакте с трупами погибших животных, шерстью, шкурами, кожей, щетиной, зараженными возбудителем; уходе за больными животными. Возможно также заражение через укусы кровососущих насекомых, контаминированную почву и при вдыхании содержащего споры аэрозоля.

В зависимости от путей заражения у человека развивается кожная или висцеральная (кишечная, легочная) формы сибирской язвы. Любая из этих форм может приводить к развитию сепсиса и осложняться сибиреязвенным менингитом (генерализованная форма).

Возбудитель этой инфекции в 2001 г. в США был использован как средство биологического терроризма, что привело к человеческим жертвам и возникновению паники среди населения. Поэтому своевременная и точная лабораторная диагностика сибирской язвы приобретает сейчас особое значение.

Диагностика сибирской язвы у человека и животных основывается на эпизоотологических, эпидемиологических, клинических, лабораторных и патологоанатомических данных. Лабораторные исследования направлены на обнаружение и идентификацию возбудителя сибирской язвы, выявление специфических антител и аллергической перестройки в организме больных людей.

3.1. Краткие сведения о возбудителе сибирской язвы

Возбудитель сибирской язвы - В. anthracis, относится к семейству спорообразующих микроорганизмов Васillасеае, роду Bacillus. В роду Bacillus, насчитывающем 101 вид, выделяют группу видов Bacillus cereus, в которую входят близкородственные В. cereus, В. anthracis, В. thuringiensis, В. mycoides и недавно признанный новым видом психротолерантный микроб В. weichenstephanensis.

Морфология В. anthracis. В зависимости от стадии развития культуры, а также условий окружающей среды, возбудитель сибирской язвы может существовать в трех формах - в виде бескапсульных вегетативных палочек (бацилл), инкапсулированных палочек и спор.

Процесс спорообразования состоит из четырех основных стадий: подготовительной, образования проспор, готовых спор и зрелых спор. Спорогенез зависит от особенностей штамма, наличия тех или иных питательных веществ, рН среды, температуры выращивания, влажности и др.

При попадании спор в благоприятные условия (влажность, аэрация, температура, наличие необходимых питательных веществ) из них быстро образуются вегетативные клетки. Время прорастания спор может составлять несколько часов и зависит от температуры (оптимум - 37 °С) и других факторов.

Культурально-биохимические свойства. Сибиреязвенный микроб - факультативный анаэроб, оптимальная температура роста 34-37 °С, оптимальное значение рН 7,2-7,8, неподвижный, хорошо растет на обычных питательных средах - МПБ и МПА. Характер роста в совокупности с другими признаками учитывается при идентификации.

При посевах на чашки Петри с питательным агаром после суточной инкубации при (36±1) °С микроб формирует крупные шероховатые сухие матовые колонии в R-форме, с "шагреневой" поверхностью, с неровными краями и отходящими от них волнистыми отростками. При малом увеличении под микроскопом (7x10) они напоминают локоны волос или львиную гриву (прилож.7, рис.4).

Характерный придонный рост сибиреязвенного микроба в МПБ или 1%-й пептонной воде похож на комочек ваты, с трудом разбивающийся при встряхивании, при этом бульон остается прозрачным (прилож.7, рис.5).

Сибиреязвенный микроб способен разлагать с образованием кислоты без газа глюкозу, мальтозу, сахарозу и некоторые другие сахара, но не разлагает лактозу. Обладает относительно низкой протеолитической активностью и при посеве уколом в столбик 10-12%-го мясопептонного желатина и выращивании при 22 °С рост микроба напоминает елочку, опрокинутую верхушкой вниз; на 3-5 день желатин разжижается в виде воронки. Большинство сапрофитов полностью разжижает желатин в более короткие сроки. При росте на кровяном агаре с 3-5% дефибринированной крови барана через 20-24 ч гемолиз не наблюдается, в то время как многие сапрофиты дают быстрый гемолиз (через 12-18 ч при 37 °С). Большинство штаммов сибиреязвенного микроба не образует фермент лецитиназу. При росте на агаре с куриным желтком вокруг колоний не происходит помутнения среды в виде беловатой зоны, а при посеве на жидкую желточную среду желток не свертывается даже при 5-6-суточном инкубировании. Сапрофиты свертывают желток в течение 6-10 ч. Сибиреязвенный микроб, в отличие от сапрофитных бацилл, обладает низкой фосфатазной активностью и не способен разлагать фосфаты, добавляемые в питательную среду (тест на фосфатазу).

Большинство штаммов сибиреязвенного микроба чувствительны к пенициллину и при выращивании на МПА или МПБ в присутствии 0,5-0,05 ЕД/мл бензилпенициллина через 3 ч инкубирования образуют цепочки из шарообразных клеток - "жемчужное ожерелье" (прилож.7, рис.6).

До 95% штаммов сибиреязвенного микроба лизируется сибиреязвенными бактериофагами "Гамма", "К" и Fah-ВНИИВВиМ (прилож.7, рис.7).

Чувствительность к антибиотикам. Возбудитель сибирской язвы чувствителен к большинству антибиотиков - цефалоспоринам I поколения, тетрациклинам, рифампицинам, аминогликозидам и фторхинолонам. Пенициллин способен задерживать развитие сибиреязвенного микроба даже при низкой концентрации в питательной среде. К некоторым макролидам сибиреязвенный микроб умеренно устойчив, а к цефалоспоринам II-IV поколения устойчив.

Факторы вирулентности (агрессии). Возбудитель сибирской язвы обладает почти универсальной патогенностью для млекопитающих - человека и других приматов, сельскохозяйственных и диких животных, лабораторных животных.

Важнейшими факторами патогенности у микроба являются капсула и экзотоксины. Сибиреязвенный микроб образует их в инфицированном макроорганизме или при культивировании на искусственных питательных средах в специальных условиях.

Наличие капсулы необходимо на первых этапах инфекционного процесса для предотвращения опсонизации и фагоцитирования микроорганизма.

Типичные вирулентные штаммы В. anthracis образуют капсулу в организме больных людей и животных, а также при культивировании на 1%-м бикарбонатно-сывороточном агаре в атмосфере, содержащей 5-50% углекислоты или на жидкой среде ГКИ, содержащей 40% инактивированной бычьей (лошадиной) сыворотки и 60% раствора Хенкса. На 1%-м бикарбонатном агаре микроб растет в SM-форме в виде гладких, блестящих, влажных, слизистых колоний с неровными краями (прилож.7, рис.8).

Геном типичных штаммов сибиреязвенного микроба представлен одной кольцевой хромосомой и двумя плазмидами. Токсинообразование и капсулообразование детерминированы плазмидами рХО1 и рХО2. Отсутствие хотя бы одной из этих плазмид приводит к снижению вирулентности вплоть до полной ее утраты.

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ (обзор литературы)

Текст работы размещён без изображений и формул.
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF

Сибирская язва (лат. — Febris carbunculosa; англ. — Anthrax) — особо опасная, острая септическая болезнь животных многих видов и человека, вызываемая Bacillus anthracis, характеризующаяся септицемией, поражением кожи, кишечника, легких, лимфатических узлов и гибелью заболевших животных.

При подозрении на сибирскую язву вскрывать трупы запрещается. Для исследования от трупа животного берут кровь из надреза уха, периферических сосудов или отрезают и отсылают в лабораторию ухо. Если подозрение на сибирскую язву появилось в процессе вскрытия трупа, вскрытие тотчас же приостанавливают и для исследования посылают ухо, как указано ниже.

Подозрение на заболевание сибирской язвой свиней обычно возникает при наличии опухоли в области шеи. Если подозрение возникло во время вскрытия трупа свиньи, то дальнейшее вскрытие прекращают, а для бактериологического исследования берут участки отечной соединительной ткани, заглоточные лимфатические узлы.

Место надреза предварительно тщательно дезинфицируют и после взятия крови прижигают огнем или раскаленным металлическим предметом. Кровь наносят на стекло толстым слоем и высушивают на воздухе без дополнительной фиксации.

Из патологического материала для микроскопии готовят мазки, часть красят по Граму и обязательно на капсулы по Михину и Ольту. Обнаружение типичных по морфологии капсульных палочек является важным диагностическим признаком.

Окраска по Граму:

На фиксированный мазок накладывают небольшие кусочки фильтровальной бумаги и наливают основной краситель - генцианвиолет или метиленовый синий. Спустя 3-5 минут снимают окрашенную фильтровальную бумагу.

Заливают мазок раствором Люголя на 1 минуту. При этом препарат темнеет.

Сливают раствор Люголя и обрабатывают мазок чистым этиловым спиртом: капают несколько капель на препарат, спустя 20 секунд сливают. Промывают стекло с исследуемым препаратом дистиллированной водой.

Производят дополнительное окрашивание - докрашивают препарат фуксином. Спустя 1-2 минуты краситель смывают.

После просушивания фильтровальной бумагой на предметное стекло наносят масло и изучают мазок под микроскопом.

Микроскопическая картина: Грамположительные бактерии будут иметь сине-фиолетовый цвет, грамотрицательные - розовый или красный.

Техника окраска капсул по методу Ольта. Свежий горячий 2%-ный раствор сафранина наносят на фиксированный мазок, окрашивают 5-7 минут. Быстро промывают водой и высушивают. Тело клетки окрашивается в красно-кирпичный цвет, капсула в - желто-оранжевый.

Микроскопическая картина: капсулы — бледно-желтого, а бактерии —коричневого цвета.

Способ Михина. Фиксированный мазок (преимущественно из крови или селезеночной пульпы) окрашивают леффлеровской метиленовой синькой в течение 2—3 минут при подогревании (до появления паров). Затем краску быстро смывают водой и мазок высушивают фильтровальной бумагой. Лучше окрашивать старым раствором краски.

Микроскопическая картина (рисунок 1): капсулы — светло-розовые, бактерии —темно-синие.

Рисунок 1 - Окраска капсул по Михину

Культуральные свойства возбудителя. Сибиреязвенный микроб - факультативный анаэроб, оптимальная температура роста 34-37 °С, оптимальное значение рН 7,2-7,8, неподвижный, хорошо растет на обычных питательных средах - МПБ и МПА. Характер роста в совокупности с другими признаками учитывается при идентификации.

Рисунок 2 - Сибирская язва в МПБ

Рисунок 3 - Сибирская язва при посеве на мясопептонный желатин.

Диагноз на сибирскую язвы ставят на основании эпизоотологических данных, патолого-морфологических изменений и результатов лабораторного исследования.

Список используемой литературы

Андреев, Г.М. Справочник ветеринарного фельдшера [Текст]: учебное пособие / Г.М. Андреев, И.Д. Баранцев. – М.: Агропромиздат, 2015. – 354с.

Волина, Е.Г. Частная микробиология [Текст]: учебное пособие / Е.Г. Волина, Л.Е. Саруханова. - М.: РУДН, 2016. - 222 c

Макаров, В.В.Эпизоотологический метод исследования [Текст]: учебное пособие / В.В., Макаров, - М.:Колос, 2016. - 221 с.

Читайте также: