Определение стафилококков в воздухе

Обновлено: 18.04.2024

Диагностика и санация стафилококковых бактерионосителей

Главный государственный санитарный врач Российской Федерации - Первый заместитель Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 6 апреля 2001 г.

В методических рекомендациях представлена принципиально новая схема лабораторной диагностики стафилококковых бактерионосителей: цитоскопический метод выявления бактерионосителей стафилококков; питательная среда, позволяющая выделять стафилококки с персистентными свойствами; способ дифференциации стафилококковой микрофлоры, основанный на определении у штаммов, выделенных от бактерионосителей, факторов персистенции; предложены новые средства санации: масляный раствор витамина А, микроклимат спелеошахты, препарат электролизного водного раствора гипохлорита натрия.

Методические рекомендации предназначены для бактериологов, эпидемиологов, инфекционистов и врачей других специальностей.

Рекомендации разработаны сотрудниками Оренбургской государственной медицинской академии и Оренбургского института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН (член-корреспондент РАН и РАМН, профессор О.В.Бухарин; профессор Б.Я.Усвяцов, доктор биологических наук О.Л.Карташова, кандидат биологических наук С.Б.Киргизова, кандидат медицинских наук Л.И.Паршута).

Введение

Настоящие методические рекомендации посвящены проблеме профилактики стафилококкового бактерионосительства.

В этиологической структуре внутрибольничных инфекций, возникающих в акушерских и хирургических стационарах, большая роль принадлежит стафилококкам. Основным источником гнойной стафилококковой инфекции являются бактерионосители.

Работами сотрудников Оренбургской медицинской академии и Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН (1989-1997) установлено, что факторы персистенции стафилококков (антилизоцимная, антиинтерфероновая, антикомплементарная активности), направленные на инактивацию защитных механизмов хозяина, обеспечивают длительное переживание бактерий и создают основу резидентного бактерионосительства.

В представленных методических рекомендациях предлагаются новые подходы к профилактике стафилококковых инфекций, включающие: цитоскопический метод выявления бактерионосителей; питательную среду, позволяющую избирательно выделять стафилококки с персистентными свойствами; способ дифференциации резидентной и транзиторной стафилококковой микрофлоры, основанный на определении факторов персистенции у штаммов, выделенных от бактерионосителей.

Учитывая то обстоятельство, что подавление персистирующих свойств возбудителя затрудняет его паразитирование и тем самым повышает эффективность лекарственных воздействий, разработаны эффективные способы санации через снижение персистентных характеристик стафилококка.

Апробация предлагаемых методик в лечебно-профилактических учреждениях города показала их преимущество по сравнению с классическими методами профилактики.

Приоритетность способов диагностики и санации стафилококковых бактерионосителей подтверждена 2 авторскими свидетельствами и 4 патентами РФ на изобретения.

Диагностика стафилококковых бактерионосителей

Предлагаемый метод диагностики стафилококкового бактерионосительства отличается от существующих принципиально новой схемой исследования, включающей в себя: цитоскопический метод выявления бактерионосителей стафилококков; посев на питательную среду, позволяющую избирательно выделять стафилококки с персистентными свойствами (патент РФ N 2088668 "Питательная среда для выделения стафилококков с персистентными характеристиками"); способ дифференциации резидентной и транзиторной стафилококковой микрофлоры, основанный на определении факторов персистенции у штаммов, выделенных от бактерионосителей.

Цитоскопический метод

1. Реактивы, приборы, стекло

1.1. Среда-199 - официнальная среда для сохранения культуры клеток, производится в Свердловском НИИ вирусных инфекций.

1.2. Пробирки, ГОСТ 10515*, диаметр 15 мм, высота 145-150 мм

* На территории Российской Федерации документ не действует. Действует ГОСТ 25336-82, здесь и далее по тексту. - Примечание изготовителя базы данных.

1.4. Пастеровские пипетки

1.5. Предметное стекло

1.7. Ватный тампон, укрепленный на проволоке

2. Метод заключается в следующем:

2.1. Исследуемый материал (клетки эпителия слизистой оболочки переднего отдела носа) забирают с помощью стерильных ватных тампонов, смоченных в физиологическом растворе.

2.2. Тампон погружают в стерильную пробирку с 1,0 мл среды-199, встряхивают в течение 15 минут, тампон отжимают о стенки пробирки и удаляют.

2.3. Содержимое пробирки инкубируют в течение 1-2 часов при 37 °С в термостате (для сохранения жизнеспособности эпителиальных клеток и размножения в них стафилококков).

2.4. Верхний слой жидкости удаляют при помощи пастеровской пипетки, из осадка делают мазок на чистое, хорошо обезжиренное стекло (стекла обезжиривают при помощи смеси Никифорова).

2.5. После подсыхания мазок фиксируют метанолом в течение 5 минут и окрашивают одним из принятых методов (синькой Мансона, по Романовскому-Гимзе и др.).

2.6. При микроскопии мазков просматривают не менее 30 эпителиальных клеток (учитывают клетки с хорошо видимым ядром). В том случае, если обнаруживают 5 и более клеток, содержащих микроколонии стафилококков (группа из 4 и более кокков), то делают заключение о резидентном бактерионосительстве.

2.7. Для уточнения видовой характеристики стафилококков проводят бактериологическое исследование.

Бактериологический метод

А. Выделение чистой культуры стафилококка с персистентными свойствами путем посева на элективную питательную среду с фузидином

1. Реактивы, приборы, стекло

1.2. Натрий хлористый, ГОСТ 4233-77 (Михайловский завод химреактивов)

1.3. Куриное яйцо

1.4. Фузидин-натрий-натриевая соль фузидиевой кислоты (Пензенский комбинат медицинских препаратов "Биосинтез")

1.5. Питательный агар для культивирования микроорганизмов, сухой, код ОКП 93 8511 0197 ФС 42-188 ВС-88 (НПО "Питательные среды", Махачкала)

1.6. Физиологический раствор (9 г NaCl на 1 л воды)

1.7. Ватный тампон, укрепленный на проволоке

2. Элективная питательная среда (приготовление и посев)

2.1. Приготовление элективной среды: к 850 мл расплавленного мясо-пептонного агара добавляют 85 мл NaCl, затем среду стерилизуют, остужают до 50 градусов и добавляют 150 г желточной взвеси (желток асептически извлекают из яйца, взбалтывают с 200 мл изотонического раствора хлорида натрия). Перед заливкой чашек Петри во флаконы вносят 0,0002 г/л антибиотика фузидина. Все тщательно перемешивают, готовую среду разливают в стерильные чашки, подсушивают в термостате при 37 °С в течение 10 минут.

2.2. На поверхность среды засевают исследуемый материал (клетки эпителия слизистой оболочки носа), который забирают с помощью стерильных ватных тампонов, смоченных в физиологическом растворе, и учитывают результаты через 24 часа инкубации в термостате при 37 °С.

2.3. Рост колоний на данной среде позволяет отнести бактерионосителя к резидентному типу, т.к. имеет место преимущественный рост стафилококка с персистентными свойствами.

Б. Идентификация чистой культуры; определение резидентной стафилококковой микрофлоры

При дифференциации резидентной стафилококковой микрофлоры от транзиторной, кроме учета микробной обсемененности, рекомендуется определять у выделенных штаммов чувствительность к фузидину, а также персистентные свойства (антилизоцимная, антиинтерфероновая, антикомплементарная активности), как наиболее информативные биологические характеристики (А.с. СССР N 1449587 "Способ выявления возбудителя при гнойно-воспалительных процессах"; патент РФ N 2010860 "Способ определения антикомплементарной активности микроорганизмов").

1. Реактивы, приборы, стекло

1.2. Питательный агар для культивирования микроорганизмов, сухой, код ОКП 93 8511 0197 ФС 42-188 ВС-88 (НПО "Питательные среды", Махачкала)

1.3. Физиологический раствор (9 г NaCl г на 1 л воды)

1.4. Официнальные диски с фузидином (Минмедпром РФ объединение "Мосмедпрепарат" им. А.Я.Карпова)

1.5. Яичный лизоцим, регистрационный номер 76/506/6 (Фармацевтическое акционерное общество "Ферейн", Москва)

1.6. Культура Micrococcus luteus (N 211001 по каталогу ГИСК им. Л.А.Тарасевича)

1.7. Препарат человеческого лейкоцитарного интерферона (ПО "Иммунопрепарат", Уфа)

Воздух не является благоприятной средой для жизнедеятельности микроорганизмов. Однако, попадая в воздух, многие микроорганизмы способны какое-то время находиться в жизнеспособном состоянии. Среди них большая

группа патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Человек, болеющий инфекциями верхних дыхательных путей, выделяет микроорганизмы при разговоре, чихании, кашле и т.д. Через воздух передается группа заболеваний, которая так и называется — инфекции дыхательных путей с воздушно-капельным и воздушно-пылевым механизмами передачи. К таким инфекциям относятся грипп, корь, коклюш, скарлатина, дифтерия, натуральная оспа, легочная форма чумы, менингит, туберкулез, ветряная оспа, паротит и другие.

Задачами санитарно-микробиологического исследо-вания воздуха являются гигиеническая и эпидемиоло-гическая оценка воздушной среды, и, как следствие, разработка комплекса мероприятий, направленных на профилактику аэрогенной передачи возбудителей инфекционных болезней. Объектами санитарно-микробиологического исследования воздуха закрытых помещений являются: воздух больниц (операционные, отделение реанимации, родильные залы роддомов, и т.п.), детских садов, школ, поликлиник, аптек, производственных цехов и вспомогательных помещений на предприятиях различного профиля (пищевых, микробного синтеза и т.п.), а также мест массового скопления людей -кинотеатров, спортивных залов и т. д.

В последнее время внимание санитарных микробиологов привлекают крупные животноводческие комплексы и птицефабрики. Так было показано, что в воздухе птицефабрик содержится большое количество микроорганизмов — до 8 млн в 1 м3, которые, попадая в атмосферный воздух, переносятся потоками воздуха на большие расстояния; среди них микроорганизмы p.p. Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Bacillus, грибы рода Aspergillus и др.

Санитарно-микробиологическое исследование атмосферного воздуха в крупных городах проводится в плановом порядке и в некоторых случаях по эпидемическим показаниям. Исследование атмосферного воздуха в местах орошения земледельческих полей сточными водами методом дождевания проводится с целью обнаружения микроорганизмов p.p. Salmonella, Escherichia.

При оценке санитарного состояния закрытых помещений в зависимости от задач исследования определяется общая бактериальная обсемененность (общее микробное число), присутствие санитарно-показательных микроорганизмов (стафилококков, а- и р -гемолитических стрептококков), а также непосредственно патогенных микроорганизмов (в зависимости от характера помещений — микобактерий туберкулеза, коринебактерий дифтерии, дрожжей и мицелиальных грибов и пр.). Например, при исследовании воздуха медицинских учреждений определяется присутствие микроорганизмов, относящихся к условно-патогенной флоре (синегнойная палочка, бактерии рода Proteus и ряд других грамотрицательных палочек), вызывающих внутрибольничные инфекции.

При исследовании воздуха на предприятиях пищевого профиля, общественного питания помимо показателя общей обсемененности определяют те группы микроорганизмов, которые являются характерными возбудителями порчи данных видов продукции или могут встречаться в данном производственном помещении (дрожжи и грибы — в холодильниках, стафилококки — в цехе производства мороженого и т.п.).

На предприятиях микробиологической промышлен-ности, где в производстве используются актиномицеты, грибы, спорообразующие бациллы, дрожжеподобные грибы рода Candida и др., изучается присутствие и количественное содержание в воздухе микробов-продуцентов с целью предупреждения воздействия их на организм работающих людей (возможность заболевания и развития сенсибилизации).

При изучении присутствия микроорганизмов различных физиологических групп в воздухе используют питательные среды разного назначения (как стандартные, так и элективные или дифференциально-диагностические), в зависимости от цели исследования.

Методы отбора проб воздуха и приборы

Санитарно-микробиологическое исследование воздуха можно разделить на 4 этапа:

2) обработка, транспортировка, хранение проб, получение концентрата микроорганизмов (если необходимо);
3) бактериологический посев, культивирование микроорганизмов;

4) идентификация выделенной культуры.

Отбор проб, как и при исследовании любого объекта, является наиболее ответственным. Правильное взятие проб гарантирует точность исследования. В закрытых помещениях точки отбора проб устанавливаются из расчета на каждые 20 м2 площади — одна проба воздуха, по типу конверта: 4 точки по углам комнаты (на расстоянии 0,5 м от стен) и 5-я точка — в центре. Пробы воздуха забираются на высоте 1,6—1,8 м от пола — на уровне дыхания в жилых помещениях. Пробы необходимо отбирать днем (в период активной деятельности человека), после влажной уборки и проветривания помещения. Атмосферный воздух исследуют в жилой зоне на уровне 0,5—2 м от земли вблизи источников загрязнения, а также в зеленых зонах (парки, сады и т.д.) для оценки их влияния на микрофлору воздуха.

Следует обратить внимание на то, что при отборе проб воздуха во многих случаях происходит посев его на питательную среду.

Все методы отбора проб воздуха можно разделить на седиментационные и аспирационные.

Седиментационный — наиболее старый метод, широко распространен благодаря простоте и доступности, однако является неточным. Метод предложен Р. Кохом и заключается в способности микроорганизмов под действием силы тяжести и под влиянием движения воздуха (вместе с частицами пыли и капельками аэрозоля) оседать на поверхность питательной среды в открытые чашки Петри. Чашки устанавливаются в точках отбора на горизонтальной поверхности. При определении общей микробной обсемененности чашки с мясопептонным агаром оставляют открытыми на 5—10 мин или дольше в зависимости от степени предполагаемого бактериального загрязнения. Для выявления санитарно-показательных микробов применяют среду Гарро или Туржецкого (для обнаружения стрептококков), молочно-солевой или желточно-солевой агар (для определения стафилококков), суслоагар или среду Сабуро (для выявления дрожжей и грибов). При определении санитарно- показательных микроорганизмов чашки оставляют открытыми в течение 40—60 мин.

По окончании экспозиции все чашки закрывают, помещают в термостат на сутки для культивирования при температуре, оптимальной для развития выделяемого микроорганизма, затем (если этого требуют исследования) на 48 ч оставляют при комнатной температуре для образования пигмента пигментообразующими микроорганизмами.

Седиментационный метод имеет ряд недостатков: на поверхность среды оседают только грубодисперсные фракции аэрозоля; нередко колонии образуются не из единичной клетки, а из скопления микробов; на применяемых питательных средах вырастает только часть воздушной микрофлоры. К тому же этот метод совершенно непригоден при исследовании бактериальной загрязненности атмосферного воздуха.

Более совершенными методами являются аспирационные, основанные на принудительном осаждении микроорганизмов из воздуха на поверхность плотной питательной среды или в улавливающую жидкость (мясо-пептонный бульон, буферный раствор, изотонический раствор хлорида натрия и др.). В практике санитарной службы при аспирационном взятии проб используются аппарат Кротова, бактериоуловитель Речменского, прибор для отбора проб воздуха (ПОВ-1), пробоотборник аэрозольный бактериологический (ПАБ-1), бактериально-вирусный электропреципитатор (БВЭП-1), прибор Киктенко, приборы Андерсена, Дьяконова, МБ и др. Для исследования атмосферы могут быть использованы и мембранные фильтры № 4, через которые воздух просасывается с помощью аппарата Зейтца. Большое разнообразие приборов свидетельствует об отсутствии универсального аппарата и о большей или меньшей степени их несовершенства.

Прибор Кротова. В настоящее время этот прибор широко применяется при исследовании воздуха закрытых помещений и имеется в лабораториях СЭС.

Принцип работы аппарата Кротова (рис. 2) основан на том, что воздух, просасываемый через клиновидную щель в крышке аппарата, ударяется о поверхность питательной среды, при этом частицы пыли и аэрозоля прилипают к среде, а вместе с ними и микроорганизмы, находящиеся в воздухе. Чашку Петри с тонким слоем среды укрепляют на вращающемся столике аппарата, что обеспечивает равномерное распределение бактерий на ее поверхности. Работает аппарат от электросети. После отбора пробы с определенной экспозицией чашку вынимают, закрывают крышкой и помещают на 48 ч в термостат. Обычно отбор проб проводят со скоростью 20-25 л/мин в течение 5 мин.

Таким образом, определяется флора в 100-125 л воздуха. При обнаружении санитарно-показательных микроорганизмов объем исследуемого воздуха увеличивают до 250 л.

Приемник перед забором пробы воздуха заполняется 3—5 мл улавливающей жидкости (водой, мясопептонным бульоном, изотоническим раствором хлорида натрия).

Прибор Речменского работает по принципу пульверизатора: при прохождении воздуха через узкое отверстие воронки жидкость из приемника через капилляр в виде капелек поднимается в цилиндр. Капли жидкости еще больше дробятся, ударяясь о стеклянную лопаточку и стенки сосуда, создавая облачко из мелких капелек, на которых и адсорбируются находящиеся в воздухе микроорганизмы. Насыщенные бактериями капли жидкости стекают в приемник, а затем опять диспергируются, что обеспечивает максимальное улавливание бактерий из воздуха. При работе прибор помещают под углом 15—25°, что обеспечивает стекание улавливающей жидкости в приемник. Скорость отбора проб воздуха через аппарат Речменского — 10-20 л/мин. По окончании работы жидкость из приемника забирают стерильной пипеткой и засевают (по 0,2 мл) на поверхность плотных питательных сред. Преимуществом бактериоуловителя Речменского является высокая эффективность улавливания бактериальных аэрозолей. Недостатки прибора заключаются в трудности его изготовления, нестандартности получаемых аппаратов, их большой хрупкости и сравнительно низкой производительности.

Большим преимуществом являются серийный выпуск этого прибора (что дало возможность оснастить им лаборатории СЭС), его портативность, более высокая производительность (20—25 л/мин). Колба прибора, в которую помещается улавливающая жидкость, изготовляется из термостойкого плексигласа, капилляр из нержавеющей стали. В колбу вмонтирован пульверизатор, вызывающий диспергирование улавливающей жидкости при просасывании воздуха. Такое устройство дает возможность легко очищать и стерилизовать колбу с диспергирующим устройством простым кипячением в течение 30 мин (автоклавирование недопустимо, так как оно вызывает деформацию цилиндра).

Перед забором проб воздуха в колбу вносят 5-10 мл улавливающей жидкости (чаще всего мясопептонный бульон) и устанавливают ее под углом 10°, что обеспечивает естественное стекание жидкости после диспергирования. Воздух, проходя через колбу и пульверизатор, вызывает образование мелких капелек улавливающей жидкости, на которых оседают микроорганизмы. Прибор ПОВ-1 применяется для исследования воздуха закрытых помещений на общую микробную обсемененность, для обнаружения патогенных бактерий (например, микобактерий туберкулеза) и респираторных вирусов в воздухе больничных палат.

Пробоотборник аэрозольный бактериологический (ПАБ-1). Механизм действия ПАБ-1 основан на принципе электростатического осаждения частиц аэрозоля (а следовательно, и микроорганизмов) из воздуха при прохождении его через прибор, в котором эти частицы получают электрический заряд и осаждаются на электродах с противоположным знаком. На электродах для улавливания аэрозолей помещают в горизонтальном положении металлические поддоны с твердыми средами в чашках Петри или жидкой питательной средой (15—20 мл). Прибор переносной с большой производительностью 150-250 л/мин, т.е. за 1 ч можно отобрать 5—6 м3 воздуха. Его рекомендуют применять для исследования больших объемов воздуха при обнаружении условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, например, при выявлении в воздухе палат больниц возбудителей внутрибольничных инфекций (Pseudomonas aeruginosa. Staph, aureus и др.), определении сальмонелл и эшерихий в атмосферном воздухе в местах дождевания при орошении земледельческих полей сточными водами.

Бактериально-вирусный электропреципитатор (БВЭП-

1). Прибор основан на аспирационно-ионизационном принципе действия. БВЭП-1 состоит из осадительной камеры, в которую вмонтированы электроды: отрицательный в виде приводящей трубки, через которую поступает воздух (и частички аэрозоля соответственно заряжаются отрицательно), и положительный, на котором оседают бактерии.

При использовании любого из перечисленных приборов получаемые результаты являются приблизительными, однако они дают более правильную оценку обсемененности воздуха в сравнении с седиментационным методом. Поскольку и отбор и санитарно-микробиологические исследования воздуха не регламентированы ГОСТ, то можно использовать любой прибор для оценки бактериальной загрязненности воздуха. Во многих случаях отбор проб совмещен с этапом посева.

Для снижения численности микроорганизмов в воздухе закрытых помещений применяют следующие средства: а) химические — обработка озоном, двуокисью азота, распыление молочной кислоты, б) механические — пропускание воздуха через специальные фильтры, в) физические — ультрафиолетовое облучение.

Определение общей численности сапрофитных бактерий

Общая бактериальная обсемененность воздуха или микробное число — это суммарное количество микроорганизмов, содержащихся в 1 м3 воздуха. Для определения общего количества бактерий в воздухе закрытых помещений забирают две пробы (объемом по 100 л каждая) на чашки Петри с МПА при помощи любого прибора (чаще всего аппарата Кротова), либо седиментационным методом, расставляя чашки с питательной средой по принципу конверта. Чашки с посевом помещают в термостат на сутки, а затем на 48 ч оставляют при комнатной температуре. Экспозиция чашек с посевами на свету дает возможность подсчитать раздельно количество пигментных колоний (желтых, белых, розовых, черных, оранжевых и др.), количество спорообразующих бацилл, грибов и актиномицетов.

Подсчитывают количество колоний на обеих чашках, вычисляют среднее арифметическое и делают перерасчет на количество микроорганизмов в 1 м3 воздуха. Бациллы образуют колонии, как правило, крупные, круглые, с неровными краями, сухие, морщинистые. Колонии грибов с пушистым налетом (Мисог и Aspergillus) и плотные -зеленоватые или сероватые (Penicillium). Актиномицеты образуют беловатые колонии, вросшие в агар. Количество каждой группы колоний (пигментных, беспигментных, плесеней, бацилл, актиномицетов) выражают в процентах по отношению к общему числу.
При определении микробного числа методом седиментации по Коху подсчитываются колонии, выросшие на МПА в чашках Петри, и расчет ведется по B.J1. Омелянскому. Если придерживаться этой методики, на чашку площадью 100 см2 за 5 мин оседает такое количество микробов, которое содержится в 10 л воздуха.
Определение стафилококков

Стафилококки являются одним из наиболее распространенных микроорганизмов в воздухе закрытых помещений, что обусловливается значительной устойчивостью их к различным факторам окружающей среды. Обнаружение патогенных стафилококков в воздухе закрытых помещений имеет санитарно-показательное значение и свидетельствует об эпидемическом неблагополучии. Отбор проб воздуха проводится с помощью аппарата Кротова в количестве 250 л на 2—3 чашки с молочно-желточно-солевым агаром (или молочно- солевым, желточно-солевым) и на чашку с кровяным агаром. Чашки инкубируют при температуре 37°С в течение 48 ч. Изучают культуральные признаки всех видов колоний (см. приложение 3), из подозрительных готовят мазки и окрашивают по Граму.
Помимо качественной характеристики отдельных колоний, подсчитывают количество выросших колоний стафилококков в 1 м3 воздуха.

Стрептококки также являются санитарно-показательными микроорганизмами воздуха, в который они попадают от больных скарлатиной, тонзиллитами, ангиной и носителей стрептококков. Отбор проб воздуха при исследовании на наличие а- и р-гемолитических стрептококков производят с помощью аппарата Кротова на чашки с кровяным агаром, средами Гарро и Туржецкого. Забирают 200—250 л воздуха, чашки с посевами выдерживают в термостате 18—24 ч и затем еще 48 ч при комнатной температуре (после предварительного просмотра и учета). Идентификацию проводят по общепринятой методике (см. приложение 3).

Определение патогенных микроорганизмов в воздухе

Ввиду малой концентрации патогенных микроорганизмов в воздухе закрытых помещений, их выделение является достаточно трудной задачей.
При расшифровке внутрибольничных инфекций определяют в воздухе присутствие стафилококков, стрептококков, синегнойной палочки, сальмонелл, протеев и др. Отбор проб воздуха производят с помощью ПАБ-1 в объеме не менее 1000 л. Посев производят на соответствующие элективные среды. Если используется жидкая среда как улавливающая жидкость, то пробирку с жидкостью помещают в термостат на сутки для подращивания (получение накопительной культуры), а затем высевают на элективную среду.
При исследовании воздуха на наличие микобактерий туберкулеза отбор проб производят с помощью прибора ПОВ-1 в объеме 250—500 л воздуха. В качестве улавливающей жидкости берут среду Школьниковой, которую затем обрабатывают 3% раствором серной кислоты (для подавления сопутствующей микрофлоры) и центрифугируют. Осадок засевают в пробирки на одну из яичных сред, чаще среду Левенштейна — Иенсена. Инкубируют при 37°С до 3 мес. Отсутствие роста в течение 3 мес дает возможность выдать отрицательный ответ. Пробирки первый раз просматривают через 3 нед, затем каждые 10 дней. Выделенную культуру идентифицируют, определяют ее вирулентность (заражением морских свинок — биопроба) и при необходимости определяют устойчивость к лекарственным препаратам.
При определении в воздухе коринебактерий дифтерии для посева воздуха используют чашки со средой Клауберга.
В последние годы определяют в атмосферном воздухе в районах дождевания земледельческих полей, при орошении их сточными водами, сальмонеллы в случае появления заболевания среди персонала станций орошения или населения. Отбор проб производят с помощью аппарата Кротова на чашки с висмут- сульфитным агаром. Исследуют не менее 200 л воздуха. Выделенная культура идентифицируется по обычной схеме определения сальмонелл.
В связи с развитием микробиологической промышленности возникла необходимость исследования воздуха с целью обнаружения грибов-продуцентов при производстве антибиотиков, ферментных препаратов, при изготовлении кормовых дрожжей и др. Для исследования воздуха на плесневые грибы рода Candida отбор проб производят с помощью аппарата Кротова в объеме от 100 до 1000 л на чашки со средой Чапека, суслоагаром (для обнаружения плесневых грибов) и с метабисульфит-натрий- агаром (МБС-агар) с добавлением антибиотиков (для обнаружения дрожжеподобных грибов рода Candida). Чашки инкубируют в термостате при температуре 26—27°С в течение 3—4 сут (для плесневых грибов) и при 35—37°С в течение 2—3 сут (для грибов — продуцентов и дрожжеподобных рода Candida). Идентификация проводится с учетом особенностей плодоносящих гиф и характера мицелия. Считают, что концентрация дрожжеподобных грибов в количестве 500—600 клеток в 1 м3 воздуха рабочего помещения является предельной, превышение ее ведет к развитию аллергических реакций у рабочих.

Стафилококк золотистый (лат. Staphylococcus aureus) — шаровидная грамположительная бактерия рода стафилококк.

Золотистый патогенный стафилококк вызывает гнойно-воспалительные процессы различной локализации: местные – фурункулы, абсцессы и др.; в отдельных органах – маститы, эндометриты, общее поражение – пиемия и септицемия, пищевые токсикозы (токсикоинфекции). Он проникает в организм человека через поврежденную кожу и слизистые оболочки, а также через пищевые продукты (мясо, молоко).

По мнению специалистов, наибольшее скопление микроорганизмов, в том числе патогенного золотистого стафилококка, выявлено в системах кондиционирования и вентиляции.

В соответствии с вышеперечисленными нормативными актами в вентиляционных системах и кондиционерах присутствие патогенных микроорганизмов не допускается, а общее количество колоний микроорганизмов в 1м3 воздуха должно быть не выше 1500, количество золотистого стафилококка в 1м3 воздуха до 100, количество плесневых и дрожжевых грибов в 1м3 воздуха до 20.

Контроль наличия бактерий в воздухе осуществляют в офисных, бытовых, производственных и рекреационных помещениях. Отбор проб воздуха проводят при закрытых форточках и дверях. Для исключения возможности дополнительного микробиологического загрязнения воздуха при взятии смывов из воздуховодов сначала проводят отбор проб воздуха.

Пробы можно брать аспирационным методом с помощью электрических пробоотборных переносных устройств. Для одновременного отбора проб рационально использовать несколько устройств. Это связано с тем, что для определения различных микроорганизмов необходимо использовать разные питательные среды и разный объем воздуха.

Забор материала из систем вентиляции и кондиционирования для проведения микробиологических исследований подразумевает взятие смывов из систем кондиционирования: с фильтров тонкой очистки, с увлажнителей, лопастей вентиляторов. В помещениях забор может осуществляться с воздухораспределителей и гибких воздуховодов (в зависимости от системы вентиляции).

Точки отбора проб рекомендуется располагать в местах притока воздушного потока в помещение. Отбор проб воздуха осуществляется с применением автоматического пробоотборника биологических аэрозолей ПУ-1Б и чашек Петри с плотными питательными средами.

В рамках эффективного контроля состояния воздушной среды специалисты Ассоциации независимых лабораторий Тестэко проведут микробиологический анализ воздуха на концентрацию спор золотистого стафилококка в офисе, квартире, и других помещениях.

Санитарно-микробиологическое исследование воздуха можно разделить на 4 этапа:

отбор проб;
обработка, транспортировка, хранение проб, получение концентрата микроорганизмов (если необходимо);
бактериологический посев, культивирование микроорганизмов;
идентификация выделенной культуры.

Отбор проб, как и при исследовании любого объекта, является наиболее ответственным. Правильное взятие проб гарантирует точность исследования. В закрытых помещениях точки отбора проб устанавливаются из расчета на каждые 20 м2 площади - одна проба воздуха, по типу конверта: 4 точки по углам комнаты (на расстоянии 0,5 м от стен) и 5-я точка - в центре. Пробы воздуха забираются на высоте 1,6—1,8 м от пола - на уровне дыхания в жилых помещениях. Пробы необходимо отбирать днем (в период активной деятельности человека), после влажной уборки и проветривания помещения. Атмосферный воздух исследуют в жилой зоне на уровне 0,5—2 м от земли вблизи источников загрязнения, а также в зеленых зонах (парки, сады и т.д.) для оценки их влияния на микрофлору воздуха. Для отбора воздуха на уровне 0,5-2м от земли используют специальные штативы.

Все методы отбора проб воздуха можно разделить на седиментационные и аспирационные.

Седиментационный - наиболее старый метод, широко распространен благодаря простоте и доступности, однако является неточным. Метод предложен Р. Кохом и заключается в способности микроорганизмов под действием силы тяжести и под влиянием движения воздуха (вместе с частицами пыли и капельками аэрозоля) оседать на поверхность питательной среды в открытые чашки Петри. Чашки устанавливаются в точках отбора на горизонтальной поверхности. При определении общей микробной обсемененности чашки с мясопептонным агаром оставляют открытыми на 5—10 мин или дольше в зависимости от степени предполагаемого бактериального загрязнения. Для выявления санитарно-показательных микробов применяют среду Гарро или Туржецкого (для обнаружения стрептококков), молочно-солевой или желточно-солевой агар (для определения стафилококков), суслоагар или среду Сабуро (для выявления дрожжей и грибов). При определении санитарно- показательных микроорганизмов чашки оставляют открытыми в течение 40—60 мин.

По окончании экспозиции все чашки закрывают, помещают в анаэростат или термостат для культивирования в оптимальной для развития выделяемого микроорганизма среде, затем (если этого требуют исследования) на 48 ч оставляют при комнатной температуре для образования пигмента пигментообразующими микроорганизмами.

Более совершенными методами являются аспирационные, основанные на принудительном осаждении микроорганизмов из воздуха на поверхность плотной питательной среды или в улавливающую жидкость (мясо-пептонный бульон, буферный раствор, изотонический раствор хлорида натрия и др.). В практике санитарной службы при аспирационном взятии проб используются аппарат Кротова, пробоотборное устройство ПУ-1Б, бактериоуловитель Речменского, прибор для отбора проб воздуха (ПОВ-1), пробоотборник аэрозольный бактериологический (ПАБ-1), бактериально-вирусный электропреципитатор (БВЭП-1), прибор Киктенко, приборы Андерсена, Дьяконова, МБ и др. Для исследования атмосферы могут быть использованы и мембранные фильтры № 4, через которые воздух просасывается с помощью аппарата Зейтца. Большое разнообразие приборов свидетельствует об отсутствии универсального аппарата и о большей или меньшей степени их несовершенства.

Пробоотборное устройство ПУ-1Б. В настоящее время этот прибор широко применяется при исследовании воздуха закрытых помещений и имеется в лабораториях СЭС.

Принцип работы ПУ-1Б основан на том, что воздух, просасываемый через отверстия в крышке аппарата, ударяется о поверхность питательной среды, при этом частицы пыли и аэрозоля прилипают к среде, а вместе с ними и микроорганизмы, находящиеся в воздухе. Чашку Петри с тонким слоем среды укрепляют на вращающемся столике аппарата, что обеспечивает равномерное распределение бактерий на ее поверхности. Работает аппарат от электросети. После отбора пробы с определенной экспозицией чашку вынимают, закрывают крышкой и помещают на 48 ч в термостат. Обычно отбор проб проводят со скоростью 200 л/мин в течение 0,5-5 мин. Таким образом, определяется флора в 100-1000 л воздуха.

Пробоотборник аэрозольный бактериологический (ПАБ-1) (в настоящее время снят с производства). Механизм действия ПАБ-1 основан на принципе электростатического осаждения частиц аэрозоля (а следовательно, и микроорганизмов) из воздуха при прохождении его через прибор, в котором эти частицы получают электрический заряд и осаждаются на электродах с противоположным знаком. На электродах для улавливания аэрозолей помещают в горизонтальном положении металлические поддоны с твердыми средами в чашках Петри или жидкой питательной средой (15—20 мл). Прибор переносной с большой производительностью 150-250 л/мин, т.е. за 1 ч можно отобрать 5—6 м3 воздуха. Его рекомендуют применять для исследования больших объемов воздуха при обнаружении условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, например, при выявлении в воздухе палат больниц возбудителей внутрибольничных инфекций (Pseudomonas aeruginosa. Staph, aureus и др.), определении сальмонелл и эшерихий в атмосферном воздухе в местах дождевания при орошении земледельческих полей сточными водами.

Для снижения численности микроорганизмов в воздухе закрытых помещений применяют следующие средства:

химические - обработка озоном, двуокисью азота, распыление молочной кислоты,
механические - пропускание воздуха через специальные фильтры,
физические - ультрафиолетовое облучение.

Определение общей численности сапрофитных бактерий

Общая бактериальная обсемененность воздуха или микробное число - это суммарное количество микроорганизмов, содержащихся в 1 м3 воздуха. Для определения общего количества бактерий в воздухе закрытых помещений забирают две пробы (объемом по 100 л каждая) на чашки Петри с МПА при помощи Пу-1Б, либо седиментационным методом, расставляя чашки с питательной средой по принципу конверта. Чашки с посевом помещают в термостат на сутки, а затем на 48 ч оставляют при комнатной температуре. Экспозиция чашек с посевами на свету дает возможность подсчитать раздельно количество пигментных колоний (желтых, белых, розовых, черных, оранжевых и др.), количество спорообразующих бацилл, грибов и актиномицетов.

При определении микробного числа методом седиментации по Коху подсчитываются колонии, выросшие на МПА в чашках Петри, и расчет ведется по B.Л. Омелянскому. Если придерживаться этой методики, на чашку площадью 100 см2 за 5 мин оседает такое количество микробов, которое содержится в 10 л воздуха.

Определение стафилококков

Стафилококки являются одним из наиболее распространенных микроорганизмов в воздухе закрытых помещений, что обусловливается значительной устойчивостью их к различным факторам окружающей среды. Обнаружение патогенных стафилококков в воздухе закрытых помещений имеет санитарно-показательное значение и свидетельствует об эпидемическом неблагополучии. Отбор проб воздуха проводится в количестве 250 л на 2—3 чашки с молочно-желточно-солевым агаром (или молочно- солевым, желточно-солевым) и на чашку с кровяным агаром. Чашки инкубируют при температуре 37°С в течение 48 ч. Изучают культуральные признаки всех видов колоний, из подозрительных готовят мазки и окрашивают по Граму.

Помимо качественной характеристики отдельных колоний, подсчитывают количество выросших колоний стафилококков в 1 м3 воздуха.

Определение стрептококков

Стрептококки также являются санитарно-показательными микроорганизмами воздуха, в который они попадают от больных скарлатиной, тонзиллитами, ангиной и носителей стрептококков. Отбор проб воздуха при исследовании на наличие а- и р-гемолитических стрептококков производят на чашки с кровяным агаром, средами Гарро и Туржецкого. Забирают 200—250 л воздуха, чашки с посевами выдерживают в термостате 18—24 ч и затем еще 48 ч при комнатной температуре (после предварительного просмотра и учета). Идентификацию проводят по общепринятой методике.

Определение патогенных микроорганизмов в воздухе

Ввиду малой концентрации патогенных микроорганизмов в воздухе закрытых помещений, их выделение является достаточно трудной задачей.

При расшифровке внутрибольничных инфекций определяют в воздухе присутствие стафилококков, стрептококков, синегнойной палочки, сальмонелл, протеев и др. Отбор проб воздуха производят в объеме не менее 1000 л. Посев производят на соответствующие элективные среды. Если используется жидкая среда как улавливающая жидкость, то пробирку с жидкостью помещают в термостат на сутки для подращивания (получение накопительной культуры), а затем высевают на элективную среду.

При исследовании воздуха на наличие микобактерий туберкулеза отбор проб производят в объеме 250—500 л воздуха. В качестве улавливающей жидкости берут среду Школьниковой, которую затем обрабатывают 3% раствором серной кислоты (для подавления сопутствующей микрофлоры) и центрифугируют. Осадок засевают в пробирки на одну из яичных сред, чаще среду Левенштейна - Иенсена. Инкубируют при 37°С до 3 мес. Отсутствие роста в течение 3 мес дает возможность выдать отрицательный ответ. Пробирки первый раз просматривают через 3 нед, затем каждые 10 дней. Выделенную культуру идентифицируют, определяют ее вирулентность (заражением морских свинок - биопроба) и при необходимости определяют устойчивость к лекарственным препаратам.

При определении в воздухе коринебактерий дифтерии для посева воздуха используют чашки со средой Клауберга.

В последние годы определяют в атмосферном воздухе в районах дождевания земледельческих полей, при орошении их сточными водами, сальмонеллы в случае появления заболевания среди персонала станций орошения или населения. Отбор проб производят с помощью аспиратора ПУ-1Б на чашки с висмут-сульфитным агаром. Исследуют не менее 200 л воздуха. Выделенная культура идентифицируется по обычной схеме определения сальмонелл.

В связи с развитием микробиологической промышленности возникла необходимость исследования воздуха с целью обнаружения грибов-продуцентов при производстве антибиотиков, ферментных препаратов, при изготовлении кормовых дрожжей и др. Для исследования воздуха на плесневые грибы рода Candida отбор проб производят в объеме от 100 до 1000 л на чашки со средой Чапека, суслоагаром (для обнаружения плесневых грибов) и с метабисульфит-натрий- агаром (МБС-агар) с добавлением антибиотиков (для обнаружения дрожжеподобных грибов рода Candida). Чашки инкубируют в термостате при температуре 26—27°С в течение 3—4 сут (для плесневых грибов) и при 35—37°С в течение 2—3 сут (для грибов - продуцентов и дрожжеподобных рода Candida). Идентификация проводится с учетом особенностей плодоносящих гиф и характера мицелия. Считают, что концентрация дрожжеподобных грибов в количестве 500—600 клеток в 1 м3 воздуха рабочего помещения является предельной, превышение ее ведет к развитию аллергических реакций у рабочих.

4 Настоящий стандарт модифицирован по отношению к международным стандартам*:

* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым в тексте, можно получить, обратившись в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

При этом дополнительные положения и требования, включенные в текст стандарта для учета потребностей национальной экономики указанных выше государств и особенностей межгосударственной стандартизации, выделены в тексте стандарта курсивом*.

* В бумажном оригинале обозначения и номера стандартов и нормативных документов в разделе "Предисловие" приводятся обычным шрифтом, остальные по тексту документа выделены курсивом. - Примечание изготовителя базы данных.

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанных международных стандартов для приведения в соответствие с ГОСТ 1.5 (подраздел 3.6).

Сравнение структуры настоящего стандарта со структурой указанных международных стандартов приведено в дополнительном приложении ДА.

Степень соответствия - модифицированная (MOD).

Стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 52815-2007

5 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2012 г. N 1773-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 31746-2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2013 г.

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта публикуется в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты".

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты"

ВНЕСЕНА поправка, опубликованная в ИУС N 6, 2019 год с учетом уточнения, опубликованного в ИУС 11-2019

Поправка внесена изготовителем базы данных

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты, кроме молока и молочных продуктов, и устанавливает методы выявления и определения количества коагулазоположительных стафилококков и Staphylococcus aureus (S. aureus) посевом: в жидкую селективную среду (с предварительным обогащением) и на (в) агаризованные селективно-диагностические среды.

Допускается использование хромогенных сред предварительного выявления количества коагулазоположительных стафилококков и Staphylococcus aureus в масложировой продукции.

Метод определения наиболее вероятного числа (НВЧ) коагулазоположительных стафилококков и S. aureus посевом в жидкую селективную среду предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта менее 150 или в 1 см жидкого продукта менее 15 колониеобразующих единиц (КОЕ) коагулазоположительных стафилококков и S. aureus.

Метод определения количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus посевом на агаризованные селективно-диагностические среды предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта более 1500 или в 1 см жидкого продукта более 150 колониеобразующих единиц (КОЕ) коагулазоположительных стафилококков и S. aureus.

Метод определения количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus посевом в агаризованную селективно-диагностическую среду предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта более 150 или в 1 см жидкого продукта более 15 колониеобразующих единиц (КОЕ) коагулазоположительных стафилококков и S. aureus.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 450-77 Кальций хлористый технический. Технические условия

ГОСТ 5962-67 Спирт этиловый ректификованный. Технические условия

ГОСТ 6672-75 Стекла покровные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 10444.1-84 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе

ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов

ГОСТ 30425-97 Консервы. Метод определения промышленной стерильности

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов по указателю "Национальные стандарты", составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 коагулазоположительные стафилококки: Грамположительные, каталазоположительные микроорганизмы, которые образуют типичные и/или атипичные колонии на (в) селективно-диагностической питательной среде, дающие положительную реакцию на коагулазу или специфичную для кроличьей плазмы реакцию на агаре с кроличьей плазмой и фибриногеном при определении по методам, приведенным в настоящем стандарте.

3.2 Staphylococcus aureus (S. aureus): Коагулазоположительные стафилококки, образующие ацетоин и ферментирующие мальтозу в аэробных условиях при определении этих биохимических тестов по методам, приведенным в настоящем стандарте.

3.3 выявление коагулазоположительных стафилококков и S. aureus: Определение присутствия или отсутствия коагулазоположительных стафилококков и S. aureus в определенной массе или объеме продукта по методам, приведенным в настоящем стандарте.

3.4 определение количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus: Количество коагулазоположительных стафилококков или S. aureus, содержащееся в 1 см или 1 г продукта и определенное по методам, приведенным в настоящем стандарте.

4 Методы выявления и определения количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus*

* Слова "S. aureus" в наименовании раздела 4 в бумажном оригинале выделены курсивом. - Примечание изготовителя базы данных.

4.1 Метод выявления и метод НВЧ - определение количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus* с предварительным обогащением

* Слова "и S. aureus" в наименовании подраздела 4.1 в бумажном оригинале выделены курсивом. - Примечание изготовителя базы данных.

Метод выявления и метод НВЧ - определение количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus посевом с предварительным обогащением основаны на высеве навески продукта и (или) разведений навески продукта в жидкую селективную среду, инкубировании посевов, пересеве культуральной жидкости на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды, подтверждении по биохимическим признакам принадлежности выделенных типичных и (или) атипичных колоний к коагулазоположительным стафилококкам и S. aureus.

При пересеве на агаризованную среду с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном выросшие типичные колонии без подтверждения по биохимическим признакам относят к коагулазоположительным стафилококкам.

4.1.1 Метод выявления коагулазоположительных стафилококков и S. aureus

4.1.1.1 Определенное количество жидкого продукта или определенное количество исходной суспензии при использовании продукта другой консистенции вносят в жидкую селективную питательную среду.

Читайте также: