Пцр в диагностике микозов

Обновлено: 28.03.2024

Медицинская микробиология:

Иммунологический метод и ПЦР диагностика микозов (грибковой инфекции)

Диагностическая ценность иммунологических тестов возрастает при висцеральных микозах из-за трудности выделения тканевых форм возбудителей. Традиционные микологические методы (микроскопия, посев, гистологическое исследование) нередко недостаточно чувствительны и не всегда специфичны. Они могут потребовать длительного времени, а для получения материала может быть необходимо проведение инвазивных процедур. При диагностике микозов среди различных иммунологических методов исследования наибольшее распространение получили реакция связывания комплемента (РСК), реакция иммунодиффузии (РИД), иммуноэлектрофореза (ИЭФ). С помощью иммунодиагностики можно проводить мониторинг эффективности проводимого лечения по снижению титров антител. Для более точной диагностики рекомендуется параллельно использовать несколько методов.

Однако все серологические методы по определению вида и титра специфических антител в крови имеют ограничения в возможности диагностики заболевания. Так, их специфичность и чувствительность зависят от качества и стандартизации антигенных препаратов. Наличие перекрестных реакций может давать ложноположительный ответ, а в случаях снижения или отсутствия иммунного ответа у иммуносупрессированных пациентов — ложноотрицательный. В данной области чувствительные и специфичные стандартизованные серологические методы разработаны лишь для криптококкоза, инвазивного аспергиллеза и эндемичных микозов (кокцидиоидоз, гистоплазмоз, бластомикоз, паракокцидиоидоз).

б) Инвазивный кандидоз. Существующие методы определения специфических антител характеризуются низкой чувствительностью и специфичностью в связи наличием антител у больных с поверхностной колонизацией желудочно-кишечного тракта, а также нарушением продукции иммуноглобулинов у пациентов с иммуносупрессией. Выявление антигена маннана — компонента клеточной стенки Candida затруднено в связи с коротким временем выведения из кровотока и связыванием с антиманнановыми антителами. Чувствительность и специфичность имеющихся тестов для определения маннана не превышают 50%.

в) Молекулярные методы исследования патологического материала. В настоящее время широко и интенсивно изучается возможность применения ПЦР в диагностике микозов. В качестве исследуемого материала берут кровь, возможно использование мочи, слюны или ногтевых пластинок при выявлении дерматофитов. Разработаны праймеры к разным возбудителям. Диагностическая чувствительность, специфичность и скорость проведения реакции зачастую превосходят таковые при культуральном и серологических методах исследовании патологического материала. Однако ПЦР не может полностью заменить другие методы исследования, так как разработанные тест-системы не охватывают весь спектр условно-патогенных возбудителей. Кроме того, при работе этим методом возникает ряд проблем: ложноположительные результаты из-за контаминации образцов, сверхчувствительности этой реакции, а также из-за наличия ингибиторов ПЦР в образце и др.

Реже применяется газожидкостная хроматография, выявляющая некоторые компоненты клеточной стенки гриба в крови. Хроматография, как правило, ограничивается диагнозом кандидозов.

Диагностика микозов - методы исследования, критерии

Прецизионная диагностика инвазивных микозов нелегка. Это объясняется не только трудностями в получении культуры грибов, но и в интерпретации результатов исследований, поскольку грибами, как дрожжевыми, так и мицелиальными, возможны колонизация слизистых оболочек, контаминация исследуемых образцов. В связи с этим диагностика инвазивных микозов базируется на комплексном подходе, включающем не только результаты микологических (культуральных) и серологических (определение антигена грибов) исследований, но и клинические симптомы грибковой инфекции, данные вспомогательных методов исследований (компьютерная или магнитно-резонансная томография, ультразвуковое исследование).

Европейско-американской кооперированной группой по изучению инвазивных микозов у иммунокомпрометированных больных разработаны критерии диагностики инвазивных микозов. Они представлены в 2001 г. на Международной конференции по антимикробным препаратам и химиотерапии (ICAAC, Chicago), а в 2002 г. в печати. Определены критерии доказанного, вероятного и возможного инвазивного микоза, которые рекомендуется использовать при клинических и эпидемиологических исследованиях

Доказанный инвазивный микоз, вызванный мицелиальными грибами: обнаружение мицелия грибов в биоптатах либо аспиратах при гистологическом или цитологическом исследовании или выделение культуры из образцов, полученных в асептических условиях из стерильного в норме очага, который по результатам клинического и радиологического исследований связан с инфекцией, за исключением исследований мочи и со слизистых оболочек.

Доказанный инвазивный микоз, вызванный дрожжевыми грибами: обнаружение дрожжевых клеток (грибы рода Candida могут формировать псевдомицелий или истинный мицелий) в биоптатах или аспиратах, за исключением образцов со слизистых оболочек, или выделение культуры из образцов, полученных в асептических условиях из стерильного в норме очага, который по результатам клинического и радиологического исследований связан с инфекцией, за исключением исследований мочи, образцов из пазух носа и со слизистых оболочек, или обнаружение при микроскопии и специфическом окрашивании (в капле туши, окраска муцикармином) дрожжевых клеток либо положительного антигена Cryptococcus spp. в цереброспинальной жидкости.

Фунгемия, обусловленная мицелиальными грибами: выделение гемокультуры грибов, за исключением Aspergillus spp. и Penicillium spp., включая Penicillium marneffei, в сочетании с клиническими симптомами инфекционного процесса, совместимыми с выделенным возбудителем.

Фунгемия, обусловленная дрожжевыми грибами: выделение гемокультуры грибов рода Candida или иных дрожжевых грибов у пациентов с клиническими признаками инфекции, связанными с данным возбудителем.

Комплекс диагностических исследований при инвазивных микозах

При микологическом исследовании стерильных аспиратов или биоптатов принимают во внимание выделение не только культуры грибов, но и обнаружение при микроскопии мицелия или псевдомицелия. В гистологических препаратах аспергиллы трудно дифференцировать от Fusarium spp., Sceclosporium apiospermum и некоторых других мицелиальных грибов. Для дифференциальной диагностики следует проводить иммуногистохимическое исследование с антителами к аспергиллам.

Иная интерпретация результатов в случае обнаружения мицелиальных грибов в крови. Высокая частота выделения мицелиальных грибов характерна для Fusarium spp. и составляет 40—60 %. Aspergillus обнаруживают крайне редко, в большинстве случаев это рассматривается как контаминация, за исключением Aspergillus terreus.

Выделение Aspergillus terreus из крови больных с гемобластозами может свидетельствовать об истинной аспергиллемии, а при наличии клинических симптомов инфекции является основанием для назначения антимикотиков.

Критерии инвазивного микоза

При выявлении в крови или иных стерильных биосубстратов дрожжевых грибов обязательно следует проводить идентификацию до вида и определять чувствительность к противогрибковым препаратам, при выделении мицелиальных (плесневых) грибов — только идентификацию до вида, чувствительность не определяют.

В клинической практике чувствительность мицелиальных грибов не исследуют по причине несовершенства стандартов по определению чувствительности таких грибов к антимикотикам. Более того, только в одном исследовании продемонстрирована корреляция между чувствительностью Aspergillus spp. и результатами лечения инвазивного аспергиллеза у больных с гемобластозами. Ни в одном из исследований, проведенных в последующем, не получено подобных результатов.

Идентификация грибов до вида, особенно полученных из стерильных локусов, необходима прежде всего для выбора антимикотика и проведения адекватной противогрибковой терапии. Так, Candida krusei устойчивы к флуконазолу и менее чувствительны, чем дрожжевые грибы другого вида, к амфотерицину В; Aspergillus terreus, Scedosporium apiospermum (Pseudallescheria boydii), Trichosporon beigelii, Scopulariopsis spp. резистентны к амфотерицину В; Mucorales резистентны к итраконазолу, вориконазолу, Candida glabrata проявляет дозозависимую чувствительность к флуконазолу, и при выделении этого вида гриба, даже чувствительных штаммов, дозу флуконазола следует увеличить (взрослым назначают 800 мг вместо 400 мг); Candida lusitaniae устойчивы к амфотерицину В.

Идентификация грибов до вида также важна для проведения эпидемиологического анализа в стационаре — определения возбудителей вспышек инфекции и по возможности источника инфекции. Описаны вспышки инфекции, вызванные такими редкими грибами, как С. lusitaniae, С. krusei, С. lipolytica.

На основании видовой идентификации грибов можно предположить инвазивный микоз или колонизацию грибами слизистых оболочек. Например, Aspergillus niger существенно реже, чем Aspergillus fumigatus, являются причиной инвазивного аспергиллеза у больных острыми лейкозами. Выделение из жидкости бронхоальвеолярного лаважа Aspergillus niger чаще всего расценивается как колонизация дыхательных путей, а из мокроты — как контаминация из воздуха и требует дополнительных исследований при подтверждении диагноза инвазивного аспергиллеза.

Выделение Cryptococcus neoformans у иммунокомпрометированных больных из респираторного тракта (смывы, лаваж) является диагностически значимым. Если идентификация дрожжевых грибов из жидкостей, полученных из дыхательных путей (смывы из трахеи, бронхов, бронхоальвеолярный лаваж) иммунокомпрометированных больных, не относится к обязательным исследованиям, то проведение скрининга по выявлению Cryptococcus neoformans из этих образцов является необходимым.

Обнаружение кандид в моче у больных с нейтропенией и лихорадкой, как правило, считается проявлением диссеминированной кандидозной инфекции.

В своевременной диагностике инвазивного аспергиллеза успешно пользуются коммерческим тестом по выявлению циркуляции специфического антигена грибов Aspergillus spp. галактоманна (полисахаридный водорастворимый компонент клеточной стенки гриба).

Галактоманн может быть определен двумя методами: методом латекс-агглютинации (Pastorex Aspergillus, фирмы BioRAD) и методом иммуноферментного анализа (Platelia Aspergillus, фирмы BioRAD).

Преимуществом иммуноферментного метода является более низкий порог чувствительности определения уровня галактоманна в крови — 1 нг/мл и менее, а с помощью латекс-агглютинации — 15 нг/мл. Диагностическое значение имеет определение галактоманна в крови (не менее чем в 2 образцах), цереброспинальной жидкости, бронхоальвеолярном лаваже. Чувствительность метода иммуноферментного анализа составляет около 90 %, специфичность 90—99 %, у реципиентов аллогенного костного мозга данные показатели ниже и равны соответственно 60—70 % и 80—90 % вследствие профилактического применения противогрибковых препаратов (антимикотики снижают пороговый уровень галактоманна).

В 40 % случаев выявление галактоманна в крови опережает проявления инвазивного аспергиллеза, определяемые при компьютерном исследовании легких, а в 70 % опережает клинические симптомы инфекции.

Диагностическую значимость тест по выявлению антигена Aspergillus имеет в том случае, если исследование проводят неоднократно. Определение антигена Aspergillus в крови следует проводить при лихорадке на фоне лечения антибиотиками широкого спектра действия у больных с нейтропенией 2 раза в неделю; при пневмониях, которые возникают или сохраняются на фоне антибактериальной терапии; при обнаружении очагов в легочной ткани (компьютерная томография).

Редактор: Искандер Милевски. Дата обновления публикации: 18.3.2021

ИФА. В настоящее время уже появились коммерческие наборы для выявления Аг некоторых возбудителей, позволяющие их идентифицировать в течение 5-10 мин. Для выявления Аг на твёрдой фазе сорбируют известные AT и добавляют сыворотку, содержащую Аг; после инкубирования несвязанный Аг декантируют, систему промывают и вносят меченые AT, специфичные к сорбированным AT. Повторяют процедуру инкубирования и отмывания, вносят хромогенный субстрат, положительный результат фиксируют при изменении окраски системы.

Гибридизация ДНК — высокоспецифичный метод, позволяющий идентифицировать геном вируса после его гибридизации комплементарными молекулами ДНК. В качестве маркёра применяют ферменты и изотопы. Метод определяет способность вирусной ДНК гибридизиро-ваться с меченой комплементарной ДНК; специфичность метода прямо пропорциональна длине комплементарной цепочки. Перспективен метод гибридизации нуклеиновых кислот in situ. Для постановки реакции меченую ДНК наносят на биоптаты тканей (в том числе на фиксированные формалином или заключённые в парафиновые блоки) и регистрируют взаимодействие с комплементарной ДНК. Метод используют для выявления вирусов простого герпеса, папилломы человека, Эпстайна-Барр и др.

ПЦР. Метод значительно увеличивает чувствительность метода гибридизации, повышая содержание вирусной ДНК в материале, полученном от больного, а также ускоряет время получения результата.

Методы диагностики микозов ( грибковых заболеваний )

Микроскопия — один из основных методов выявления возбудителей микозов. Позволяет проводить экспресс-диагностику микозов и получать результат в течение 1—2 ч, тогда как для выделении культуры возбудителя необходимы недели. Для экспресс-диагностики препараты часто необходимо окрашивать специальными красителями, так как простая окраска гематоксилином и эозином часто не позволяет выявить клетки грибов.

Выявление вирусных антигенов ( Аг ). ИФА. Гибридизация ДНК. ПЦР. Методы диагностики микозов ( грибковых заболеваний )

Неокрашенные препараты грибов

Микроскопия методом висячей или раздавленной капли. Метод позволяет выявить структуры грибов в клинических образцах без предварительного окрашивания.

Обработка 10% едким калием (КОН). Метод используют в первую очередь для визуализации структур возбудителей в фрагментах кожи и её придатках (ногти, волосы), отделяемом очагов поражения и влагалища. В указанных образцах содержится большое количество клеток, в которых КОН разрушает кератин, оставляя неизменёнными клетки грибов.

Окрашенные препараты грибов. Окраска мазка грибов.

• Окраска мазка грибов по Граму. В мазках из клинического материала грибы представлены грамположительными клетками. Клетки Cryptococcus neoformans плохо воспринимают красители, что можно использовать как дифференциально-диагностический признак при микроскопии окрашенных мазков СМЖ.

• Окраска мазка грибов нигрозином или тушью по Бурри мазков СМЖ позволяет выявить капсулированные клетки Cryptococcus neoformans. Для идентификации этого микроорганизма можно использовать муцикармин или конго красный.

• Окраска мазка грибов по Романовскому-Гимзе или Райту мазков крови и костного мозга позволяет выявить дрожжевую форму Histoplasma capsulatum в цитоплазме фагоцитов.

• Окраска мазка грибов метенаминовым серебряным по Гомори. Метод включает предварительную обработку гистологических препаратов хромовой кислотой с последующим нанесением красителя (клетки грибов тёмно-серые или чёрные).

• Окраска мазка грибов по Гридли. Метод включает предварительную обработку препаратов хроматом лейко-фуксина с последующим нанесением фуксинового альдегида и метанилового жёлтого (клетки грибов розово-пурпурные на жёлтом фоне).

• Окрашивание перйодной кислотой и реактивом Шиффа (по Мак-Манусу). 1,2-Гликольные группировки полисахаридов клеточных стенок грибов сначала окисляются перйодной кислотой до альдегидов, реагирующих с сульфитом лейкофуксина реактива Шйффа; клетки окрашиваются в насыщенно розовый или красный цвет.

Иммунофлюоресцентная микроскопия грибов

Наибольшее распространение нашла РИФ. Применяют AT, меченные флюоресцеинами; для выявления грибковых Аг реагент наносят на гистологический препарат, инкубируют и проводят люминесцентную микроскопию.

Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.

Онихомикозы - это антропонозная инфекция. Заболевание может передаваться при тесном контакте с больным или опосредовано - через предметы, которыми он пользовался. Инфицирование может происходить в местах общественного пользования, в семье и на производстве. Развитию заболевания из экзогенных факторов способствуют мелкие травмы, ношение резиновой обуви, повышенная потливость. Основным эндогенным фактором являются снижение резистентности организма, связанное с эндокринными нарушениями, хроническими инфекциями, соматическими заболеваниями, иммунодефицитное состояние.

  1. дерматофиты (Trichophyton rubrum, T. mentagrophytes var. interdigitale, T. violaceum, T. tonsurans, T. schonleinii, Epidermophyton floccosum, Microsporum gypseum);
  2. дрожжеподобные грибы рода Candida;
  3. плесневые грибы (Scopulariopsis brevicaulis, Реnicillium spp. и др.).

У половины больных онихомикозы вызваны различными ассоциациями выше перечисленных грибов и в большинстве случаев сочетаются с микозом стоп и кистей.

Основным средством подтверждения диагноза является микроскопия патологического материала (фрагменты ногтевой пластинки и выскобленный из-под нее материал) и его посев с выделением культуры.

Внимание! Взятие материала проводится ТОЛЬКО врачом-специалистом. При культуральном исследовании рекомендуется брать биологический материал для исследования из видимых очагов поражения, предпочитая границы этих очагов с еще неповрежденной тканью (кожи, ногтя). Конкретный участок ногтя, из которого следует брать материал, определяется типом поражения и клинической формой онихомикоза. При подногтевой дистальной и проксимальной формах возбудитель располагается под ногтевой пластинкой и внутри ее, при поверхностной форме – в поверхностных слоях пластинки, при паронихии – в заднем ногтевом валике.

  • Микроскопия до 2 рабочих дней
  • Посев до 23 рабочих дней

Специальный контейнер необходимо заранее приобрести в любом медицинском офисе под залог. Возврат залоговых средств осуществляется при сдаче анализа и при условии наличия чека за внесение залога.

Читайте также: