Опыты гриффитса с пневмококками
Обновлено: 18.04.2024
Материальными основами наследственности являются хромосомы с € в них генами. Участок ДНК, кодирующий синтез одного белка →ген. Генетическая информация реализуется в процессах транскрипции и трансляции. В одной молекуле ДНК расположены сотни и тысячи генов. Одна молекула ДНК вместе с белками, принимая определенную пространственную форму, образует хромосому. Количество хромосом благодаря митозу в организме постоянно. Половые клетки, кроме митоза, подвергаются мейозу. В результате из 1 материнской клетки → 4 дочерние, с вдвое меньшим набором хромосом. При слиянии двух половых клеток (оплодотворении) →двойной набор хромосом.
Хромосомы и гены – материальные основы наследственности, хранения и передачи наследственной информации. Постоянство формы, размеров и числа хромосом, хромосомный набор – главный признак вида.
С ДНК связаны осн процессы организмов – наследственность и изменчивость.
Опыт Гриффитса с пневмококками повторяли в пробирке.Через определенное время часть бескапсульных бактерий приобрели капсулу и вирулентность. Эксперименты in vitro полностью исключали участие в феномене трансформации каких-либо систем макроорганизмов.
Задача О. Эвери с сотрудниками → какое в-во способствует трансформации. Методика определения была выбрана относительно простая. Лизированные клетки капсульного штамма разделялись на различные химические составляющие. Каждый компонент испытывался на наличие трансформирующих свойств. Путем такого отбора удалось получить вещество, обладающее высокой трансформирующей активностью. Это была дезоксирибонуклеиновая кислота - ДНК.
Более наглядно роль ДНК в передаче наследственной информации была установлена в 1952 г. американскими вирусологами А. Д. Херши и М. Чейзом при изучении разложения фага Т2 (вируса бактерий). Опыт состоял в том, что белки, входящие в протеиновую оболочку вириона, были помечены радиоизотопной меткой - S 35 (сера), а ДНК - радиоактивным фосфором - Р32. В дальнейшем вирус культивировался в клетках бактерий. После этого дочерние вирионы - потомство фага - подвергались радиометрическому анализу на распределение радиоактивных меток. Исследования показали, что новое поколение фаговых частиц содержало только фосфор - Р32. Исследователи сделали справедливый вывод о том, что именно ДНК, а не белок передается от родителей к потомству.
в 1952 г. Зайндером и Ледербергом открыта трансдукция →перенос генетического материала фагами от одних бактерий к другим. Ученые показали, что в процессе трансдукции активное участие принимает ДНК.
Также было обнаружено, что чистая нуклеиновая кислота вируса табачной мозаики может заразить растение, вызывая типичную картину заболевания. Более того, удалось искусственно создать вегетативные "гибриды" из вирусов, в которых белковый футляр принадлежал одному виду, а нуклеиновая кислота - другому. В таких случаях генетическая информация "гибридов" всегда в точности соответствовала тому виду вирусов, чья нуклеиновая кислота входила в состав "гибрида".
Работал с двумя штаммами пневмококка, которые отличались по внешнему виду и болезнетворным свойствам. Штамм S – от него мыши сразу погибали. Штамм R – при введении гибели мышей не наступало. Он заметил, что при смеси убитых вирулетных и невирулетных мышы погибали. Это доказало процесс транформации.
Трансформация – включение чужеродной ДНК в бактериальную клетку. Это перенос наследственной информации от одной клетки прокариотов к другой посредством ДНК бактерии – донора или клетки – донора. (Гриффитс, 1928).
Опыт Херши и Чейза.
Они выяснили, что не все вирусы убивают бактериальную клетку. Существуют умеренные фаги. Они могут быть и вирулентными и объединятся с геномом бактериальной клетки. При этом попадая в другие бактерии вирусы привносят чужие генетические данные. Так доказан процесс трансдукции.
Трансдукция заключается в том, что вирусы, покидая бактериальные клетки, в которых они паразитировали, могут захватывать с собой часть их ДНК и, перемещаясь в новые клетки, передавать новым хозяевам свойства прежних.
Доказательства генетической роли ДНК были получены в ряде опытов по заражению бактериальных клеток вирусами. Бактериофаг состоит из белковой капсулы правильной геометрической формы и молекулы нуклеиновой кислоты , свернутой в виде спирали. Фаг прикрепляется своими отростками к клеточной оболочке, с помощью ферментов разрушает участок клеточной мембраны и чрез образовавшееся отверстие вводит свою ДНК в клетку и т.д.
Когда белок фага был помечен радиоактивной серой 35 S, а ДНК – радиоактивным фосфором 32 Р оказалось, что вновь образованные фаги содержали только радиоактивный фосфор, которым была помечена ДНК. Эти опыты наглядно показали, что генетическая информация от внедрившегося фага его потомкам передается только проникающей в клетку нуклеиновой кислотой, а не белком, содержащимся в капсуле вируса.
Им удалось доказать, что чистая НК вируса табачной мозаики может заражать растения. И удалось создать гибрид из вирусов, в котором белковый футляр принадлежал одному, а НК другому вирусу. В таких случаях генетическая информация гибридов в точности повторяла генетическую информацию вируса, чья НК находилась в гибриде.
Современные представления о генетическом коде. Опыт Ниринберга. Синтез специфических белков. Репликация, транскрипция, трансляция. Транскрипция 4х-значного кода первичной генетической информации в 20-значный аминокислотный код белков. Виды и структура т-РНК, р-РНК, и-РНК. Мультимерная организация белков (гемоглобин человека:HbA, HbA2, HbS, HbF).
Генетический код – система расположения нуклеотидов в молекуле ДНК, контролирующая последовательность расположения аминокислот в молекуле белка.
Структура каждой молекулы ДНК индивидуальна и специфична, так как представляет собой кодовую форму записи биологической информации. С помощью 4 нуклеотидов в ДНК записана вся важная информация об организме, передающаяся по наследству.
Эксперимент Освальда Эвери, Колина Маклауда [1] и Маклина Маккарти (англ. Oswald Avery, Colin MacLeod, Maclyn McCarty ), произведённый в 1944 году, доказал, что веществом, вызывающим трансформацию бактерий, является ДНК. Это явилось первым материальным доказательством роли ДНК в наследственности.
Эксперимент Эвери, Маклауда и Маккарти стал кульминацией исследований, начатых экспериментом Гриффита в 1928 году и проводившихся в Рокфеллеровском институте медицинских исследований в 1930-х — 1940-х годах. В эксперименте Гриффита убитые пневмококки (Streptococcus pneumoniae) вирулентного штамма III-S, введенные с живыми невирулентными пневмококками штамма II-R, вызывали инфекцию типа III-S.
В статье, опубликованной в феврале 1944 года в Журнале экспериментальной медицины (англ. Journal of Experimental Medicine ), Эвери с соавторами показал, что ДНК, но не белки являлись веществом, определяющим наследственность у бактерий [2] [3] .
Содержание
Предыстория
Эвери с соавторами показал, что именно ДНК является ключевым компонентом эксперимента Гриффита — у мышей, получавших инъекцию убитыми бактериями одного штамма и живыми бактериями другого штамма, развивалась инфекция типа убитого штамма.
После разработки метода серологического типирования медики получили возможность определять принадлежность бактерий к тому или иному штамму. Человек или животное, в организм которого попадает определенный штамм бактерий, в результате иммунного ответа образует антитела, специфически реагирующие с антигенами на поверхности этих бактерий. Содержащая антитела сыворотка крови может быть выделена и использована для тестирования разных штаммов. Антитела реагируют только с бактериями того типа, который использовался при иммунизации. Штаммы пневмококка были впервые описаны и типированы немецким бактериологом Фридрихом Нойфельдом (нем. Fred Neufeld ). До исследований Гриффита бактериологи полагали, что штаммы не изменяются от поколения к поколению [4] .
Данные, полученные Гриффитсом, позднее были подтверждены Нойфельдом [7] в Институте Коха и Мартином Досоном (англ. Martin H. Dawson ) в Рокфеллеровском институте [8] Учёные Рокфеллеровского института продолжили изучение трансформации в последующие годы. Совместно с Ричардом Сиа Досон разработал метод трансформации клеток бактерий in vitro (эксперимент Гриффитса был сделан в условиях in vivo) [9] . После отъезда Досона в 1930 году, Джеймс Эллоуэй (англ. James Alloway ) предпринял попытки продолжить исследования Гриффита и к 1933 году получил водный экстракт трансформирующего агента. Колин Маклауд работал над очисткой этих растворов с 1934 по 1937 год. Исследования были продолжены в 1940 году и завершены Маклином Маккарти [10] [11] .
Эксперимент
Пневмококки в норме образуют гладкие (то есть крупные, с ровной поверхностью) колонии и имеют полисахаридную капсулу, компоненты которой и запускают образование антител.
В ходе эксперимента пневмококки, образующие гладкие колонии, были убиты нагреванием, и из них был извлечён компонент, растворимый в водно-солевом растворе. Белки были осаждены хлороформом, а полисахаридные капсулы, обусловливающие антигенные свойства бактерий, гидролизованы специфичным ферментом. Для подтверждения полного гидролиза капсул, была проведена процедура иммунопреципитации специфическими антителами. После разделения в спирте из полученной активной фракции были выделены волокнистые тяжи [2] .
Химический анализ показал, что соотношение углерода, водорода, азота и фосфора в полученном осадке соответствует соотношению этих же элементов в молекуле ДНК. Для подтверждения того, что действующим началом трансформации является именно ДНК, но не РНК, белки или другие компоненты клетки, Эвери с сотрудниками обработали смесь трипсином, химотрипсином, рибонуклеазой, но эта обработка никак не влияла на трансформирующие свойства. Лишь обработка ДНКазой приводила к разрушению трансформирующего начала [2] . Таким образом было установлено, что действующим началом бактериальной трансформации является дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК).
Эксперимент Освальдом Эвери, Колин Маклеод и Маклин Маккарти (англ. Oswald Avery, Colin MacLeod, Maclyn McCarty ), произведенный в 1944 году, доказал что ДНК является веществом, вызвавшим трансформацию клеток бактерий.
Эксперимент Эвери, Маклеод и Маккарти стал кульминацией исследований, проводившихся в Рокфеллеровском институте медицинских исследований (англ. en:Rockefeller Institute for Medical Research ) в 1930-х — 1940-х годах, начатых экспериментом Гриффитса в 1928 году. В эксперименте Гриффитса убитые Streptococcus pneumoniae вирулентного штамма III-S, введенные с живыими невирулентными пневмококками штамма II-R, вызывали инфекцию типа III-S.
В статье, опубликованной в феврале 1944 года в Журнале экспериментальной медицины (англ. Journal of Experimental Medicine ), Эвери с соавторами показали, что ДНК, но не белки являлись веществом, определяющим наследственность у бактерий. [1] [2]
Содержание
Предыстория
Эвери с соавторами показали, что именно ДНК является ключевым компонентом эксперимента Гриффитса — у мышей, получавших инъекцию убитыми бактериями одного штамма и живыми бактериями другого штамма, развивалась инфекция типа убитого штамма.
После разработки метода серологического типирования, исследователи получили возможность классифицировать бактерии в разные штаммы, или типы. Особь, привитая определенным штаммом бактерий, в результате иммунного ответа образует антитела, специфически реагирующие с антигенами на поверхности бактерий. Сыворотка крови, содержащая антитела может быть выделена и использована для тестирования штаммов бактерий. Антитела будут регаировать с бактериями того же типа, что были использованы при иммунизации. Немецикий бактериолог, Фред Нейфель (англ. Fred Neufeld ) впервые описал штаммы пневмококка. До исследований Гриффитса, бактериологи полагали, что штаммы не изменяются от поколения к поколению. [3]
В результате эксперимента Гриффитса, опубликованном в 1928 году, [4] было показано, что некоторый элемент трансформации заставлял пневмококков трансформироваться из одного штамма в другой. Гриффитс, британский офицер, медик, многие годы занимался серологическим типированием пневмонии. Гриффтис предполагал, что штаммы, склонные к вирулентности и невирулентные штаммы превращаются друг в друга (но не предполагал, что разные штаммы могут одновременно заражать один организм). Проверяя данную возможность, Гриффитс показал, что трансформация может происходить в случае, когда мышей иммунизировали убитыми бактериям вирулентного штамма и живые бактериями невирулентного штамма. Позднее из умерших мышей выделяли бактерии вирулентного штамма. [5]
Данные, полученные Гриффитсом, позднее были подтверждены Фредом Нойфельдом [6] в Институте Коха и Мартином Генри Доусоном в Институте Рокфеллера. [7] В институте Рокфеллера некоторые исследователи продолжили изучение трансформации в последующие годы. Совместно с Ричардом Сиа, Мартин Генри разработал метод трансформации клеток бактерий in vitro (эксперимент Гриффитса был сделан в условиях in vivo). [8] После отъезда Доусона в 1930 году, Джеймс Эллоуэй (англ. James Alloway ) в 1933 году предпринял попытки продолжить исследования Гриффитса и получить водный экстракт трансформирующего агента. Колин Маклеод работал над выделением этих водных растворов с 1934 по 1937 год, исследования были продолжены в 1940 году и завершены Маклин Маккарти. [9] [10]
Эксперимент
В ходе эксперимента пневмококки, колонии которых имели гладкий вид, были убиты нагреванием, и был экстрагирован компонент, растворимый в растворе соли. Было произведено осаждение белков хлороформом. Полисахаридные капсулы, обуславливающие антигенные свойства бактерий, были гидролизованы специфичным ферментом. Для подтверждения полного гидролиза капсул, была сделана процедура иммунопреципитации специфическими антителами. Из полученного продукта после обработки спиртом и при последующем фракционировании были выделены тяжи. [1]
Химический анализ показал, что соотношения атомов углерода, водорода, азота и фосфора в полученных тяжах соответствует соотношению этих же атомов в молекуле ДНК. Для подтверждения того, что действующим началом трансформации является именно ДНК, но не РНК, белки или другие компоненты клетки, Эвери с сотрудниками обработали смесь трипсином, химотрипсином, рибонуклеазой, но эта обработка никак не влияла на трансформирующие свойства. Лишь обработка ДНКазой приводила к разрушению трансформирующего начала. [1]
Гриффит работал с пневмококками - бактериями, вызывающими пневмонию. Он брал два штамма пневмококков: капсульный и бескапсульный. Капсульный - патогенный (вирулентный), при инфицировании таким штаммом мыши погибают, бескапсульный - непатогенный. При введении мышам смеси убитых нагреванием (и, следовательно, потерявших вирулентность) капсульных пневмококков и живых бескапсульных невирулентных бактерий, животные погибали в результате размножения капсульных вирулентных форм. Обнаруженное явление Гриффит интерпретировал как трансформацию.
Опыты Гриффита
После заражения пневмококками капсульного патогенного (вирулентного) штамма мыши погибают. Капсульные пневмококки размножаются.
При инфицировании пневмококками бескапсульного непатогенного штамма животные не погибают. Бескапсульные пневмококки не размножаются.
После заражения пневмококками капсульного патогенного (вирулентного) штамма, предварительно убитыми нагреванием, мыши не погибают. Пневмококки не размножаются.
При введении мышам одновременно бескапсульных невирулентных пневмококков и капсульных, убитых нагреванием, животные погибают. Капсульные пневмококки размножаются.
Бескапсульные невирулентные пневмококки приобрели некоторые свойства убитых капсульных бактерий.
Определение: Трансформация - это приобретение одним организмом некоторых признаков другого организма за счет захвата части его генетической информации.
В 1944г. этот эксперимент был повторен Освальдом Эйвери, Колином Мак-Леодом и Маклином Мак-Карти в варианте смешивания бескапсульных пневмококков с взятыми от капсульных белками, полисахаридами или ДНК. В результате этого эксперимента была выявлена природа трансформирующего фактора.
Трансформирующим фактором оказалась ДНК.
2. 1952Г. Эксперимент Альфреда Херши и Марты Чейз.
Фаги (бактериофаги) - это вирусы, размножающиеся в бактериях.
E. сoli - кишечная палочка (эубактерия).
Суть опыта: фаги, у которых белковая оболочка была мечена радиоактивной серой (S 35 ), а ДНК - радиоактивным фосфором (Р 32 ), инкубировали с бактериями. Затем бактерии отмывали. В смывных водах не обнаруживали Р 32 , а в бактериях - S 35 Следовательно, внутрь попала только ДНК. Через несколько минут из бактерии выходили десятки полноценных фагов, содержащих и белковую оболочку, и ДНК.
Эксперимент А.Херши и М.Чейз
Фаги, у которых белковая оболочка была мечена радиоактивной серой (S 35 ), а ДНК - радиоактивным фосфором (Р 32 ), инкубировали с бактериями.
Затем бактерии отмывали. В смывных водах не обнаруживали Р 32 , а в бактериях - S 35 . В то же время большая часть Р 32 оказалась внутри бактериальных клеток, а вся S 35 - в окружающей среде.
Следовательно, внутрь попала только ДНК. Через несколько минут из бактерии выходили десятки полноценных фагов, содержащих немеченую белковую оболочку, и ДНК, меченую Р 32 .
Именно ДНК выполняет генетическую функцию - несет информацию как о создании новых копий ДНК, так и о синтезе фаговых белков
Отсюда следовал однозначный вывод о том, что именно ДНК выполняет генетическую функцию - несет информацию как о создании новых копий ДНК, так и о синтезе фаговых белков.
Читайте также: