Основа агара для выделения трихомонад

Обновлено: 24.04.2024

Исследована зависимость между отсутствием выделения групповых агглютиногенов системы АВ0 и предрасположенностью к хроническому течению простатита трихомонадной этиологии. Установлено, что одним из важнейших факторов хронизации и рецидивов трихомонадного простатита является временная фиксация трихомонады к групповым агглютиногенам, выстилающим поверхность клеток уроэпителия. Данная фиксация защищает трихомонаду от иммунокомпетентых клеток и делает ее нечувствительной к большинству антипротозойных препаратов. Предложены медикаментозные средства, повышающие эффективность противотрихомонадной терапии.

Kлючевые слова: трихомониаз, хронизация, выделительство, агглютиногены, тенонитрозол.

Molecular factors of chronization of trichomonada prostatitis and medicines correcting it.

Іn the article is investigated dependence of absence secretion of AB0 system agglutinogens and predisposition to chronic current of trichomonada prostatitis is revealed. It is established that one of the major factors of chronization and relapses trichomonada prostatitis is temporary fixing of the trichomonad to group agglutinogens, covering a surface of uroepitelial cells. This fixing protects the trichomonad from immune cells and makes its tolerant to the majority of preparations. The medicamen-tous methods increasing efficiency of antiprotozoan therapy are offered.

Урогенитальный трихомониаз является одной из наиболее распространенных инфекций, передающихся половым путем (ИППП). Так, по данным ВОЗ, в мире ежегодно регистрируется 170 млн больных трихомониазом [11]. Ввиду деликатности заболевания и большого числа анонимных центров лечения ИППП истинную заболеваемость трихомониазом в Украине сложно определить. Косвенные данные (о продаже в Украине антитрихомонадных препаратов, за исключением препаратов метронидазола) позволяют утверждать, что ежегодное лечение получают приблизительно 2 млн. пациентов, что составляет около 6% сексуально-активного населения Украины. Данные, полученные при скрининговом обследовании студентов некоторых Харьковских учебных заведений, свидетельствуют о широком носительстве данной инфекции (до 9,7% обследованных) среди молодежи [8].

Трихомонада играет важнейшую роль в формировании микробиоценозов на слизистых оболочках половых путей. Tank-функция трихомонады – поглощение внутриклеточных хламидий, уреаплазм, микоплазм, вирусов с неполным фагоцитозом – делает ее основным звеном формирования микст-инфекции и полирезистентной микрофлоры половых путей. Учитывая комплексное воздействие трихомонады на половые пути мужчин и женщин (прямое секреторно-токсическое влияние на герминативный эпителий, противовоспалительные пролиферативные процессы, приводящие к обтурации придатков, семявыносящих канатиков и маточных труб), широкое носительство и распространение бессимптомных форм инфекции, трихомонада является в настоящее время одним из важнейших факторов мужского и женского бесплодия [7]. Соответственно лечение трихомонадной инфекции является актуальным вопросом современной урологии и андрологии.

Основной проблемой лечения инфекций мужского полового тракта (ИМПТ) трихомонадной этиологии являются хронические, рецидивирующие случаи заболевания. Kак правило, больные с такими формами инфекций прошли несколько курсов антипротозойной терапии, в результате чего трихомонада приобрела резистентность к большинству антитрихомонадных препаратов. Факторами, способствующими хронизации урогенитального трихомониаза, являются: наличие простатовезикулита, эпидидимита, короткие или недостаточные по количеству препарата предшествующие курсы лечения. Фактором, влияющим на хронизацию трихомонадной инфекции, также является степень выделительства групповых агглютиногенов системы АВ0 с мочой, спермой и другими биологическими жидкостями [2]. Секреторство или выделительство – аутосомно-доминантно наследуемый признак, который определяется наличием и титром во всех биологических жидкостях агглютиногенов системы АВ0. Общеизвестно, что наличие данных агглютиногенов на мембранах эритроцитов отмечается у всех людей и определяет соответствующую группу крови (0, А, В, АВ). Kроме того, известно, что у 85 % людей в популяции данные аглютиногены выделяются со всеми биологическими жидкостями (пот, слюна, желчь, моча, сперма). Такие люди являются секреторами или выделителями. Люди, у которых в указанных биологических жидкостях агллютиногены системы АВ0 не определяются называются несекреторами (невыделителями).

Исходя из возможной связи типа выделительства и склонности к хроническим заболеваниям мочеполового тракта, мы проанализировали взаимосвязь типа выделительства и характера течения инфекции мужского полового тракта [2, 3]. Нами выявлено, что мужчины-несекреторы более склонны к развитию ИМПГ, для них характерно торпидное, хроническое течение с частыми рецидивами, низкий уровень эрадикации возбудителей даже при использовании современнейших антибактериальных средств. Выделители же, напротив, реже болеют ИМПТ, для них характерно острое и подострое течение воспалительного процесса, более ранние cроки выздоровления, высокий процент эрадикации при стандартной терапии [3]. Таким образом, очевидно, что выделительство является протекторным фактором, защищающим от ИМПТ или в случае заражения от хронизации данных инфекций [5]. Соответственно тип выделительства агглютиногенов системы АВ0 можно использовать в качестве прогностического фактора для определения предполагаемого типа течения воспалительного процесса и оптимизации терапии [4, 6]. Использование иммуносерологических, гистохимических и имунофлюоресцентных методов позволило нам раскрыть природу этого протекторного эффекта. Оказывается, агглютиногены системы АВ0 определяются на поверхности клеток уроэпителия как сектреторов так и несекреторов, однако у несекреторов их гораздо меньше, то есть они не выполняют свою барьерную функцию. Kроме того, сила связи агглютиногена отличается от мембраны клетки уроэпителия у секреторов и несекреторов. У несекреторов она прочная, у секреторов – непрочная. Поэтому в момент заражения инфекционный агент вначале контактирует с выстилающими поверхность клетки агллютиногенами. И если у секретора происходит образование прочного комплекса инфекционный агент – агглютиноген, с последующим отрывом его от мембраны клетки уроэпителия, то у несекретора агент лишь временно фиксируется к агглютиногену и благодаря его прочной связи с мембраной клетки лишь фиксируется на поверхности клетки, производя инфицирование. Мало того, временная фиксация трихомонады агглютиногеном у несекреторов предохраняет его от воздействия иммунокомпетентных клеток и антипротозойных препаратов, что и приводит к низким результатам лечения ИМПТ (в первую очередь простатитов) у несекреторов [4]. Так, при использовании противотрихомонадных препаратов группы нитроимидазола в норме должно происходить следующее взаимодействие. Нитрогруппа молекулы, являющаяся акцептором электронов, встраивается в дыхательную цепь трихомонады (конкурирует с электронтранспортирующими флавопротеинами), что нарушает дыхательные процессы и вызывает гибель трихомонады [9]. Однако при временной фиксации трихомонад у несекреторов сульфгидрильными группами блокируются точки приложения нитроимидазолов, что делает их использование нерациональным. Таким образом, применение препаратов группы нитроимидазола (метронидазол, тинидазол, нитазол, ниморазол (Наксоджин), орнидазол (Тиберал, Мератин), секнидазол) малоэффективно при лечении пациентов-несекреторов с хроническими ИМПТ. Соответственно для лечения таких пациентов необходимы антитрихомонадные препараты других групп (не нитроимидазолов) и содержащие сульфгидрильные или тиоловые группы. Последние, конкурентно связываясь с сульфгидрильными группами агглютиногена у несекретора, открывают точки приложения антитрихомонадных препаратов, что приводит к гибели инфекционного агента. На сегодняшний день таковым препаратом является серосодержащий тенонитрозол (Атрикан) – производное тиазолила.

Соответственно целью нашей работы явилось исследование эффективности применения серосодержащего антитрихомонадного препарата (тенонитрозола) при хроническом простатите у пациентов-несекреторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

На базе андрологического отделения ХОKЦУН им. В.И. Шаповала было проведено комплексное обследование и лечение 96 мужчин с хроническими формами трихомонадного простатита. Все пациенты имели стаж заболевания более 2 мес, от 4 мес до 24 лет, в среднем 4,4±1,3 года. Больные до поступления в ХОKЦУН прошли, как минимум, один курс лечения, некоторые пациенты – 5 курсов антитрихомонадной терапии в различных лечебных учреждениях и анонимных кабинетах. Урогенитальный трихомониаз подтверждался рассевом на специальную среду. Пациентам выполняли клинические анализы крови, мочи, секрета предстательной железы, иммунологические анализы; УЗИ органов мочеполовой системы.

Основными жалобами пациентов были боль и дискомфорт в промежности, снижение потенции, дизурические жалобы.

У всех пациентов определяли степень выделительства. В качестве исследуемого материала использовали слюну ввиду простоты ее сдачи и высокого титра в ней агглютиногенов у секреторов.

Пациентам назначали комплексную терапию: атрикан в дозе по 1 капсуле 2 раза в день – группа А (32 человека) на 8 дней и 1 капсулу 3 раза в день при массе тела свыше 65 кг на 8 дней – группа Б (при массе тела до 65 кг атрикан в этой группе назначали по 1 капсуле 2 раза в день). Kроме того, пациентам назначали ферментую (Вобензим, Биозим), рассасывающую (Стекловидное тело, Экстракт алое), иммуномодулирующую (Циклоферон, Протефлазид, Тималин), органотропную (Витапрост, Простатилен) терапию, физиотерапию (магнитотерапия, электрофорез с лидазой). Учитывая хронический характер процесса, пациентам назначали ферменты (Вобензим, Биозим) и Ацетицилцистеин, контактирующие с сульфгидрильными группами агглютиногенов и способствующие открытию точек приложения антитрихомонадных препаратов [1, 10].

По показаниям применяли альфа-адреноблокаторы и противовоспалительные препараты.

Через 2 нед после окончания лечения пациенты после провокации (острая, соленая, жареная пища, алкоголь) сдавали повторно анализы методом культурального рассева и полимера зной цепной реакции.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В ходе исследования мы получили следующие результаты, представленные в табл. 1.

Таблица 1. Показатели клинико-лабораторных исследований пациентов с разной степенью выделительства на момент начала терапии

Группа Kол-во пациентов
(%)		 Лейкоциты,
х 10 9 		Лимфоциты, х 10 9 (%) Нейтрофильные гранулоциты,
х10 9 (%)		 Лимфоцито-токсические аутоантитела,% Т-хелперы
(СД4), %		 Т-супрессоры
(СД-8), %
Секреторы 15 (15,6%) 8,6±1,5 2,4±0,16 (28%) 5,4±0,5 (62,8%) 6,7±0,47 43,4±2,8 20,5±1,3
Слабые секреторы 23 (24%) 6,7±1,2 2,01±0,11 (31%) 3,6±0,5 (54%) 11,3±0,9 38,7±1,7 27,6±1,1
Несекреторы 58 (60,4%) 4,8±1,1 1,82±0,13 (38%) 2,25±0,3 (47%) 18,1±2,4 33,2±1,6 34,3±1,2
Норма 4,0±9,0 1,2-3,5 (19-38%) 2,0-5,5 (45-70%) до 10% 31-49% 19-37%

По данным табл. 1, очевидно, что среди обследованных пациентов с хроническими формами трихомонадной инфекции большинство составляют как раз люди-несекреторы – более 60%, в то время как в популяции их не более 15%. Для всех пациентов с хроническими формами характерны иммунологические признаки хронической инфекции: невысокое количество лейкоцитов в крови, относительный лимфоцитоз, высокий уровень лимфоцитотоксических аутоантител, особенно выраженный у пациентов-несекреторов (18,1%), низкий уровень Т-хелперов/Т-супрессоров (почти равный 1 у несекреторов).

Изложенные в табл. 2 данные свидетельствуют о широком распространении пролиферативных процессов (фиброз, уплотненная капсула, повышенная эхогенность) в предстательной железе у мужчин с хроническими формами трихомониаза, особенно выраженные среди пациентов-несекреторов (до 89,6%). Также среди несекреторов очень часты случаи простатовезикулита (до 74,2%), что является дополнительным фактором хронизации трихомонадной инфекции. Обратная корреляция степени выделительства и наличия везикулита (при которой среди невыделителей наибольшее количество случаев этого осложнения) свидетельствует об участии аггллютиногенов системы АВ0 в предохранении от распространения инфекции в семенные пузырьки, хотя механизмы указанной протекции еще требуют изучения.

Таблица 2. Ультразвуковые данные пациентов с простатитом с разной степенью выделительства

Группа Возраст, лет Размер
простаты,
см3		 Эхогенность, % Фиброз,
%		 Kапсула УЗИ-заключение
гипо изо гипер четкая,
% 		уплотнена, % признаки хронического простатита, % наличие везикулита, %
Секреторы 32,3±2,4 42,3±4,9 22,6 51,1 26,3 11,4 86,4 13,6 32,7 12,3
Слабые секреторы 34,8±3,7 36,5±5,8 14,5 64,8 20,7 42,1 47,4 52,6 53,6 36,3
Несекреторы 35,4±2,9 41,7±3,4 10,4 45,8 43,8 89,6 14,6 85,4 89,6 74,2

Результаты лечения в группах представлены в таблице 3.

Таблица 3. Результаты клинико-лабораторных исследований пациентов из групп с различными схемами приема атрикана

Группы Количество пациентов Отсутствие дискомфорта и боли в промежности, % Восстановление потенции, % Отсутствие дизурических явлений, % Лабораторный контроль излеченности, % отрицательных результатов
Группа А 33 75,7 60,6 90,9 84,8
Группа Б 65 92,3 76,9 96,9 95,4

Из данных табл. 2 видно, что рекомендуемая терапия с использованием Атрикана в обеих группах больных дает высокие результаты, однако в группе Б (1 капсула 3 раза в день) результаты клинических и лабораторных исследований существенно выше. При этом в группе Б удается достичь эрадикации трихомонад в 95,4% случаев, что является весьма высоким показателем в лечении больных с хроническими формами трихомонадной инфекции.

ВЫВОДЫ

  1. Пациенты-несекреторы имеют генетическую предрасположенность к хроническому течению трихомониаза с частым развитием фиброза предстательной железы и везикулита.
  2. Данная предрасположенность объясняется структурой и количеством агглютиногенов системы АВ0 на поверхности клеток уроэпителия.
  3. У несекреторов временная фиксация трихомонады сульфгидрильной группой агглютиногена на поверхности клеток предохраняет инфекционный агент от воздействия нитрогруппы препаратов группы нитроимидазолов.
  4. В лечении пациентов-несекреторов с хроническими формами трихомонадной инфекции следует использовать антитрихомонадные препараты с тиоловой группой, каковым является тенонитрозол (Атрикан).
  5. Для усиления действия тенонитрозола в схему лечения следует дополнительно включать ферменты (высвобожающие точки приложения антитрихомонадных препаратов и отрывающие комплекс агглютиноген-трихомонада от поверхности уроэпителия, способствуя удалению инфекционного агента из организма) и ацетилцистеин (донатор сульфгидрильных групп).
  6. Определение степени выделительства следует проводить перед терапией для отбора пациентов генетически склонных к хроническому течению трихомониаза и своевременной коррекции у них терапии.
  7. У пациентов с массой тела свыше 65 кг тенонитрозол следует применять в дозе 250 мг 3 раза в день.

Таким образом, мы рекомендуем проводить определение степени выделительства перед терапией для прогнозирования типа течения простатита трихомонадной этиологии. Kогда невозможно определить степень выделительства пациентов с длительным (более 2 мес) или рецидивирующим (прошедшим 1 и более курс лечения) трихомонадным простатитом следует считать невыделителями и проводить соответствующую терапию. В лечение таких пациентов необходимо включать серосодержащее антитрихомонадное средство тенонитрозол (Атрикан) в дозе 1 капсула 3 раза в день у лиц с массой тела более 65 кг, а также ферментные препараты и ацетилцистеин.

Эту среду с добавками используют для определения и выделения Candida albicans и Trichomonas vaginalis из клинического материала.

Состав**:

** Состав выверен и доведен до соответствия необходимым параметрам

Приготовление:

Размешать 37,5 г порошка в 920 мл стерильной дистиллированной воды. Прокипятить для полного растворения частиц. Стерилизовать автоклавированием при 1,1 атм (121°С) в течение 15 мин. Остудить до 50°С. Для диагностических исследований инактивировать 80 мл лошадиной сыворотки ( RM1239 ), довести ее рН до 6,0 и добавить в среду. Для повышения селективности среды в отношении трихомонад в нее вносят добавку FD094 .

Принцип и оценка результата:

Эта среда готовится в соответствии с прописью Файнберга и Виттингтона (1) для определения и выделения Candida albicans и Trichomonas vaginalis из клинического материала. Стентоном (2) было показана важная роль печеночного перевара для определения Trichomonas vaginalis. Небольшое количество агара помогает поддержать относительно низкий окислительно-восстановительный потенциал среды, который также благоприятен для роста Trichomonas vaginalis.

Хороший рост Trichomonas vaginalis можно получить и из смешанных культур. Среда одинаково подходит для посева мочи, тампонов с материалом из уретры или из влагалища.

Контроль качества:

Внешний вид порошка:

Гомогенный сыпучий порошок коричневато-желтого цвета.

Цвет и прозрачность готовой среды:

Среда имеет светло-янтарный цвет, слегка опалесцирует, вязкая.

Кислотность среды:

При 25°С водный раствор (3,75% вес/об) имеет рН 6,4 ± 0,2.

Культуральные свойства:

Ростовые характеристики референс-штаммов через 3-5 дней при 35°С.

Ссылки:

1. Feinberg J.G. and Whittington J.M., 1957, J. Clin. Path., 10:327.
2. Stenton P., 1957, J. Med. Lab. Technol., 14:228.

Условия и сроки хранения:

Порошок хранить при температуре ниже +25°С. Использовать до даты, указанной на этикетке. Готовую среду хранить при температуре +2…8°С.

ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва

ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, Санкт-Петербург

Сравнение пределов обнаружения микроскопии, культурального посева и методов амплификации нуклеиновых кислот, используемых в лабораторной практике для выявления Trichomonas vaginalis

Журнал: Клиническая дерматология и венерология. 2012;10(3): 16‑21

Гущин А.Е., Рыжих П.Г., Махлай Н.С. Сравнение пределов обнаружения микроскопии, культурального посева и методов амплификации нуклеиновых кислот, используемых в лабораторной практике для выявления Trichomonas vaginalis. Клиническая дерматология и венерология. 2012;10(3):16‑21.
Gushchin AE, Ryzhikh PG, Makhlaĭ NS. Comparison of detection limits of microscopy, culture, and nucleic acid amplification techniques using in the laboratory practice for the identification of Trichomonas vaginalis. Klinicheskaya Dermatologiya i Venerologiya. 2012;10(3):16‑21. (In Russ.).

Trichomonas vaginalis, простейшее, вызывающее урогенитальный трихомониаз, - одна из наиболее распространенных инфекций, передающихся половым путем. Классическими тестами, используемыми для обнаружения T. vaginalis, являются микроскопия и культуральный посев. Однако в последние годы все большую роль в диагностике инфекций играют методы амплификации нуклеиновых кислот, которые позволяют обнаружить возбудитель при минимальном его количестве. Представлены результаты интересной работы по установлению значения пределов обнаружения методов выявления T. vaginalis - микроскопии, культурального посева, полимеразной цепной реакции (ПЦР) и реакции транскрипционной амплификации (НАСБА), - используемых в лабораторной практике при диагностике мочеполового трихомониаза. Установлено, что среди методов выявления T. vaginalis наибольшей аналитической чувствительностью (наименьшим пределом обнаружения) обладают методы амплификации нуклеиновых кислот ПЦР и НАСБА на основе наборов реагентов Амплисенс, а наименьшей - микроскопические методы. Чувствительность культурального метода была выше, чем у метода микроскопии, но уступала методам амплификации ДНК и РНК.

ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва

ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, Санкт-Петербург

Цель настоящего исследования — установить значения пределов обнаружения методов выявления T. vaginalis – микроскопии, культурального посева, ПЦР и НАСБА, используемых в лабораторной практике при диагностике мочеполового трихомониаза.

Материал и методы

В общем виде схема исследования аналогична использованной в нашей предыдущей работе (П.Г. Рыжих, 2011).

Исследования образцов с помощью микроскопии. Для микроскопического исследования отбирали аликвоты по 10 мкл и готовили: 1) три нативных препарата, которые исследовали в течение 2—3 мин с момента приготовления, подсчитывали среднее количество подвижных клеток в 10—100 полях зрения при увеличении 400 (×400); 2) три препарата, окрашенных по методу Романовского—Гимзы, которые исследовали в течение суток с момента приготовления, и подсчитывали среднее количество клеток трихомонад в 10—100 полях зрения (×1000).

При проведении культурального исследования по 100 мкл аликвот из разведений суспензии трихомонад переносили в пробирки с 900 мкл соответствующей питательной среды. Для каждого варианта питательных сред готовили и исследовали по три образца из каждого разведения. Пробирки с питательными средами после внесения посевного материала сразу помещали в термостат для инкубации при 37±1 oC. Учет результатов проводили через 2, 4 и 7 сут. Наличие или отсутствие роста трихомонад определяли при микроскопии нативного материала из придонного слоя питательной среды. Учет результатов проводился на основании наличия подвижных клеток T. vaginalis при просмотре 10—20 полей зрения.

Результаты

В нашем исследовании мы впервые провели количественную оценку пределов обнаружения лабораторных тестов, используемых для выявления T. vaginalis на основе серийно выпускаемых и используемых в Российской Федерации наборов реагентов.

Для этого были приготовлены суспензия клеток трихомонад c известной исходной концентрацией (1,45±0,24)×10 6 клеток/мл, и 10-кратные разведения, из которых отбирались аликвоты, объемом, соответствующим протоколу используемого метода. Пределом обнаружения считали минимальную концентрацию простейших, при которой они обнаруживаются при использовании определенного метода.


Результаты выявления T. vaginalis разными методами представлены в таблице.

Оценивая результаты двух методов микроскопии, следует отметить, что при высокой (более 10 6 клеток/мл) концентрации клеток T. vaginalis в исходном образце в обоих случаях было выявлено достаточное содержание клеток в каждом поле зрения микроскопа и для интерпретации результатов достаточно было проанализировать не более 10 полей зрения.

При микроскопическом исследовании аликвот из разведения с концентрацией 10 5 клеток/мл приходилось просматривать больше полей зрения, и не в каждом из них обнаруживались клетки трихомонад. В среднем при микроскопии нативного препарата обнаруживались 1—2 клетки в поле зрения, при микроскопии окрашенного препарата — 2—3 клетки в поле зрения. Разведение клеточной суспензии до 104 клеток/мл привело к тому, что при анализе 100 полей зрения было обнаружено всего несколько клеток простейшего при микроскопии нативного препарата. Согласно существующим рекомендациям, положительным результатом теста считается наличие хотя бы одного подвижного простейшего при микроскопии нативного препарата или хотя бы одного простейшего с типичной морфологией T. vaginalis при микроскопии окрашенного препарата в одном из 5 полей зрения [2]. В реальной лабораторной практике клетки трихомонад располагаются среди большого количества других клеток организма человека (зрелые эпителиальные клетки и их предшественники, лейкоциты, макрофаги, клетки сперматогенеза, дрожжеподобные грибы и др.) и бактериальной микрофлоры, присутствующих в биологическом материале. Это приводит к трудностям в выявлении единичных клеток простейших. Таким образом, установленным нами пределом обнаружения микроскопического метода в условиях чистой культуры T. vaginalis следует считать значение более 10 5 клеток/мл, а при исследовании биологического материала от пациентов эта величина может быть больше.

При проведении культурального исследования нами были получены следующие результаты: при высокой концентрации клеток простейших в разведении (более 10 5 клеток/мл) после 2 сут инкубации на исследованных питательных средах во всех полях зрения микроскопа было зафиксировано более 200 клеток трихомонад. Причем содержание неподвижных клеток составляло не более 3—4%, что соответствует экспоненциальной фазе роста микроорганизма. При уменьшении концентрации клеток простейших в разведении до 104 клеток/мл через 4 сут культивирования на коммерческих питательных средах были выявлены единичные подвижные клетки T. vaginalis не в каждом поле зрения микроскопа. При содержании простейших в исследуемом разведении 10 3 клеток/мл, зафиксировано не более 1 клетки не в каждом поле зрения микроскопа только для среды СВТ через 4 сут культивирования. Дальнейшая инкубация образцов не приводила к увеличению содержания клеток, и через 7 сут культивирования в этих пробирках со средой СВТ были выявлены только неподвижные клетки трихомонад. На средах НПО Диагност-Мед и Himedia при данной посевной дозе через 96 ч культивирования выявлялись только единичные неподвижные клетки трихомонад.

При культивировании на питательной среде СВТ+L-41, даже если концентрация клеток простейших в разведении составляла 102 клеток/мл, в каждом поле зрения микроскопа насчитывалось более 200 особей. Разница была лишь в том, что указанный количественный уровень достигался за разное время культивирования — от 2 до 7 сут. Минимальная концентрация простейших в разведении, при которой наблюдался рост на среде СВТ+L-41, составила всего 10 клеток/мл.

Таким образом, установленный нами предел обнаружения культурального метода с использованием серийно производимых сред составил более 10 3 клеток/мл, а при культивировании T. vaginalis в питательной среде СВТ в присутствии клеточной линии L-41 предел обнаружения составил более 10 клеток.

При исследовании с использованием наборов реагентов для проведения ПЦР и НАСБА в реальном времени получены самые низкие значения пределов обнаружения. Для ПЦР предел обнаружения соответствовал разведению 1,45 кл/мл. Однако при данном разведении ДНК T. vaginalis детектировалась в 1 из 3, а РНК T. vaginalis - в 2 из 3 тестирований. Воспроизводимое при 3-кратных тестированиях обнаружение ДНК и РНК T. vaginalis было получено для разведения с концентрацией трихомонад более 10 клеток/мл.

Первое исследование, в котором была установлена прямая зависимость между количеством T. vaginalis в образце и диагностической чувствительностью микроскопического метода, — работа A. Philip и соавт. [8]. Авторы разработали методику культивирования T. vaginalis на агаризированной культуральной среде с подсчетом колониеобразующих единиц в 1 мл (КОЕ/мл). Используя эту методику, авторы определили содержание простейших у обследованных пациентов и сравнили полученные результаты с клиническим статусом и долей положительных результатов, полученных с помощью микроскопии. Содержание возбудителя в биологическом материале варьировало от 40 до 10 6 КОЕ/мл. Возбудитель обнаруживался микроскопически, если его содержание в биологическом материале превышало 10 5 КОЕ/мл. У пациентов, имеющих значения, превышающие этот порог, инфекция протекала преимущественно с клиническими проявлениями, и, наоборот, среди бессимптомных лиц преобладали те, у кого концентрация возбудителя была ниже порога обнаружения микроскопическим методом. Таким образом, было показано, что бессимптомная трихомонадная инфекция чаще всего сопровождается низким уровнем возбудителя в организме и, следовательно, хуже диагностируется с помощью микроскопии. Учитывая то, что для формирования колонии необходима как минимум одна живая клетка простейшего, то полученное авторами значение предела обнаружения метода микроскопии соответствует значению, полученному в нашем исследовании.

Протоколы культивирования T. vaginalis, применяемые в рутинной лабораторной практике, основаны на использовании бесклеточных питательных сред, производимых как серийно, так и в бактериологических лабораториях. ДЧ культурального метода может значительно варьировать в зависимости от состава питательной среды и качества ее компонентов. Тем не менее полученные нами результаты не выявили разницы между средами разных производителей. Предел обнаружения при культивировании T. vaginalis в питательных средах был ниже, чем при микроскопии, что, как уже было отмечено, и обеспечивало более высокую ДЧ культурального метода. В нашем исследовании для видимого роста возбудителя в среде необходимо, чтобы его концентрация была не меньше 10 3 клеток/мл. Данная величина предела обнаружения соответствует экспериментально установленному значению, полученному ранее [9]. Установлено, что для инициирования детектируемого роста культуры T. vaginalis, необходимо, чтобы в ней присутствовало не менее 3×10 3 клеток/мл простейших. В той же работе, как и в ряде других [10, 11], было показано, что для культивирования T. vaginalis cо значительно меньшей начальной концентрацией простейших необходимо наличие эукариотической клеточной линии (McCoy), которая создает условия, более близкие к естественной среде обитания трихомонад. В этом случае для начала роста культуры достаточно всего 2—3 клеток T. vaginalis. В нашем исследовании мы также оценивали эффективность культурального выявления трихомонад в присутствии клеточной линии (L-41). В результате предел обнаружения снизился до

14,5 клеток/мл, что полностью согласуется с данными G. Garber и других авторов. К сожалению, несмотря на столь высокую чувствительность метода культивирования T. vaginalis на эукариотических клеточных линиях, его применение в клинической лабораторной практике весьма проблематично.

Среди методов диагностики трихомонадной инфекции самая высокая диагностическая чувствительность принадлежит МАНК, которая обеспечивается самым низким пределом обнаружения возбудителя, что в свою очередь определяется рядом условий при разработке амплификационных методик. В частности, для выявления ДНК T. vaginalis разными вариантами ПЦР большое значение имеет выбор генетической мишени. Ранее было показано, что доля выявленных с помощью ПЦР случаев трихомонадной инфекции в значительной степени зависела от выбора генетической мишени для амплификации и структуры праймеров [12]. Наибольшей чувствительностью обладали методики, в которых использовали праймеры к генетическим повторяющимся элементам T. vaginalis, насчитывающие несколько сотен копий на геном простейшего [13].

Вывод

В результате исследования установлено, что среди методов выявления T. vaginalis, используемых в лабораторной диагностике трихомониаза, наибольшей аналитической чувствительностью (наименьшим пределом обнаружения) обладают методы амплификации нуклеиновых кислот ПЦР и НАСБА на основе наборов реагентов Амплисенс, а наименьшей аналитической чувствительностью — микроскопические методы. Чувствительность культурального метода была выше, чем метода микроскопии, но уступала методам амплификации ДНК и РНК.

Материалом для паразитологических исследований у женщин служит отделяемое из цервикального канала, смыв из влагалища и осадок мочи; у мужчин — отделяемое из уретры, центрифугат свежевыпущенной мочи, секрет предстательной железы и эякулят.

Накануне обследования женщинам в течение суток не рекомендуется делать спринцеваний. Материал для анализа берется у них со слизистой заднего свода влагалища. В некоторых случаях исследуется отделяемое из цервикального канала.

Мужчинам перед обследованием предлагается в течение 3-4 ч воздерживаться от мочеиспусканий. Материал из уретры у них забирается с глубины 5-7 см специальным зондом или ложкой Фолькмана. Исследуется также секрет предстательной железы и эякулят. Если речь идет о хронической трихомонаднои инвазии, накануне исследования рекомендуется сделать провокацию гоновакциной, пирогеналом или неспецифическую (алкогольную).

1.1. Диагностика мочеполового трихомониаза

Диагностика мочеполового трихомониаза проводится путем микроскопии нативных препаратов, а также мазков, окрашенных метиленовым синим, по Романовскому-Гимзе и по модифицированному способу Грама. Для обнаружения трихомонад в нативных препаратах исследуется эякулят, секрет предстательной железы и осадок мочи у мужчин и смыв из влагалища у женщин.

Исследование нативных препаратов

Нативные препараты готовятся и исследуются сразу же после взятия материала. Если это невозможно, материал помещается в питательную среду, обеспечивающую кратковременное сохранение трихомонад, из расчета 1 мл исследуемого материала на 5 мл среды. Материал должен быть доставлен в лабораторию в теплом виде, сроки доставки материала не должны превышать 2 часов.

Для приготовления препарата на предметное стекло наносится капля теплого изотонического раствора хлорида натрия или раствора Рингера-Локка, с которой смешивается исследуемый материал. Взвесь накрывается покровным стеклом и микроскопируется при увеличении объектива 40 и окуляра 7 или 10.

При изучении нативного препарата особое внимание обращается на размеры и форму трихомонад, характер их движения, внутреннее содержимое клеток. В типичных случаях трихомонады обнаруживаются в виде подвижных образований грушевидной, реже овальной формы, размером в среднем от 13 до 17мкм. Характер их движений толчкообразный. Иногда удается заметить движение свободных жгутиков. Ядра трихомонад чаще не обнаруживаются или плохо различимы. Цитоплазма трихомонад обычно зернистая, чаще вакуолизирована.

Размеры лейкоцитов, имеющих округлую, реже овальную форму, как правило, не превышают 10 мкм. Цитоплазма лейкоцитов прозрачна, зернистость обычно не отмечается или слабо выражена. Сегментоядерные нейтрофилы обычно содержат хорошо различимое сегментированное ядро.

Голые ядра эпителиоцитов отличаются от трихомонад относительно толстой оболочкой (кариолеммой) и иным характером зернистости (отдельные глыбки хроматина). В клетках молодого эпителия, даже если они по размерам соответствуют трихомонадам и обладают зернистостью, всегда прослеживается четко различимое округлое или овальное ядро.

В некоторых случаях обнаруживаются амебоидные формы Т. vaginalis, длина тела которых достигала 30 мкм, а также атипично делящиеся (почкующиеся) клетки. Основными дифференциально-диагностическими критериями, отличающими атипичных трихомонад от клеток эпителия и лейкоцитов, служат наличие в цитоплазме этих простейших выраженной зернистости и вакуолей, а также отсутствие хорошо различимого ядра. Кроме того, они значительно крупнее, чем наиболее часто встречающиеся форменные элементы — сегментоядерные нейтрофилы. По размеру такие трихомонады могут быть сопоставимы с моноцитами, которые, в отличие от них, имеют четко выраженное ядро и никогда не встречаются в значительных концентрациях (несколько клеток в каждом поле зрения). При отсутствии типичных форм клеток трихомонад диагноз трихомониаза может считаться лишь предположительным и должен подтверждаться другими методами.

Окраска метиленовым синим

Готовится 1% водный раствор метиленового синего. Высушенный на воздухе мазок фиксируется в течение 3 мин 96% этиловым спиртом, высушивается, после чего на него наносили на 1 мин раствор метиленового синего. Оставшийся краситель осторожно смывается слабой струей холодной воды и мазок высушивается.

Трихомонады в препарате имеют округлую или овальную форму, с интенсивно окрашенными в синий цвет ядрами; цитоплазма клеток светло-синяя, с нежной сетчатой структурой, вакуоли — бесцветны.

Окраска по Романовскому-Гимзе

Высушенный на воздухе мазок фиксируется смесью Никифорова (абсолютный этиловый спирт и эфир в соотношении 1:1). Раствор краски Романовского (азур-эозин) перед употреблением разводится дистиллированной водой в соотношении 0,3 мл на 10 мл воды и пипеткой наносится на горизонтально расположенные препараты на 30-40 минут. Затем они быстро промываются водой и высушиваются.

В окрашенных препаратах трихомонады имеют эксцентрично расположенное овальное пурпурно-фиолетовое ядро. Цитоплазма клеток окрашивается в светло-синий цвет, вакуоли остаются бесцветными, оболочка клеток четко заметна.

Окраска по модифицированному способу Грама

Для окраски используются следующие реактивы:

  1. 1% раствор генцианвиолета (1 г генцианвиолета растворяется в 100 мл кипящей дистиллированной воды, полученный раствор пропускается в горячем виде через бумажный фильтр).
  2. Водный раствор Люголя (2 г калия йодида растворяется в 300 мл дистиллированной воды, к полученному раствору добавляется 1 г чистого йода, после чего раствор фильтруется через бумажный фильтр).
  3. 3,96% этиловый спирт.
  4. 1% водный раствор нейтрального красного (1 г нейтрального красного растворяется в 100 мл дистиллированной воды и пропускается через бумажный фильтр).

Препарат накрывается полоской фильтровальной бумаги и заливается раствором генцианвиолета на 1-2 мин, после чего бумага снимается, препарат осторожно промывается водопроводной водой и на несколько секунд заливается раствором Люголя (до почернения мазка). Остаток раствора смывается, препарат обесцвечивается в 96% этиловом спирте до тех пор, пока с тонких участков препарата перестают стекать фиолетовые струйки. После смывания спирта водой препарат сразу же докрашивается в течение 3 мин раствором нейтрального красного, затем тщательно промывается и высушивается.

При микроскопии окрашенных мазков ядра клеток Т. vaginalis окрашиваются в фиолетовый цвет, цитоплазма — в красно-оранжевый цвет разной интенсивности. Метод окраски по Граму позволяет также диагностировать гонорею. В некоторых случаях для подтверждения диагноза трихомониаза используется ПЦР и культуральный метод.

Культуральный метод

Нами Т. vaginalis выращивается на питательной среде СДС-199 М (Захаркив Ю. Ф. и др., 1998), которая имеет следующий состав:

  1. 100 мл солевого раствора (натрия хлорида 6,5 г, калия хлорида 0,14 г, кальция хлорида 0,12 г, натрия бикарбоната 0,2 г, 0,5 мл 0,2% раствора метиленового синего, дистиллированной воды до 1 л);
  2. 20 мл среды 199;
  3. 450 мг солянокислого цистеина;
  4. 30 мл сыворотки крови эмбрионов телят (без консерванта);
  5. 10 мл 20% раствора мальтозы;
  6. тиамина хлорида 5% и пиридоксина гидрохлорида 5% по 0,25 мл и аскорбиновой кислоты 5% — 0,5 мл на 100 мл среды;
  7. ампициллина натриевой соли 125 000 ЕД и гентамицина 40 000 ЕД на 100 мл среды.

Солевой раствор автоклавируется при 120°С в течение 30 минут, остальные ингредиенты добавляются стерильно после охлаждения среды. Антибиотики и витамины добавляются в питательную среду непосредственно перед использованием. Среда должна быть светло-зеленого цвета, прозрачной; показатель рН среды должен составлять 5,5-6,0.

Питательная среда объемом 4,5 мл помещается в стерильные пробирки и заливается слоем стерильного вазелинового масла толщиной 5 мм для создания анаэробных условий культивирования трихомонад. Посев производится пастеровской пипеткой путем помещения 0,5-1,0 мл исследуемого материала на дно пробирок.

Микроскопическое исследование производится через 48 и 96 часов после посева. При положительных результатах трихомонады дают придонный рост в виде плотного беловатого осадка, из которого пастеровской пипеткой берется материал для микроскопического исследования.

2. Определение чувствительности Trichomonas vaginalis к метронидазолу

В 1962 году S. Squires and J. A. Fadzean для определения чувствительности Т. vaginalis предложили метод серийных разведений метронидазола в жидкой питательной среде в анаэробных условиях. В качестве критерия оценки чувствительности они использовали минимальную ингибирующую концентрацию (MIC), под которой понимали наименьшую концентрацию препарата, вызывающую иммобилизацию у 100% клеток трихомонад. С помощью указанной методики авторам удалось показать, что все изученные ими штаммы Т. vaginalis, выделенные от больных трихомониазом, были чувствительны к метронидазолу в диапазоне концентраций препарата от 0,25 до 1 мкг/мл.

В 90-х гг. появились работы, свидетельствующие о возникновении и распространении штаммов Т. vaginalis, устойчивых к значительно более высоким концентрациям метронидазола: 50 мкг/мл (Borchardt К. А. et al, 1995), 32 мкг/мл (Debbia E. A. et al., 1996) и даже 250 мкг/мл (Таги Meri I. Т. et al., 1999). Тогда же было обосновано положение о том, что чувствительными к действию метронидазола в анаэробных условиях штаммами Т. vaginalis следует считать лишь те, для которых паразитоцидный эффект препарата наблюдается в концентрации более чем 15 мкг/мл (Muller M. et al., 1986, 1988; Тага Meri I. Т. et al., 1999). Процент резистентных к метронидазолу штаммов Т. vaginalis, выделенных в эти годы от больных трихомониазом, колебался от 5% (Narcisi Е. М., Secor W. Е., 1996) до 20% (Du Bouchet L. et al., 1997).

2.1. Определение чувствительности Trichomonas vaginalis к антипротозойным препаратам in vitro при использовании критерия иммобилизации трихомонад

Чувствительность штаммов Т. vaginalis к метронидазолу определяется с помощью метода серийных разведений препарата в питательной среде СДС-199 М. При использовании критерия оценки чувствительности штаммы Т. vaginalis, используемые для исследования, должны содержать не менее 90% подвижных клеток.

Среда заливается по 4,0 мл в стерильные пробирки, затем в них вносится 0,5 мл раствора, содержащего разные концентрации метронидазола (или другого антипротозойного препарата): от 0,25 до 1000 мкг/мл (1 мг/мл).

После этого в пробирки вносится 0,5 мл культуры возбудителя с заранее определенной концентрацией клеток (кл./мл). Контролем служит среда без препарата. Затем для создания анаэробных условий, необходимых для культивирования Т. vaginalis, в пробирки со средой вносится вазелиновое масло (толщина слоя — 0,5 мм). Пробирки с исследуемым материалом инкубируются в термостате при t = 37°С. Учет результатов производится через 48 и 96 часов после посева.

Чувствительность трихомонад к метронидазолу оценивается путем определения минимальной ингибирующей концентрации (MIC), вызывающей иммобилизацию всех клеток Т. vaginalis. К лекарственно-устойчивым относятся штаммы, у которых иммобилизация обнаруживается при концентрациях метронидазола (или другого антипротозойного препарата), превышающих 15 мкг/мл.

2.2. Определение чувствительности Trichomonas vaginalis к антипротозойным средствам in vitro при использовании критерия лизиса трихомонад при терапевтически эффективных концентрациях препаратов

В связи с широким распространением штаммов Т. vaginalis, устойчивых к метронидазолу, особенно среди больных хроническим мочеполовым трихомониазом, а также высокой частотой встречаемости амастиготных клеток, мы предлагаем оценивать чувствительность трихомонад к широкому спектру антипротозойных препаратов (производным 5-нитроимидазола пролонгированного типа действия (тинидазол, ниморазол, орнидазол и секнидазол), 4-аминохинолина (хлорохин, син. делагил) и нитрофурана (нифуратель, син. макмирор)) на основе оценки лизиса клеток трихомонад.

К высокоустойчивым (RIII) относятся штаммы, концентрация клеток которых в опытных пробирках с антипротозойным препаратом составляла не менее 50% по сравнению с контролем; к умеренно устойчивым (RII) — от 25 до 50%, к низкоустойчивым (RI) — менее 25%. Воздействие препарата считается оптимальным при лизисе всех клеток трихомонад; в этом случае штамм относится к чувствительным (S). По нашему мнению, именно такой подход позволяет подобрать препарат или комбинацию препаратов для назначения рациональной схемы этиотропной терапии.

2.3. Определение чувствительности Trichomonas vaginalis к метронидазолу in vivo и текущий контроль эффективности этиотропной терапии

Определение чувствительности Т. vaginalis к метронидазолу in vivo проводится с помощью метода, основанного на установлении сроков исчезновения паразитов из исследуемого материала у больных трихомониазом на фоне этиотропной терапии. Паразитологические исследования материала проводят на 1,3, 5 и 7-й дни с момента начала лечения. Лекарственно-чувствительными считаются штаммы, которые перестают выделяться от больных на 2-5-е сутки с момента начала этиотропной терапии.

Читайте также: