Отбор проб почвы для бактериологического исследования на сибирскую язву
Обновлено: 18.04.2024
Медицинская микробиология:
Отбор проб почвы для микробиологического исследования
При выборе места для отбора проб почвы с целью санитарно-микробиологического анализа необходимо знать особенности топографии местности, почвенного и растительного покрова (тип, механический состав, рельеф и т. п.), климата, размеры исследуемой территории, наличествует или отсутствует на участке канализация, расстояние от источников загрязнения воды и почвы, характер землепользования.
Если нет особых указаний, на обследуемой территории до 1000 м 2 выделяют два участка по 25 м 2 . Один должен быть расположен вблизи источников загрязнения (свалки, выгребные ямы, мусорные ящики и пр.), а другой—в отдалении от них (контроль). Если па исследуемом участке имеется несколько источников загрязнения, то выделяют участки около каждого из них. При отсутствии видимых источников загрязнения выделяют участки на каждом элементе рельефа изучаемой земельной площади.
Если обследуются значительные территории, то на каждые 100 га при спокойном рельефе местности намечают для отбора проб почвы 6-7 участков площадью по 25 м 2 .
На каждом участке намечают пять точек по диагонали или четыре — по углам и одну в центре участка. В соответствии с этим отбирают 10 проб (из разных мест исследуемой территории). Почву берут стерильным ножом, лопатой или совком на глубине до 20 см (иногда из более мелких слоев — до 10 см или более глубоких). Образец массой 200-300 г помещают в стерильную банку или чистый прочный полиэтиленовый пакет и хорошо перемешивают. Следовательно, смешанный образец с каждого из двух выбранных участков должен иметь массу не менее 1 кг. Банки или пакеты закрывают и снабжают этикетками со сведениями об отобранных в них пробах.
Образцы из глубоких слоев почвы (0,75-2,0 м) берут буром (почвенный бур Некрасова и др.). При отсутствии бура делают разрез до нужной глубины и стерильной лопаткой или ножом отбирают несколько образцов почвы с отвесной стороны ямы соответственно каждому горизонту. Пробы отбирают осторожно от нижнего горизонта к верхнему, чтобы не смешать их с вышележащими слоями почвы.
При отсутствии достаточного количества стерильных инструментов для отбора проб необходимо перед взятием каждого нового образца почвы инструмент обмыть, обтереть спиртом и затем обжечь.
Отобранные пробы анализируют в тот же день. Допускается хранение образцов почвы в лаборатории не более 24 ч в холодильнике при температуре 1-5 °С. Более продолжительное хранение обесценивает результаты анализа.
Подготовка почвы для анализа. Образцы почвы освобождают от крупных включений (корни, щебень, стекло и т. п.), крупные почвенные агрегаты дробят. Почву доводят до воздушно-сухого состояния, тщательно перемешивают и высыпают на стерильную бумагу. Затем готовят средний образец почвы одного участка массой 0,5 кг. Отобранную почву тщательно размельчают и просеивают через стерильное сито (размер ячеек 3 мм), высыпают на стерильную бумагу, хорошо перемешивают. Готовят навеску (30 г) и вносят ее в стерильную чашку с гладкой поверхностью.
Почву растирают с 10-15 мл стерильной воды, которую отливают из колбы, содержащей 270 мл стерильной водопроводной воды. После растирания в течение 5 мин почву переносят в упомянутую колбу с водой. Почву, оставшуюся на чашке, смывают в колбу водой, которую берут из нее же. Затем колбу с почвой тщательно встряхивают в течение 10 мин (или обрабатывают 3 мин на мешалке механического диспергатора—размельчитель тканей РТ-2 идр.). Из полученной суспензии без отстаивания готовят разведения. Из первоначальной взвеси (1:10) отбирают стерильной пипеткой 1 мл и вносят в пробирку с 9 мл стерильной водопроводной воды, тщательно перемешивают.
Из полученного разведения почвы (в 100 раз) готовят таким же образом последующие разведения (10 -3 , 10 -4 , 10 -5 , 10 -6 , 10 -7 ). Причем для приготовления каждого нового разведения необходимо использовать свежую стерильную пипетку. Таким образом, 1 мл взвеси 1:10 соответствует 0,1 г почвы, 1 мл разведения 1:100-0,01 г и т. д.
В ряде лабораторий для приготовления исходной суспензии (1:10) используют навески от 1 до 10 г и соответствующее количество стерильной воды. Полученная взвесь встряхивается в течение 10 мин (или 3 мин на мешалке) и немедленно используется для приготовления разведений, как описано выше.
Методические рекомендации по отбору проб почвы для бактериологического исследования на наличие возбудителя сибирской язвы и актиномицетов-антагонистов
(утв. Министерством здравоохранения СССР 27 сентября 1984 г.)
Введение
Возбудитель сибирской язвы, попадая в почву, на протяжении многих десятилетий не только сохраняется, но и накапливается за счет многократных вегетаций и споруляций. При этом состояние инфицированности почвы представляет собой явление динамическое, подверженное изменчивости во времени количественном и качественном отношении под влиянием меняющихся условий окружающей среды. Наиболее благоприятными являются следующие физико-химические характеристики почв: температура не ниже 12-15°С, влажность в пределах 29-85%, рН - 5,3-7,3; наличие 1-14% гумуса, присутствие 14-38 мг фосфора 6-18 мг калия на 100 г почвы. В зависимости от перечисленных и целого ряда других факторов (антропогенное воздействие, наличие актиномицетов-антагонистов, влияние ризосферы высших растений) происходит накапливание возбудителя сибирской язвы в почве или сохранение единичных микробов с измененными культурально-морфологическими свойствами и сниженной вирулентностью.
Возбудитель сибирской язвы преимущественно находится в почве на глубине от 1,2 до 2 м, так как именно на этом уровне осуществлялось в прошлом захоронение трупов сибиреязвенных животных. В результате ливневых паводковых потоков, эрозионных процессов или антропогенного воздействия возможен вынос возбудителя в поверхностный слой почвы, составляющий до 40 см и наиболее опасный в эпизоотическом и эпидемическом отношении. Кроме того, поверхностное загрязнение почвы происходит при падеже и вынужденном убое сибиреязвенных животных.
Систематическое бактериологическое исследование почвы в местах падежа, вынужденного убоя или захоронения сибиреязвенных животных является важным моментом в системе противоэпидемических мероприятий и позволяет осуществлять оперативное слежение за состоянием очагов сибирской язвы.
До настоящего времени отсутствуют унифицированные подходы к отбору проб почвы и соблюдению противоэпидемического режима при работе на участках, зараженных возбудителем сибирской язвы.
В настоящих методических рекомендациях излагаются методика отбора проб почвы с применением бура Малькова модифицированного авторами, меры личной профилактики, способы обеззараживания инструментария и остатков проб почвы.
Методика отбора проб почвы для бактериологического исследования на наличие возбудителя сибирской язвы и актиномицетов-антагонистов
Отбор проб почвы для бактериологического исследования на участках захоронения, в местах падежа или вынужденного убоя сибиреязвенных животных проводится по эпидемиологическим показаниям, а также при осуществлении динамического наблюдения за очагом. При контроле активности очага в местах захоронения отбор проб почвы следует проводить в летне-осенний период, наиболее благоприятный для вегетации возбудителя сибирской язвы. Необходимо максимально охватывать исследованиями весь участок очага как по площади, так и по глубине. Так как вероятность бактериологической находки возбудителя сибирской язвы в местах захоронения составляет 1-2%, число проб из одного очага должно составлять не менее 100.
Работа по отбору проб проводится в защитном костюме II типа с применением дезинфицирующих средств.
Бригада отборщиков проб почвы состоит из двух человек. К месту отбора проб она направляется на выделенном транспорте со специальной укладкой (приложенеие 1).
1. На территории очага выбирается участок размером от 8 до 16 м в зависимости от площади захоронения.
2. Намечаются 5 точек отбора проб почвы (4 точки по углам и одна в центре) при отборе проб почвы на глубину до 2 м или 6 точек (4 точки по углам и две в центре) при отборе проб на глубину до 1,6 м. При захоронении сибиреязвенных животных в траншеи отбор проб необходимо проводить в 5 или 6 точках (в зависимости от глубины отбора проб), расположенных по ходу траншеи.
3. Совком (ножом) производится расчистка намеченных точек отбора проб от мусора, листьев и травы.
4. Отбор проб почвы осуществляется при помощи модифицированного бура Малькова (приложение 2).
5. У места отбора проб почвы расстилается полиэтиленовая пленка размером не менее 100x100 см, над которой отобранная почва ссыпается в мешочки.
6. По эпидпоказаниям (при падеже или прирезке сибиреязвенного животного) определяется поверхностное загрязнение почвы возбудителем сибирской язвы путем отбора проб в каждой намеченной точке на глубине до 40 см. При этом количество проб составляет не более 20.
При динамическом наблюдении за очагом (в местах захоронения сибиреязвенных животных) отбор проб почвы производится на глубине 1,6-2 метров через каждые 10 см (рис.1).
7. Вес каждой пробы, взятой в одной точке отбора, должен быть равен 40-50 г (2 столовых ложки).
8. Отобранные на каждой глубине из 5 или 6 точек пробы объединяются в один матерчатый мешочек, на котором простым карандашом отмечается глубина отбора пробы (10, 20, 30 см и т.д.). Полиэтиленовые мешочки не используются, так как это может привести к гибели возбудителя или изменению его свойств.
9. Пробу почвы для лабораторного исследования на наличие актиномицетов-антагонистов следует отбирать в одной из пяти точек на глубине 20 см весом 10 г в отдельный полиэтиленовый мешочек с целью создания благоприятных условий для сохранения и накопления актиномицетов-антагонистов.
10. Для определения химического состава почв пробу весом 100 г отбирают в матерчатый мешочек в одной точке на глубине 20 см на контрольном участке с однотипной структурой почв, расположенном в 100 м от скотомогильника.
11. Пронумерованные мешочки с пробами почвы для исследования на наличие возбудителя антракса помещают по 5-6 штук в металлические пеналы. В один из этих пеналов помещают пробу почвы, предназначенную для исследования на наличие актиномицетов. Пробу для химического анализа помещают в отдельный пенал.
12. После отбора проб остатки почвы, находящиеся на полиэтиленовой пленке, ссыпают в образовавшиеся шурфы. Сверху засыпают хлорной известью (200 г на каждый шурф) и увлажняют. Использованную полиэтиленовую пленку протирают ветошью, смоченной в 6% растворе перекиси водорода с 0,5% раствором моющего средства.
13. Пеналы с наружной стороны обрабатывают 6% раствором перекиси водорода с 0,5% раствором моющего средства.
Микробиологическая диагностика сибирской язвы. Принципы микробиологической диагностики сибирской язвы. Бактериоскопический, бактериологический, биологический, кожно-аллергический метод диагностики сибирской язвы.
Для микробиологической диагностики сибирской язвы берут содержимое пустулы, гнойное отделяемое из карбункула, кровь, мочу, мокроту, испражнения и рвотные массы. При патологоанатомическом исследовании забирают кусочки органов или целые органы. Все образцы следует помещать в герметичные сосуды и транспортировать закупоренными в опломбированные боксы или деревянные ящики.
Выделение возбудителя сибирской язвы. Проводят окраску материала по Граму и посев на обычные питательные среды. Затем определяют подвижность микроорганизмов из выросших колоний, изучают их биохимические и культуральные свойства. Серологические исследования проводят для распознавания больных и реконвалесцентов. Возбудитель сибирской язвы можно выявлять AT, меченными флюоресцеинами (особенно в смешанных культурах), диффузией в геле, в РСК, РИГА и ИФА.
Кожные пробы применяют для ретроспективной диагностики при эпидемиологических исследованиях. Проводят внутрикожное введение 0,1 мл бактериального аллергена (антраксина).
Реакция термопреципитации по Асколи имеет большое значение, так как позволяет идентифицировать возбудителей сибирской язвы при отрицательных результатах бактериологических исследований. Для прижизненной же диагностики эта реакция не имеет серьёзных преимуществ перед вышеуказанными бактериологическими и серологическими методами.
Биологическая проба при диагностике сибирской язвы. Заражение лабораторных животных проводят одномоментно с посевом на питательные среды. Материал можно вводить белым мышам (по 0,1-0,2 мл в спину), кроликам и морским свинкам (по 0,2-0,5 мл в область живота). Обычно мыши погибают через 1-2 сут, морские свинки и кролики— через 2-4 сут. При выживании животных наблюдение за ними продолжают в течение 10 дней. У павших животных исследуют печень, селезёнку, лимфатические узлы, почки, кровь из полостей сердца и места введения заразного материала. Затем проводят посев исследуемого материала на питательные среды.
Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.
Медицинская микробиология:
Лабораторная диагностика сибирской язвы: взятие материала
Исследование на сибирскую язву включает микроскопию мазков из исходного материала, высевы на питательные среды, постановку тестов идентификации, метод флюоресцирующих антител, ПЦР (полимеразно-цепную реакцию), постановку биопробы и, при необходимости, реакции преципитации. У человека, кроме того, необходима постановка клинической кожно-аллергической пробы с сибиреязвенным аллергеном антраксином.
а) Взятие материала от животных. Для бактериологического исследования в лабораторию направляют ухо или мазок крови, полученный из надреза уха. Ухо отрезают с той стороны, на которой лежит труп. Предварительно его туго перевязывают шпагатом у основания в двух местах и отрезают между лигатурами. Место отреза уха на трупе прижигают. Отрезанное ухо заворачивают в пергаментную бумагу, смоченную в дезинфицирующем растворе. Если подозрение на сибирскую язву возникло при вскрытии трупа животного, вскрытие прекращают и на исследование направляют часть селезенки, от трупов свиней — участки отечной соединительной ткани, заглоточные, подчелюстные, а также другие лимфатические узлы.
б) Взятие материала от человека. Для бактериологического исследования забор материала у больных должен производиться по возможности до начала лечения. При кожной форме заболевания необходимо осторожно обработать спиртом кожу вокруг пораженного места и поверхность карбункула. Затем содержимое везикулы отсасывают стерильным шприцем, отделяемое язвы снимают с поверхности стерильным тампоном, смоченным физиологическим раствором, фрагменты отторгнутого струпа снимают влажным тампоном или пинцетом. При всех формах заболевания берут кровь в объеме 1-2 мл из вены. 1-2 капли крови непосредственно у постели больного засевают на питательные среды (агар и бульон Хоттингера, pH 7,2-7,5). При висцеральных формах сибирской язвы и менингите отбирают спинномозговую жидкость в количестве 0,5 мл в стерильную пробирку.
При подозрении на ингаляционное заражение исследуют также мазки из полости носа. Их берут сухими стерильными ватными тампонами на зондах. Тампон вводят легким движением по наружной стенке полости носа на глубину 2-3 см до нижней раковины. Затем его слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход под нижнюю раковину, делают вращательное движение и удаляют вдоль наружной стенки носа. После забора материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную одноразовую пробирку с физиологическим раствором. Погрузив рабочую часть зонда в физраствор, вращают зонд в течение 10-15 с, избегая разбрызгивания раствора. Вынимают зонд из раствора, прижимая его к стенке пробирки, и, отжав избыток жидкости, удаляют зонд и закрывают пробирку.
Транспортирование материала для исследования методом ПЦР осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом при температуре 2-8°С в течение 6 ч (кровь — в течение 1 сут., плазму и сыворотку — в течение 3 сут.), в замороженном виде — в течение 1 сут. Недопустимо замораживание образцов цельной крови.
в) Взятие материала из сырья животного происхождения и из объектов внешней среды проводится в тех случаях, когда необходимо установить источник инфекции или фактор передачи для выявления обсемененности спорами возбудителя сибирской язвы отдельных объектов, а также в целях обнаружения микроба в местах старых скотомогильников при проведении строительных, мелиоративных, гидротехнических и других работ, связанных с выемкой и перемещением грунта.
г) Отбор проб шерсти. Для исследования шерсть отбирают из разных мест не менее 5 образцов массой около 2 г каждый (лучше брать пучки загрязненной шерсти). Если шерсть упакована в кипы, берут не менее 10 образцов из разных мест каждой кипы, а также скопившуюся внутри обшивки пыль. Образцы от одной кипы объединяют и упаковывают вместе.
д) Отбор проб кожи. Берут кусочки кожи размером 3x3 см с периферических участков шкурок. При наличии на внутренней стороне шкурки кровоподтеков или инфильтратов пробы берут и в этих местах.
е) Отбор проб почвы. Пробы почвы с мест вероятного обсеменения спорами возбудителя (мест вынужденного убоя скота, стоянок и водопоя животных) берут на глубине до 15 см, на территории скотомогильников — на глубине до 2 м при помощи почвенных буров.
ж) Смывы с объектов внешней среды. Смывы делают с мест наиболее вероятного обсеменения спорами возбудителя при помощи стерильного тампона, смоченного стерильной водой. Площадь смыва одним тампоном — около 100 см 2 . Тампоны затем помещают в пробирки, заливают стерильной водой (5 мл) и закрывают пробкой.
Отбор проб для исследования методом ПЦР осуществляется аналогично.
В сопроводительном документе к пробам указывают причину проведения исследования, какой материал и в каком количестве направляют, место и дату отбора материала; для проб шерсти и кормов дополнительно указывают происхождение, объем партии, вид упаковки и количество упаковочных единиц. К сопроводительному документу прилагают опись проб и место каждой пробы.
и) Подготовка проб к бактериологическому исследованию. Кусочки органов и тканей от трупов помещают в ступку, измельчают ножницами или пестиком, затем заливают 1-5 мл физиологического раствора, суспензию через марлевый тампон набирают в шприц или пастеровскую пипетку и переносят в пробирку или колбочку.
Воду с илистыми частицами фильтруют через 2 слоя марли, чистую воду исследуют без предварительной подготовки. С целью концентрирования микробов пробы воды можно профильтровать через мембранные фильтры (№3). Осадок с каждого фильтра соскабливают скальпелем, затем смывают 1-2 мл физиологического раствора и эту взвесь используют для исследования.
Тампоны, которыми делают смывы с объектов внешней среды, отжимают о стенки пробирки и удаляют, а оставшуюся жидкость подвергают исследованию.
Пробы почвы освобождают от корней, камешков и тщательно перемешивают. От каждой пробы берут 90-100 г почвы, помещают в колбу, заливают физиологическим раствором или дистиллированной водой из расчета получения 15-20 мл суспензии. Колбу закрывают, тщательно встряхивают в течение 25 мин, дают отстояться 1-2 мин и надосадочную жидкость переносят в пробирку для дальнейшего исследования. Пробы пищевых продуктов или кормов готовят аналогично.
Для проб из шкур кусочки массой 1 г помещают в фарфоровую ступку и заливают 1-2 мл физиологического раствора. Кусочки измельчают ножницами и оставляют при 20°С на 2-3 ч для размягчения материала. После этого пробы хорошо растирают пестиком в той же жидкости до получения волокнистой мезги, затем мезгу удаляют, предварительно отжав ее пестиком на внутренней боковой поверхности ступки.
От каждой пробы шерсти отбирают наиболее загрязненные части, измельчают ножницами, вместе с пылью помещают в колбу и заливают физиологическим раствором. Колбу закрывают, тщательно встряхивают в течение 10 мин, от грубых частиц можно освободиться путем фильтрации через 2-3 слоя марли.
Для избавления от посторонней микрофлоры пробы из объектов внешней среды, шерсти и кожи, пищевых продуктов подвергаются термической обработке на водяной бане при 80°С в течение 20 мин. Пробы от больного человека и животного из патологического материала, мяса животных и пр., где возбудитель сибирской язвы находится в вегетативной форме, не прогревают.
к) Предварительная обработка проб для исследования при помощи ПЦР. Для получения сыворотки пробирки с кровью отстаивают при комнатной температуре в течение 30 мин до полного образования сгустка. После этого сгусток обводят пастеровской пипеткой и оставляют при комнатной температуре до образования сыворотки. Затем сыворотку в объеме 1 мл переносят отдельными наконечниками с аэрозольным барьером или пастеровскими пипетками в стерильные пробирки объемом 1,5 мл. Сыворотка, содержимое везикул, отделяемое язв, фрагменты отторгнутого струпа, мазки из полости носа и спинномозговая жидкость не требуют предварительной обработки. Воду, смывы с объектов внешней среды, пробы почвы, пищевых продуктов или кормов, шкур, шерсти предварительно обрабатывают так же, как для бактериологического исследования, отбирая для исследования методом ПЦР 0,1-0,2 мл водной фазы образцов.
Читайте также: