Опыты на кишечной палочки
Обновлено: 25.04.2024
Но главное открытие, сделанное авторами, состоит не в этом. Эволюционная динамика, отображенная на рис. 1, не вписывается в простейшую модель, согласно которой адаптивная эволюция монокультуры бесполых организмов в стабильных условиях сводится к последовательной фиксации отбором вновь возникающих полезных мутаций.
Статистическая обработка данных, приведенных на рис. 1, показала, что эта простейшая модель не может объяснить наблюдаемую картину даже с учетом таких осложняющих обстоятельств, как генетический автостоп и клональная интерференция (конкуренция между клонами бактерий с разными полезными мутациями; см.: Clonal interference). Например, многие мутации, достигнув некоторой частоты, вдруг перестают распространяться, то есть двигаться дальше в сторону фиксации (таков естественный ход событий, если клон с данной мутацией имеет более высокую приспособленность, чем другие бактерии в популяции). Но эти клоны и не вымирают, проиграв конкуренцию клонам с более удачными мутациями. Вместо этого частота мутации начинает колебаться вокруг какого-то уровня. Эти колебания могут продолжаться десятки тысяч поколений, причем уровень, вокруг которого происходят колебания, может со временем меняться.
Метагеномные данные, полученные для каждой из 1440 проб, представляют собой множество отсеквенированных кусочков ДНК, принадлежащих разным индивидам. Поэтому нельзя сразу понять, какие мутации относятся к одному и тому же клону, а какие — к разным. Однако авторам удалось разобраться в этом, проанализировав согласованность изменения частот мутаций во времени (поскольку частоты мутаций, находящихся в одном и том же геноме, меняются синхронно). В итоге выяснилось, что по крайней мере в девяти из двенадцати подопытных популяций в течение длительного времени (свыше 10 000 поколений) имело место устойчивое сосуществование как минимум двух клад (эволюционных линий). Внутри этих клад шли свои собственные эволюционные процессы, то есть появлялись и фиксировались различные мутации (рис. 3).
Это значит, что в большинстве подопытных популяций произошла экологическая диверсификация. Разные клады как-то поделили между собой экологические ниши и стали устойчиво сосуществовать, приспосабливаясь теперь уже не к изначально заданным стабильным условиям среды, а к специфическому и переменчивому биотическому окружению.
Данное явление ранее было обнаружено в одной из двенадцати популяций (Ara-2). Две клады, сосуществующие в этой популяции, имеют разный обмен веществ и используют к своей выгоде продукты жизнедеятельности другой клады. Устойчивое сосуществование обеспечивается частотно-зависимым балансирующим отбором. Это значит, что относительная приспособленность клады тем выше, чем ниже ее численность (J. Plucain et al., 2014. Epistasis and allele specificity in the emergence of a stable polymorphism in Escherichia coli). Новые данные показали, что аналогичная ситуация сложилась как минимум в девяти из двенадцати популяций. Таким образом, экологическая диверсификация — не случайный эпизод, а общая закономерность.
Статистический анализ распределения мутаций во времени показал, что в одних генах мутации преимущественно фиксировались в начале эксперимента (на ранних этапах адаптации), тогда как в других генах мутации начали фиксироваться лишь на поздних этапах. Это объясняется тремя причинами, причем все три, по мнению авторов, реально работают в ходе эксперимента (строго доказать это пока нельзя, но есть косвенные статистические аргументы в пользу реальности всех трех причин).
Таким образом, долгосрочный эволюционный эксперимент опроверг чрезмерно упрощенные представления о том, как должна идти адаптация бесполой популяции к стабильным условиям среды. Ничего похожего на замедление и остановку адаптивной эволюции по мере приближения к оптимуму (пику на ландшафте приспособленности) не наблюдается, запас потенциально полезных мутаций не исчерпывается, и даже темп их накопления практически не снижается. Вместо этого мы видим самопроизвольное усложнение эволюционирующего сообщества, которое из монокультуры превращается в экосистему с подразделенными нишами и коэволюционирующими кладами и явно не собирается в обозримом будущем переходить в состояние эволюционного стазиса. Так что Лесли Оргел был, конечно, прав насчет того, кто умнее — эволюция или теоретики, считающие, что всё про нее знают.
Источник: Benjamin H. Good, Michael J. McDonald, Jeffrey E. Barrick, Richard E. Lenski & Michael M. Desai. The dynamics of molecular evolution over 60,000 generations // Nature. Published online 18 October 2017. DOI: 10.1038/nature24287.
В ходе уникального эксперимента, длившегося более 20 лет, удалось детально проследить эволюционные изменения, происходившие в популяции кишечной палочки Escherichia coli в течение 40 000 поколений. В первой половине эксперимента в популяции фиксировались в основном полезные мутации, повышавшие приспособленность бактерий. Самым неожиданным результатом оказалось постоянство скорости накопления полезных мутаций. До сих пор считалось, что с постоянной скоростью должны накапливаться нейтральные мутации, а не полезные, однако в эксперименте всё оказалось наоборот. В середине эксперимента в популяции зафиксировалась мутация, резко повысившая темп мутагенеза. После этого мутации стали фиксироваться на порядок быстрее, но это были в основном уже не полезные, а нейтральные мутации.
Давняя мечта биологов — напрямую сопоставить темпы эволюции на геномном и организменном уровнях — наконец-то начинает сбываться. До сих пор в этой области приходилось довольствоваться в основном теоретическими соображениями и математическими моделями. Уникальный эксперимент, начатый в 1988 году международной командой исследователей под руководством Ричарда Ленски (Richard E. Lenski), дал возможность с небывалой доселе степенью детальности проследить ход эволюции как на уровне генома (темп накопления мутаций), так и на уровне целого организма (темп развития адаптаций).
Длительность эксперимента и размер популяции были достаточными для того, чтобы каждая из возможных точечных мутаций (нуклеотидных замен) в ходе случайного мутирования произошла более одного раза (размер генома подопытного штамма кишечной палочки — 4,6 × 10 6 пар нуклеотидов).
За первые 20 000 поколений в экспериментальной популяции зафиксировалось 45 мутаций, в том числе 29 однонуклеотидных замен и 16 иных мутаций (вставок, выпадений, инверсий, встраиваний мобильных элементов). Самое интересное, что скорость накопления мутаций на этом этапе была строго постоянной (все отклонения от линейной модели статистически недостоверны), тогда как приспособленность сначала росла очень быстро, а затем ее рост замедлился (см. рисунок).
Постоянная скорость фиксации, согласно теории, характерна для нейтральных мутаций. Однако все 45 мутаций не могли быть нейтральными. Ясно, что по крайней мере некоторые из них были полезными — об этом свидетельствует рост приспособленности. Полученные результаты не очень легко увязать и с гипотезой о том, что все 45 мутаций были полезными. Авторы рассматривают несколько простых моделей с разными наборами исходных допущений, из которых следует, что, если бы все мутации были полезными, то обе величины — приспособленность и число накопленных мутаций — должны были бы меняться сходным образом, то есть или расти с постоянной скоростью, или параллельно замедляться.
Авторы, однако, приводят четыре серьезных аргумента против такого объяснения.
1) В случае преобладания нейтральных мутаций должно быть резко повышено число синонимичных нуклеотидных замен (то есть таких изменений ДНК, которые не ведут к изменениям аминокислотной последовательности белков). Вопреки этим ожиданиям, все без исключения зафиксировавшиеся мутации в кодирующих областях генов являются значимыми (несинонимичными).
4) При помощи генной инженерии авторы смогли непосредственно определить степень полезности 9 мутаций из рассматриваемых 45. Эти мутации искусственно внедряли в геном предкового штамма. В восьми случаях из девяти приспособленность бактерий резко повысилась. Что касается девятой мутации, то авторы думают, что она тоже полезна, но не сама по себе, а в сочетании с другими мутациями, потому что точно такая же мутация закрепилась у других подопытных популяций. Для сравнения, в другом эксперименте в геном кишечной палочки вносили случайные мутации по одной, и при этом ни одна из 26 мутаций не дала ни малейшего выигрыша в приспособленности.
Таким образом, в течение первых 20 000 поколений в популяции фиксировались преимущественно полезные мутации, причем их фиксация шла с постоянной скоростью. Замедление роста приспособленности, по-видимому, было связано с тем, что средняя степень полезности мутаций постепенно снижалась. Наиболее радикальные адаптивные изменения произошли в течение первых 2000 поколений, а затем, вероятно, происходила более тонкая оптимизация фенотипа.
Аналогичные по своей функции мутации, увеличившие темп мутагенеза, закрепились и в нескольких других экспериментальных популяциях. Из этого следует, что рост темпов мутагенеза дал бактериям адаптивное преимущество. Это, между прочим, противоречит распространенной идее о том, что в стабильных условиях организмам было бы выгодно снизить темп мутирования до нуля — и этого не происходит только из-за технической невозможности обеспечить абсолютную точность копирования ДНК (см.: В. П. Щербаков, 2005).
Почему-то в статье не сказано, как изменилась приспособленность бактерий во второй половине эксперимента.
Биологи активно используют результаты сравнений геномов для реконструкции путей и темпов эволюции организмов. До сих пор при этом приходилось довольствоваться в основном математическими моделями, основанными на разных более или менее правдоподобных допущениях. Теперь наконец появляется возможность экспериментальной проверки этих моделей. Первые результаты оказались во многом неожиданными. Например, мало кто ожидал, что постоянный темп накопления полезных мутаций может сопровождаться замедляющимся ростом приспособленности; или что возможны столь резкие скачки в соотношении темпов фиксации нейтральных и полезных мутаций. Основной вывод состоит в том, что количественные соотношения между разными аспектами эволюционного процесса (нейтральностью и адаптивностью, влиянием дрейфа и отбора, темпами изменений на уровне генотипа и фенотипа) могут быть существенно более сложными, неоднозначными и переменчивыми, чем предполагалось ранее.
Источник: Jeffrey E. Barrick, Dong Su Yu, Sung Ho Yoon, Haeyoung Jeong, Tae Kwang Oh, Dominique Schneider, Richard E. Lenski, Jihyun F. Kim. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli // Nature. 2009. V. 461. P. 1243–1247.
Долговременный эксперимент по эволюции E.coli — попытка ученых в экспериментальных условиях наблюдать эволюционные процессы. Может возникнуть вопрос, почему для этих нужд ученые использовали именно кишечную палочку, а не собаку или лошадь? Одна из причин в том, что E.coli очень быстро размножается. Другая особенность, делающая бактерию удобной для исследований, — небольшой размер генома, который позволяет достаточно быстро определить, какие мутации возникают в генах со сменой поколений. Кроме того, E.coli можно без вреда для нее заморозить на длительное время.
12 популяций бактерий E.coli, участвующих в эксперименте
Фото: Michigan State University
Долговременный эксперимент по эволюции E.coli оказался удобной платформой для того, чтобы решить данную проблему. Ученые под руководством Ричарда Ленски проанализировали полные геномы 264 клонов из 12 популяций, в которых, в конечном итоге, сменилось 50 тысяч поколений. Предварительные результаты продемонстрировали, что приспособленность микроорганизмов, которая определяется как скорость роста популяции, увеличилась на 70 процентов по сравнению с той, что была у предкового штамма.
Бактерия Escherichia coli
Изображение: United States Department of Health and Human Services
Молекулярные биологи расшифровали геномы кишечных палочек, принадлежащих поколениям 500, 1000, 1500, 2000, 5000, 10 000, 15 000, 20 000, 30 000, 40 000, 50 000, с помощью метода секвенирования нового поколения. Всего было найдено более 14 тысяч мутаций, которые привели к потере 1,4 процента общего генома. При этом на половину популяций (Ara−1, Ara−2, Ara−3, Ara−4, Ara+3 и Ara+6) приходилось 96,5 процента точечных мутаций (мутаций, затрагивающих один нуклеотид). Это объясняется тем, что некоторые изменения в генах привели к нарушению процессов восстановления поврежденной ДНК, в результате чего скорость мутирования у этих штаммов значительно повысилась. Склонность к мутациям также придавали IS-элементы (Insertion Sequence) — короткие фрагменты ДНК, которые способны перемещаться и размножаться внутри генома, не выполняя никакую полезную функцию. Например, в популяции Ara+1 31,8 процента мутаций представляли собой вставки IS-элементов, а у популяции Ara−5 (поколение 30 000) доля этого же типа мутации достигала 38,7 процента.
Ученые отмечают, что склонность к генетическим изменениям лишь незначительно повышала приспособляемость организма, поскольку в то же время увеличивалось число не только полезных, но и вредных мутаций. В гипермутированных E.coli отличить полезные генетические изменения от моря остальных мутаций (нейтральных и негативных) становится очень затруднительно. Поэтому исследователи обратили свое внимание на популяции, где скорость генетических изменений осталась на предковом уровне. На основе данных они построили модель зависимости между временем и числом полезных мутаций, которая позволяла точно предсказать уровень приспособленности у микроорганизмов из поколения 50 000. Чтобы снизить влияние статистической неопределенности, биологи обратились к дополнительным доказательствам.
Биолог Ричард Ленски, руководитель долговременного эксперимента
Во-первых, так как нейтральные мутации не оказывают никакого влияния на приспособляемость, на них не действует естественный отбор, поэтому скорость их накопления должна быть сравнима с общей частотой мутаций. К таким генетическим изменениям, в частности, относят синонимичные замены, при которых изменение одного нуклеотида в гене на другой не приводит к замене аминокислоты в белке. Ученые рассчитали, во сколько раз несинонимичные мутации накапливаются быстрее, чем синонимичные. Результаты показали, что после 500-го поколения скорость была больше в 17,1 раза, а после 50 000-го — в 3,4 раза. Это говорит о том, что большинство несинонимичных мутаций были полезными и повышали приспособляемость организмов.
Исследователи также выяснили, что большинство мутаций, произошедших в ранних поколениях, были драйверными и оказывались полезными для кишечной палочки. С течением времени их доля снижалась, однако они не пропадали полностью.
Авторы статьи подчеркивают, что штаммы E. coli, участвующие в долговременном эксперименте, могут отличаться от многих природных популяций в важных аспектах, включая низкую частоту мутаций, отсутствие полового размножения и стабильные условия окружающей среды. Эффекты, которые могут накладывать неучтенные факторы на скорость накопления различных видов мутаций, должны быть учтены в будущих экспериментах.
Обзор
Герой февраля: кишечная палочка Escherichia coli
Автор
Редакторы
Скромная бактерия за полстолетия с момента ее открытия в конце XIX в. стала настоящей волшебной палочкой для молекулярной биологии. Сейчас результаты опытов с ее использованием занимают главы и тома профессиональных и популярных изданий. Конечно, в нашем путеводителе по модельным организмам E. coli должна была занять свое почетное место.
Двенадцать модельных организмов
Escherichia и Eschrichtius — Болезнь путешественников — Главная модельная бактерия — Учебник молекулярной генетики — Невезение с CRISPR/Cas
Рисунок 1а. Escherichia длиной 2 мкм
Рисунок 1б. Теодор Эшерих (1857–1911)
Рисунок 1в. Eschrichtius длиной 14 метров
Рисунок 1г. Даниэль Фредрик Эшрихт (1798–1863)
Клетки с относительно тонкой клеточной стенкой, не окрашивающиеся красителем генцианом фиолетовым (окраской бактерий по методу датского микробиолога Кристиана Грама).
Зачем же такую опасную бактерию сделали модельной? Дело в том, что в условиях культивирования кишечная палочка часто теряет патогенность, становится неспособной жить в естественных для себя условиях (то есть одомашнивается). И этим свойством в 1940-е годы воспользовались микробиологи, проведя с лабораторными штаммами E. coli (например, со знаменитым штаммом К12) много прорывных для науки экспериментов.
Так, манипулируя мутированными штаммами кишечной палочки, которые уже научились получать при помощи облучения, Джошуа Ледерберг и Эдуард Лаури Тейтем в 1947 году обнаружили способность разных штаммов обмениваться генетическим материалом и спасать друг друга от образовавшихся дефектов, проявлявшихся в неспособности расти на минимальной питательной среде. Так был открыт процесс конъюгации бактерий, который затем послужил важным инструментом для картирования бактериального генома . Ведь тогда это можно было делать только косвенными, микробиологическими методами — сама природа генетического кода была неизвестна.
Кстати, Джошуа Ледерберг был некоторое время мужем Эстер Ледерберг, первооткрывательницы бактериофага лямбда [3].
С начала 1950-х годов исследования по молекулярной генетике с использованием кишечной палочки и ее вирусов в качестве основного инструмента росли как снежный ком. Не будет преувеличением сказать, что к 70-м годам E. coli написала учебник молекулярной генетики! Вспомним открытие генетического кода, в котором участвовало несколько коллективов физиков и молекулярных биологов, в том числе Френсис Крик, Георгий Гамов и другие выдающиеся люди того времени [6]. Основные эксперименты по расшифровке кода велись на бесклеточных лизатах кишечной палочки.
Позднее обнаружилось, что E. coli хорошо подходит для зародившейся в 1960–1970-е годы биотехнологии [7]. Бактерия хорошо переносит введение в свою клетку гетерологичных (то есть чужеродных) генов и во многих случаях способна синтезировать их продукты без вреда для себя. Белки, полученные таким способом, стали называть рекомбинантными, и теперь они широко используются в медицине и других практических задачах.
Кишечная палочка — возможно, самый исследованный организм с точки зрения молекулярной биологии. Тем не менее у элементов ее генома до сих пор обнаруживают новые свойства. Это одновременно плохо (как же мало мы знаем!) и хорошо (будет чем заняться!). Совсем недавно на защите диссертации я услышал о том, как у одной из генных кассет эшерихии, участвующей в каскаде переработки сульфолипидов, также обнаружена и лактазная активность [8]. До этого такая активность была известна только у знаменитого лактозного оперона Жакоба и Моно, описанного в 1961 году!
Кажется, что E. coli — модельный организм без недостатков. Тем не менее биотехнологам не повезло, что у этой бактерии от природы нет системы бактериального иммунитета CRISPR/Cas [9], о которой я уже упоминал в эссе о бактериофаге лямбда [3]. Именно поэтому эту систему, ныне незаменимую в генной инженерии, открыли относительно поздно.
Кишечная палочка-выручалочка — это здорово (рис. 2). Но теперь пора переместиться в мир ядерных организмов. Удобным инструментом для молекулярной биологии и генетики эукариот оказались одноклеточные грибы — дрожжи — и гаплоидный плесневый гриб — нейроспора. Как они дошли до такой одноклеточной и гаплоидной жизни и что было открыто с их помощью — читайте в следующем материале нашего путеводителя по модельным организмам через месяц.
Благодарность
Студент медицинского факультета УЛГУ. Интересы: современные медицинские технологии, открытия в области медицины, перспективы развития медицины в России и за рубежом.
- Запись опубликована: 08.10.2019
- Reading time: 1 минут чтения
Ученые выяснили, как кишечные палочки защищаются от антибиотиков. Результаты не радуют.
Бактерии начинают и выигрывают
Многие больные страдают от повторяющихся инфекций мочевыводящих путей, несмотря на антибиотикотерапию. Дело в том, что возбудители научились защищаться от антибиотиков.
Кишечные палочки, вызывающие инфекции мочевыводящих путей в 61% случаев, обладают способностью проникать в мочевыделительную систему из кишечника. Во время антибиотикотерапии они меняют свои свойства, становясь шаровидными и неправильными L-формами без клеточных стенок.
Антибиотики пенициллин, амоксициллин, фосфомицин и другие убивают бактерии, блокируя клеточные стенки во время деления клетки. На измененные формы препараты не действуют.
В течение шести месяцев исследователи исследовали 360 образцов мочи больных, страдающих от повторных инфекций мочевыводящих путей. В моче 46% пациентов были обнаружены кишечные палочки сферической неправильной формы без клеточных стенок.
На момент трансформации кишечные палочки теряют активность, и симптомы инфекции исчезают. Больные считают, что выздоровели, но через некоторое время снова обретают клеточную стенку и палочкообразную форму. Симптомы инфекции возникают снова.
От временной потери клеточной стенки микробы только выигрывают. Таким образом, кишечные палочки избегают атаки иммунных клеток, которые теряют способность их распознавать.
Ученым придется изобретать новые лекарства
Поэтому назначение антибиотиков должно сопровождаться посевами мочи на чувствительность. Только так можно подобрать препарат, оказывающий максимальное лечебное действие.
Пока еще больным удается подобрать антибиотики, уничтожающие микроорганизмы, но такая возможность может скоро кануть в Лету.
Читайте также: