Питательные среды для облигатных паразитов
Обновлено: 19.04.2024
Для культивирования облигатных внутриклеточных паразитов (риккетсии, хламидии, вирусы) используют живые объекты – клеточные культуры, куриные эмбрионы и чувствительных лабораторных животных. Клеточные культуры подразделяют на неперевиваемые (клетки эпителиальной или соединительной ткани в питательной среде), полуперевиваемые (диплоидные клетки человека) и перевиваемые (в основном опухолевые клетки – постоянное существование in vitro).
Куриные эмбрионы используют в возрасте 8 – 12 дней, они устойчивы к различным воздействиям. При заражении лабораторных животных недостатком является необходимость последующего заражения клеточной культуры для получения чистой линии.
Методы индикации вирусов:
• гибель или заболевание живой системы
• обнаружение вирусных включений
• метод бляшек во флаконе
21. Методы определения родовой и видовой идентификации прокариот. Диагностическое значение экзоферментов прокариот. Диагностическое значение бактериофагов.
Бактериофаги используют в лабораторной диагностике инфекций при внутривидовой идентификации бактерий, т.е. определение фаговара. Для этого принимают метод фаготитрования. Методику фаготипирования используют для выявления источника и путей распространения инфекций. По содержанию бактериофагов в объектах окружающей среды можно судить о присутствии в них соответсвующих патогенных бактерий
22. Действие физических факторов на микробов. Температурные критерии жизнедеятельности микробов. Механизмы устойчивости микробов к высушиванию, излучениям.
Из физических факторов наибольшее практическое значение имеют температура, высушивание, излучения. В зависимости от температурного режима жизнедеятельности микроорганизмы делятся на три группы:
• психрофилы (оптимум 6 – 20˚С)
• мезофилы (34 – 37˚С)
• термофилы (выше 37˚С, у некоторых – до 80˚С)
Низкие температуры большинство микроорганизмов, в том числе и вирусы, переносит хорошо. Вегетативные клетки бактерий находятся при этом в анабиотическом состоянии. Также хорошо сохраняются культуры микробов и различного рода биологически активные препараты (например, вакцины). Некоторые бактерии остаются жизнеспособными при –190˚C,а бактериальные споры при –250˚C. Высокая температура, как правило, губительно действует на вегетативные формы бактерий и вирусы в результате денатурации белков. В естественных условиях высушивание оказывает губительное действие на вегетативные клетки многих бактерий, что связано с обезвоживанием их цитоплазмы и повреждением ЦПМ и рибосом. Высушенные споры бактерий сохраняют способность к прорастанию в течение 10 лет, а споры плесневых грибов – до 20 лет. Лиофильная сушка (высушивание в условиях вакуума из замороженного состояния) применяется для хранения микробных культур и биологических препаратов в течение длительного срока без потери их биологических свойств. Прямые солнечные лучи обладают бактерицидным свойством, которое обусловлено активностью их коротковолновой части – УФ-лучей с длиной волны 254 – 300 нм. Механизм их действия связан с образованием тиминовых димеров в ДНК бактериальной клетки. Бактерии и вирусы также чувствительны к проникающей радиации. Однако они погибают только при облучении сравнительно большими дозами, порядка 44000 – 280000 Р. Эти свойства применяются для стерилизации.
Хим. Вещества могут оказывать различное действие на микроорганизмы:
-не оказывать никакого либо влияния
-стимулировать или подавлять рост
антимикробные химические вещества используются в качестве антисептических и дезинфицирующих средств
23. Определение понятий "стерилизация" и "асептика". Основные методы стерилизации. Методы контроля эффективности стерилизации.
Асептика – система мероприятий, предупреждающих попадание (внесение) микроорганизмов из окружающей среды в ткани или полости человеческого организма при лечебных и диагностических манипуляциях, а также в материал для исследования, в питательные среды и культуры микроорганизмов при лабораторных исследованиях.
Стерилизация – обеспложивание, т.е. полное уничтожение вегетативных форм микроорганизмов и их спор в различных материалах.
Основные методы:
1.Физические
• воздействием высокой температуры
прокаливание в пламени спиртовки или газовой горелки – стерилизуют бактериологические петли, препаровальные иглы, пинцеты;
кипячением – не менее 30 мин; стерилизуют мелкий хирургический инструментарий, предметные и покровные стёкла
сухим жаром в сушильно-стерилизационном шкафу (печи Пастера) – воздух нагревается до 165 – 180˚С в течении 45 мнут; стерилизуют стеклянную посуду
автоклавирование – подогретым водяным паром под давлением в автоклаве – температура 100 – 133˚С, давление 0,5 – 2 атм, время 15 – 30 мин
тиндализация – дробная стерилизация при 56–58 ˚С в течение 1 ч 5 – 6 дней подряд; для стерилизации легко разрушающихся при высокой t˚ веществ (сыворотка крови, витамины и др.)
пастеризация – нагревание при t˚ 70 – 80˚С в течение 5 – 10 мин с последующим быстрым охлаждением; не уничтожает споры;
• воздействием ионизирующих излучений
пастеризуют напитки и продукты путём ультрафиолетового облучения – используется УФ-излучение с длиной волны 260 – 300 мкм; используют бактерицидные лампы разной мощности (БУВ-15, БУВ-30) для стерилизации воздуха в боксах, операционных, детских учреждениях
2.Механическая стерилизация (фильтрование) – через асбестовые и мембранные фильтры с разным диаметром пор; стерилизация жидких материалов, невыдерживающих нагревания (сыворотка крови, антибиотики, компоненты питательных сред для бактерий и культур клеток)
3.Химические – 70% этиловый спирт, 5% спиртовой раствор йода, 2% раствор хлорамина, 0,1% раствор перманганата калия, перекись водорода, окись этилена и др.
Для культивирования вирусов (так же, как и для других облигатных паразитов - риккетсий и хламидий) используют куриные эмбрионы, культуры тканей и лабораторных животных.
Куриный эмбрион - удобная модель для культивирования вирусов в целях получения вирусов и для приготовления диагностических, профилактических и лечебных препаратов - диагностикумов и вакцин. Куриные зародыши используют в возрасте от 8 до 12 дней, перед заражением инфекционным материалом скорлупу яйца над воздушной камерой обрабатывают 70% спиртом, обжигают, смазывают йодом (2% настойка), вторично протирают спиртом и обжигают. Вируссодержащий материал, обработанный для удаления бактериальной флоры, в асептических условиях наносят на хорион-аллантоисную оболочку или вводят в желточный мешок, аллантоисную полость, либо в амнион (ткань эмбриона). После заражения в аллантоисную полость через отверстие заливают парафин;
если материалом заражают хорион-аллантоис, отверстие в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом, края которого замазывают парафином. После инфицирования эмбрионы помещают в термостат при 37°С. Признаки репродукции вируса проявляются особенно четко в месте заражения на хорион-аллантоисной оболочке в виде очагов поражения и геморрагий или для его обнаружения применяют специальные реакции (например, реакцию гемагглютинации - РГА).
Культуры клеток (тканей) получают из тканей животных и человека. Их делят на первичные, которые используют в течение одной генерации, и перевиваемые, которые поддерживают путем пассажей (перевивок) длительное время. Клетки перевиваемой культуры ткани готовят из нормальных (чаще эмбриональных) и злокачественных линий клеток, они способны сравнительно прочно прикрепляться к стеклу флакона, образовывать монослой клеток и многократно размножаться in vitro. Для поддержания жизнеспособности клеток применяются специальные синтетические среды (например, среда 199, среда Хэнкса), содержащие аминокислоты, витамины, глюкозу, минеральные соли с добавлением 5 -10% коровьей или лошадиной сыворотки. Трипсин используется при получении культуры клеток для дезагрегации тканей, т.е. для разобщения клеток. Репродукция вирусов в культуре клеток сопровождается так называемым цитопатическим действием (ЦПД), которое проявляется в изменении морфологии клеток и их гибели или образования синцития, а в некоторых случаях - в возникновении в инфицированных клетках клеточных включений. Характер и время проявления ЦПД зависит от вида вируса.
Для создания моделей вирусных инфекционных болезней и выделения вирусов используют лабораторных животных (белых мышей, хомяков, крыс, кроликов и др.). Чувствительность животных к вирусам зависит от вида животного и его возраста.
Культивирование риккетсий
Риккетсии являются облигатными паразитами, их культивирование возможно только в живых тканях. Обычно их выращивают в желточном мешке куриного эмбриона.
Культивирование хламидий
Хламидии можно размножать в желточном мешке куриного эмбриона или в культурах тканей позвоночных. Размножение в куриных эмбрионах происходит в температурных границах 33 - 41°С и даже более широких, но чувствительность к обеим крайним температурам и оптимум для роста варьирует от вида к виду.
Цели занятия:
1. Изучить принципы классификации питательных сред, методы выявления культуральных свойств бактерий на различных питательных средах и вирусов в различных условиях культивирования.
2. Освоить технику посевов бактерий на плотные и жидкие питательные среды.
3. Начать освоение методики выделения чистых культур аэробов.
Учебно-целевые задачи:
1. Метаболизм микроорганизмов.
2. Источники углерода, азота, макро- и микроэлементов, ростовых факторов для микробов. Аутотрофы и гетеротрофы. Фототрофы и хемотрофы.
3.Питательные среды. Механизм переноса питательных веществ в бактериальную клетку
4. Определение понятий: культура, штамм, клон. Колонии, особенности их формирования у различных видов бактерий.
5.Принципы культивирования различных групп микроорганизмов.
Культуральные свойства бактерий.
6. Механизм и скорость размножения микроорганизмов. Фазы размножения микроорганизмов в жидкой питательной среде в стационарных условиях. Образование микробами пигментов, токсинов, витаминов, аминокислот, полисахаридов и других веществ.
7. Особенности роста и размножения риккетсий, хламидий и вирусов.
8. Методы культивирования бактерий, в том числе облигатных внутриклеточных: (риккетсий, хламидий) и вирусов.
1. Владеть техникой посева бактерий на жидкие и плотные питательные среды.
2. Описать культуральные свойства микроорганизмов.
Техника посева бактерий на питательные среды, выделение и идентификация чистых культур бактерий
Чистую культуру бактерий получают для проведения диагностических исследований - идентификации, которая достигается путем определения морфологических, культуральных, биохимических и других признаков микроорганизмов.
Морфологические и тинкториальные признаки бактерий изучают при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных разными методами, и нативных препаратов.
Культуральные свойства характеризуются питательными потребностями, условиями и типом роста бактерий на плотных и жидких питательных средах. Они устанавливаются по морфологии колоний и особенностям роста культуры.
Биохимические признаки бактерий определяются набором конститутивных и индуцибельных ферментов, присущих определенному роду, виду, варианту. В бактериологической практике таксономическое значение имеют чаще всего сахаролитические и протеолитические ферменты бактерий, которые определяют на дифференциально-диагностических средах.
При идентификации бактерий до рода и вида обращают внимание на пигменты, окрашивающие колонии и питательную среду в разнообразные цвета. Например, красный пигмент образуют Serratia marccescens, золотистый пигмент – Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк), сине-зеленый пигмент – Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка).
Для установления биовара (хемовара, серовара, фаговара) проводят дополнительные исследования по выявлению соответствующего маркера-определению фермента, антигена, чувствительности к фагам.
Посев уколом. Посев уколом в агар столбиком применяется для выращивания анаэробов или выявления характерного признака микроба, так как рост по уколу типичен для ряда бактерий. При посеве уколом в столбик желатины наблюдается разжижение ее бактериями, обладающими протеолитическим ферментом. Посев уколом в полужидкий агар практикуется также с целью длительного хранения культур.
При посеве уколом пробирку с агаром или столбиком желатины держат дном кверху, вынимают пробку и обжигают край пробирки. Материал, содержащий микробы, забирают обожженной на пламени платиновой иглой и прокалывают ею столбик питательной среды снизу вверх почти до самого дна пробирки
Посев петлей (посев штрихами). Берут одну чашку Петри с питательным агаром и делят ее на 4 сектора, проводя разграничительные линии на внешней стороне дна чашки. Исследуемый материал петлей вносят в первый сектор и проводят ею параллельные линии по всему сектору на расстоянии одна от другой около 5 мм. Этой же петлей, не изменяя ее положения по отношению к агару, проводят такие же линии на других секторах чашки. В том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток, рост микроорганизмов будет в виде сплошного штриха. На секторах с небольшим количеством клеток вырастают отдельные колонии.
Рис. 1. Схема рассева бактерий штрихами для получения изолированных колоний
Рис. 2. Заражение куриного эмбриона на ХАО через естественную воздушную камеру
(по Николау)
Рис. 3. Заражение куриного эмбриона в аллантоисную полость (по Николау)
Заражение через искусственную воздушную камеру применяют чаще первого, так как оно обеспечивает контакт вируссодержащего материала с большей поверхностью ХАО и, следовательно, ведет к образованию большего количества вируса. Для заражения эмбриона этим методом его помещают в штатив горизонтально зародышем вверх. В скорлупе делают два отверстия: одно небольшое над центром воздушной камеры (предназначено для отсасывания из нее воздуха), а другое диаметром 0,2-0,5 см сбоку, со стороны зародыша. Сложность метода в том, что, делая второе отверстие, необходимо осторожно снять вначале кусочек скорлупы, затем скользящим движением, не повреждая ХАО, сдвинуть подскорлупную оболочку в сторону так, чтобы через образовавшийся дефект мог пройти воздух. После этого резиновой грушей через первое отверстие отсасывают воздух из естественной воздушной камеры (рис. 4, а). В результате через боковое отверстие наружный воздух устремляется внутрь, образуя искусственную воздушную камеру, дном которой является ХАО (рис. 4, б).
,
Рис. 4. Заражение куриного эмбриона на ХАО через искусственную воздушную камеру (по Николау и др.)
Через боковое отверстие на поверхность ХАО наносят инфекционную жидкость и отверстие закрывают кусочком лейкопластыря. Закрывать первое отверстие нет необходимости, так как внутренний листок подскорлупной оболочки при этом методе заражения не нарушается и продолжает выполнять роль барьера для микрофлоры окружающей среды.
Дальнейшую инкубацию эмбрионов, зараженных этим методом, проводят в горизонтальном положении боковым отверстием вверх.
Заражение в желточный мешок. Большей частью им пользуются для размножения хламидий, а также вирусов болезни Марека, ринопневмонии лошадей, катаральной лихорадки овец и др. Заражают эмбрионы 5-7-дневного, а иногда и 2-3-дневного возраста (вирус лихорадки долины РИФ). Используют два варианта заражения (рис. 6).
Рис. 5. Заражение куриного эмбриона в амниотическую полость (по Николау и др.)
Рис. 6. Заражение куриного эмбриона в желточный мешок (по Николау и др.)
Первый вариант. Иногда путь заражения осуществляется на горизонтально укрепленном в штативе эмбрионе, при этом зародыш находится внизу, а желток - над ним. Отверстие в скорлупе закрывают каплей расплавленного парафина.
Второй вариант. Эмбрионы помещают в штатив в вертикальном положении. Делают отверстие в скорлупе над центром воздушной камеры и вводят иглу на глубину 3,5-4 см под углом 45° к вертикальной оси в направлении, противоположном месту нахождения зародыша.
Заражение в амниотическую полость. Для этой цели используют эмбрионы 6-10-дневного возраста. Метод используется при культивировании вирусов гриппа, ньюкаслской болезни, ринопневмонии лошадей и др. Есть два способа заражжения (рис. 5).
Закрытый способ. Заражение проводят в затемненном боксе. Яйцо помещают на овоскопе в горизонтальном положении зародышем вверх. Через отверстие в скорлупе над воздушной камерой вводят иглу с затупленным концом по направлению к зародышу. Доказательством того, что игла проникла в амнион, служит движение тела зародыша в направлении передвижения.
Открытый способ. Скорлупу над воздушной камерой срезают так, чтобы образовалось окно диаметром 1,5-2,5 см. Через него пинцетом под контролем глаза снимают подскорлупную оболочку. Затем анатомический (14 см) пинцет с сомкнутыми браншами ведут, продавливая хорионаллантоисную оболочку по направлению к зародышу. Когда пинцет достигнет его, бранши размыкают, захватывают амниотическую оболочку вместе с ХАО и подтягивают к окну. Удерживая левой рукой пинцет с фиксированной в нем оболочкой амниона, вводят вируссодержащий материал (рис. 7). Далее все оболочки опускают, окно закрывают лейкопластырем и эмбрион инкубируют в вертикальном положении.
Заражение в тело зародыша. Для заражения используют эмбрионы 7-12-дневного возраста. Известно два варианта метода.
Первый вариант. Заражают так же, как в амнион закрытым способом, с той лишь разницей, что берут острую иглу и на овоскопе показателем попадания иглы в тело считают подчинение зародыша движениям иглы.
Второй вариант. Заражают так же, как в амнион открытым способом: через окно в скорлупе подтягивают пинцетом тело зародыша. Материал вводят в головной мозг или определенные участки тела. При таких методах заражения бывает значительный процент неспецифической гибели эмбрионов.
Рис. 7. Заражение куриного эмбриона в амнион открытым способом (по Николау и др.)
Рис. 8. Отсасывание аллантоисной жидкости (по Николау)
Рис. 9. Отсасывание амниотической жидкости (по Николау и др.)
Для получения стенки желточного мешка как вируссодержащего материала желток извлекают на чашку Петри, стенку его разрезают ножницами и отполаскивают от содержимого в физиологическом растворе. Тело зародыша извлекают, удерживая его за шею (рис. 10).
При вскрытии куриных эмбрионов ставят бактериологический контроль вируссодержащего материала посевом на МПБ, МПА, МППБ и среду Сабуро. Вируссодержащий материал хранят при минус 25 °С и ниже.
Культивирование с производственными целями на куриных эмбрионах применяется для размножения ряда вирусов (осповакцины, клещевого энцефалита, гриппа, москитной лихорадки и др.). Так, для изготовления гриппозной и оспенной вакцин используют вирусы, размноженные на хорионаллантоисной оболочке, вакцины против москитной лихорадки - в аллантоисной полости, а вирус клещевого энцефалита культивируют в желточном мешке.
Метод размножения вирусов на культурах тканей
Для изготовления живых и инактированных вакцин вирусы размножаются на первичных культурах тканей, а диагностических препаратов также и на перевиваемых культурах.
Для размножения вирусов предложен ряд методов с использованием культур тканей. Такие методы, как Карреля-Берреуза (1910), культивирование кусочков ткани, фиксированных в сгустке плазмы, Меттлендов (1928) - культивирование в переживающих тканях - в настоящее время не используются не только в производстве, но и в исследовательской работе. Эти методы вытеснены культивированием в однослойной культуре клеток.
Работа по культивированию клеток производится в специальных лабораториях при соблюдении высоких требований к стерильности воздуха, посуды, растворов, питательных сред. Используемая посуда должна быть нейтральной, хорошо вымытой и обезжиренной, применяемые реактивы - химически чистыми.
Введение. К облигатным внутриклеточным паразитам относятся все вирусы и некоторые бактерии (представители порядков Chlamydiales и Rickettsiales), а также ряд видов патогенных простейших (Toxoplasma, Plasmodium и др.). Вирусы выделены в самостоятельное царство Vira. Вирусы не имеют клеточного строения, собственного метаболизма, содержат один тип нуклеиновой кислоты — ДНК или РНК, не размножаются бинарным делением и могут кристаллизоваться как неорганические вещества. Они являются облигатными внутриклеточными паразитами с дизъюнктивным (разобщенным) типом размножения. Внеклеточная форма существования вируса называется вирионом. В отличие от организмов, имеющих клеточное строение, вирусы занимают промежуточное положение между живой и неживой материей. В основе классификации вирусов лежат определенные признаки:
тип вирусной нуклеиновой кислоты — ДНК-содержащие и РНК-содержащие;
тип симметрии капсида — изометрический (кубический), спиральный или смешанный;
наличие или отсутствие суперкапсида — просто или сложно устроенные;
тип хозяина — вирусы человека и животных, растений, бактерий (бактериофаги).
Тема 5.1. Морфология и структура вирусов. Вирусоскопические методы исследования
Введение. Вирион состоит из сердцевины (нуклеиновой кислоты в комплексе с сердцевинными белками) и оболочек. Размеры вирионов колеблются от 15—20 (0,015—0,002 мкм) до 300-500 нм (0,3-0,5 мкм).
Существуют простые и сложные вирионы. Первые снабжены только капсидом. Форма просто устроенных вирусов определяется типом симметрии его капсида: изометрическим или спиральным. У вирусов с изометрическим типом симметрии капсида отдельные морфологические субъединицы капсида (капсомеры) уложены на осях симметрии многогранника, например икосаэдра (двадцатигранника). При этом вирион приобретает сферическую форму. У вирусов со спиральным типом симметрии капсомеры уложены по спирали вокруг нуклеиновой кислоты. При этом вирион приобретает палочковидную форму.
Сложные вирионы имеют дополнительную внешнюю оболочку — суперкапсид, покрывающий капсид снаружи. Супер-капсид представляет собой модифицированную мембрану клетки хозяина [цитоплазматическую (ЦПМ), ядерную или др.], содержащую вирусные белки и гликопротеины. Форма сложных вирусов обычно близка к сферической, для них характерен плеоморфизм.
Вирусы бактерий (бактериофаги) имеют сперматозоидную или нитевидную форму. Бактериофаги сперматозоидной формы состоят из головки, в которой содержится нуклеиновая кислота, и отростка. Капсид головки фагов построен по изометрическому типу симметрии, а отростка — по спиральному. У некоторых фагов отросток очень короткий или может отсутствовать.
Морфологию вирусов изучают с помощью электронной микроскопии. Методы сканирующей электронной микроскопии позволяют исследовать форму и характер поверхности вирусной частицы. Для изучения ультраструктуры вирусов применяют методы просвечивающей электронной микроскопии.
Тема 5.2. Культивирование вирусов и других облигатньгх внутриклеточных паразитов (риккетсий, хламидий)
Введение. Вирусы не имеют собственного метаболизма. Для репродукции они используют метаболические системы клетки-хозяина.
Различают 3 типа взаимодействия вируса с клеткой.
Продуктивная инфекция. При этой форме инфекции в клетке происходит репродукция вируса и образуется вирусное потомство — 10 4 —10^ вирусных частиц, которые вы ходят из зараженной клетки во внешнюю среду.
Интегративная инфекция. Геном вируса встраивается (интегрирует) в геном клетки-хозяина. Интегрированные вирусные геномы — провирусы — передаются потомству зараженной клетки при делении. РНК-содержащие вирусы также могут вызвать интегративную нфекцию путем обратной транскрипции с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы). При этом в клеточный геном встраивается образующаяся ДНК-копия вирусной РНК. При определенных условиях интегративная форма вирусной инфекции может переходить в продуктивную.
Абортивная инфекция. При проникновении в клетку дефектного вируса, не способного к самостоятельной репродукции, или при попадании полноценного вируса в непермис- сивную (не подходящую для его репродукции) клетку, или при неподходящих условиях внешней среды возникает абортивная форма инфекции. Взаимодействие с клеткой прерывается на одной из ранних стадий — вирус не репродуцируется и не передается потомству зараженной клетки.
Методы культивирования вирусов, риккетсий, хламидий.
Методы индикации вирусов.
Бактериофаги: морфология и физиология, практическое применение.
Демонстрация
Питательные среды, растворы и лабораторная посуда для культур клеток.
Культуры клеток: незараженные, зараженные вирусом простого герпеса и хламидиями. Отметить изменения в культурах клеток, зарисовать, сделать вывод.
Задание студентам
1. Учесть результаты реакции гемагглютинации (РГА), поставленной для выявления гемагглютинирующего
вируса в материале из куриного эмбриона, и определить титр вируса.
Учесть результаты индикации вируса в культуре клеток по цветной пробе.
Учесть результат титрования бактериофага по методу Грациа.
Определить спектр литического действия бактериофага.
Ознакомиться с методом фаготипирования бактериальных культур. Определить фаговары культур стафилококков, выделенных от больных.
Ознакомиться с препаратами бактериофагов, классифицировать по назначению.
а Методические указания
Методы культивирования вирусов. Для культивирования вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы и чувствительных лабораторных животных. Эти же методы применяют и для культивирования риккетсий и хламидий — облигатных внутриклеточных бактерий, которые не растут на искусственных питательных средах.
Культуры клеток. Представляют собой соматические или эмбриональные клетки животных или человека, культивируемые в лабораторных условиях. Клеточные культуры различаются по источнику получения, способности к размножению in vitro и кариотипу. Их подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые.
Первичные культуры клеток получают непосредственно из тканей многоклеточных организмов. Такие клетки обычно не способны к делению (неперевиваемые) и используются однократно.
К полуперевиваемым культурам относятся диплоидные клетки различных тканей и органов, способные к ограниченному размножению in vitro. Они представляют собой клеточную систему, сохраняющую в процессе 20—50 пассажей (пересевов) — до года — диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток используемой ткани. Диплоидные клетки при культивировании не претерпевают злокачественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых.
Перевиваемые культуры клеток готовят из злокачественных линий клеток, обладающих способностью неограниченно размножаться in vitro в определенных условиях. К ним относятся, например, злокачественные клетки HeLa, первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы) и др.
Для выращивания клеточных культур используют питательные среды сложного состава, включающие источники энергии, минеральные вещества, аминокислоты, витамины и другие
факторы роста. Клетки чрезвычайно чувствительны к изменению рН среды. Для контроля рН в среды добавляют индикатор. Большинство клеточных культур растет в виде монослоя (пласта, состоящего из одного слоя клеток), прочно прикрепляясь к поверхности контейнера для культивирования — пробирки, пластикового планшета или матраса (флакон 4-гранной формы). Некоторые типы клеток способны расти также в суспензии.
Приготовление первичной культуры клеток включает несколько последовательных этапов: измельчение ткани, разъединение клеток путем трипсинизации, отмывание полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост (например, в среде 199 с добавлением телячьей сыворотки крови). При оседании клетки довольно прочно прикрепляются к стенке пробирки или флакона, по которой распространяются в виде монослоя. После получения монослоя жизнеспособной культуры клеток ее заражают материалом, содержащим риккетсии, хламидии или вирусы. Упомянутые микробы проникают внутрь клеток, где и размножаются. В культурах клеток удается культивировать большинство вирусов, вызывающих заболевания человека.
Внутриклеточные паразиты оказывают цитопатическое действие (ЦПД) на клетки, в которых происходит их репродукция. ЦПД может проявляться деструкцией (лизисом) зараженных клеток, изменением их морфологии (изменением размеров и формы самой клетки, клеточного ядра, появлением вакуолей или включений, представляющих собой внутриклеточные скопления вирусов, образованием синцития) и нарушением их функций.
Куриные эмбрионы. Куриные эмбрионы по сравнению с культурами клеток значительно реже бывают контаминиро-ваны вирусами и микоплазмами, а также обладают сравнительно высокой жизнеспособностью и устойчивостью к различным воздействиям. Они пригодны для культивирования хламидии, риккетсии и некоторых вирусов, патогенных для человека.
Для получения чистых культур риккетсии, хламидии и ряда вирусов в диагностических целях, а также для приготовления разнообразных препаратов (вакцины, диагностикумы) используют 8—12-дневные куриные эмбрионы. К недостаткам данного метода относятся невозможность обнаружения исследуемого микроорганизма без предварительного вскрытия эмбриона, а также наличие большого количества белков и других соединений, затрудняющих последующую очистку возбудителя при изготовлении различных препаратов.
Для заражения куриных эмбрионов исследуемый материал вводят в аллантоисную и амниотическую полости, на хорион-аллантоисную оболочку или в желточный мешок куриного
культивирования облигатных внутриклеточных паразитов в организме лабораторных животных перед другими состоит в возможности выделения тех вирусов, которые плохо репродуцируются в культуре клеток или эмбрионе. К его недостаткам относятся высокая вероятность контаминации организма подопытных животных посторонними вирусами и мико плазмами, а также необходимость последующего заражения культуры клеток для получения чистой культуры данного вируса, что увеличивает сроки исследования.
Методы индикации вирусов. Для демонстрации присутствия вируса в клеточной культуре используют несколько методов.
I. О размножении (репродукции) вирусов в культуре клеток судят по цитопатическому действию (ЦПД), которое может быть обнаружено микроскопически по морфологическим изменениям клеток. Часть таких клеток погибает и отслаивается от стенок пробирки. Вирусные частицы, освобождающиеся при разрушении одних клеток, инфицируют другие, которые через некоторое время также погибают. В результате вместо сплошного клеточного монослоя остаются лишь отдельные клеточные островки. Характер ЦПД, вызванного разными вирусами, неодинаков. При репродукции одних вирусов (парамиксовиру-сы, герпесвирусы) наблюдается слияние клеток с образованием синцития, других (энтеровирусы, реовирусы) — сморщивание и деструкция клеток, третьих (аденовирусы) — агрегация клеток (рис. 5.2.2) и т.д. ЦПД вирусов оценивают в динамике, просматривая культуру клеток под микроскопом в разные сроки после ее заражения вируссодержащим материалом. Некоторые вирусы (энтеровирусы, герпесвирусы) вызывают ЦПД в течение 1—2 сут, другие — в более поздние сроки (на 4—6-й день). Характер ЦПД используют как для обнаружения вирусов (индикации), так и ориентировочной идентификации, т.е. определения их видовой принадлежности.
Некоторые вирусы можно обнаружить и идентифицировать по включениям, которые они образуют в ядре или цитоплазме зараженных клеток. Форма включений различна, а размеры колеблются от 0,25 до 25 мкм. Они представляют собой места скопления вирусных частиц и могут быть выявлены в препаратах, приготовленных из зараженной ткани и окрашенных по методу Романовского—Гимзы или флюорохромами. В последнем случае используют люминесцентную микроскопию.
способность к метаболизму и погибают, поэтому окраска среды с течением времени не меняется.
П. Реакцию гемадсорбции применяют для индикации гемаг-глютинирующих вирусов. Реакция основана на способности поверхности клеток, в которых репродуцируются такие вирусы, адсорбировать эритроциты. Для постановки реакции гемадсорбции в культуру клеток, зараженных вирусами, добавляют взвесь эритроцитов и после некоторого времени контакта клетки промывают изотоническим раствором хлорида натрия. На поверхности пораженных вирусами клеток остаются прилипшие эритроциты.
III. Реакцию гемагглютинации (РГА) применяют для обнаружения гемагглютинирующих вирусов в культуральной жидкости зараженной культуры клеток либо хорионаллантоисной или амниотической жидкости куриного эмбриона. Гемагглюти-нацию — "склеивание" эритроцитов разных видов животных (кур, гусей, морских свинок) — вызывают вирусы, содержащие в оболочке гемагглютинин. Для постановки реакции гемагглютинации к исследуемому материалу добавляют взвесь эритроцитов. В присутствии вирусов происходит агглютинация эритроцитов.
После вскрытия куриного эмбриона аллантоисную жидкость отсасывают и разливают по 0,5 мл в пробирки или лунки плексигласовой пластины (для контроля берут 0,5 мл такой же жидкости незараженного эмбриона). Затем добавляют по 0,2 мл 1 % суспензии отмытых куриных эритроцитов и выдерживают при комнатной температуре. Результаты реакции учитывают через 40 мин после оседания эритроцитов: (++++) — выраженная гемагглютинация — тонкая пленка склеившихся эритроцитов на дне пробирки, имеющая вид зонтика, (+++) — наличие просветов в пленке, (++) — наличие пленки с фестончатыми краями из склеившихся эритроцитов, (+) — хлопьевидный осадок эритроцитов, окруженный зоной комочков агглютинированных эритроцитов, (—) — резко очерченный осадок эритроцитов, неотличимый от контроля. Наличие гемагглютинации в опытных пробирках при ее отсутствии в контрольных указывает на содержание вируса в исследуемой жидкости. Для определения титра РГА ставят реакцию с разведениями вируссо-держащей жидкости 10~V 10~ 2 , 10~ 3 и т.д. За титр РГА принимают максимальное разведение, при котором наблюдается гемагглютинация (++). Титр РГА характеризует активность вируса и используется при постановке РТГА (см. тему 10.2).
Для количественного обнаружения вирусных частиц используют методы титрования. Титр вируса можно определить в реакции гемагглютинации с 10-кратными разведениями культуральной среды, или материала из куриного эмбриона, или по ЦПД в культуре клеток. В последнем случае клетки культуры заражают 10-кратными разведениями материала, содержащего вирус. После 6—7-дневной инкубации их просматривают на
отношении бактерий. Однако существуют фаги, которые могут поражать только отдельные варианты одного и того же вида бактерий. Их используют для определения фаготипов (фагова-ров) внутри данного вида. Вместе с тем имеются фаги, лизи-рующие родственные виды бактерий. В практической работе фаги применяют для:
фаготипирования бактерий, т.е. определения фаготипа по лизису штаммов бактерий одного и того же вида типоспецифическими фагами, что важно для маркировки исследуемых бактерий при эпидемиологическом анализе заболеваний;
фагоидентификации бактериальных культур с целью установления их видовой принадлежности;
фагодиагностики, заключающейся в выделении фага из организма больного (например, из испражнений), что косвенно свидетельствует о наличии в материале соответствующих бактерий;
фагопрофилактики — предупреждения некоторых заболеваний (например, дизентерии) среди лиц, находящихся в эпидемическом очаге;
фаготерапии — лечения некоторых инфекционных заболеваний, вызванных, например, шигеллами, протеем, стафилококком.
Методы выделения фагов из объектов окружающейсреды и их идентификация.
Метод титрования фага по Грациа.
Метод обнаружения лизогенных бактерий.
Метод фаготипирования бактерий.
Демонстрация
Методы выделения фага из объектов окружающей среды.
Методика обнаружения лизогенных бактерий.
Задание студентам
Учесть результат титрования бактериофага по методу Грациа.
Определить спектр литического действия бактериофага.
Ознакомиться с методом фаготипирования бактериальных культур. Определить фаговары культур стафилококков, выделенных от больных.
Ознакомиться с препаратами бактериофагов, классифицировать по назначению.
а Методические указания
Выделение фага из объектов окружающей среды. Для получения вирулентного фага готовят фильтрат, пропуская исход-
Номер Число "стерильных" пятен фага, получен- Число исследуемой ных при посевах проб в разведениях фаговых час- пробы 1 1 тиц в 1 мл 10~ 5 10~ 6 КГ 7
1 370 42 3 7,3х10 7 2 463 50 6 l.OxlO 8 3 37 4 0 7,7хЮ 6
жание постоянства состава генома, его воспроизведение при размножении и изменчивость, обеспечивающая приспособляемость, являются обязательными условиями сохранения вида. В основе поддержания постоянства генома лежит работа ферментов репликации и некоторых систем репарации ДНК. Изменения генетической информации являются результатом мутаций и рекомбинации. Мутации, различные по происхождению (спонтанные и индуцированные), приводят к изменениям ДНК, имеющейся в клетке. Рекомбинация позволяет также использовать и ДНК других клеток и вирусов, поступающую из окружающей среды.
Читайте также: