При вич клетки киллеры

Обновлено: 28.03.2024

Инфекционные болезни:

Популярные разделы сайта:

Механизмы поражения ВИЧ естественных киллеров (NK-клеток)

Снижение активности NK-клеток может происходить в результате прямого инфицирования NK-клеток ВИЧ или косвенного действия вируса. Это может быть связано с тем, что активация иммунной системы вызывает усиление экспрессии CCR5 на NK-клетках, что делает их более чувствительными к ВИЧ-инфекции.

Однако количество инфицированных NK-клеток у зараженного человека слишком мало, чтобы объяснять общее снижение их активности. Кроме того, у пациентов с вирусемией NK-клетки не содержат провирусную ДНК ВИЧ. Угнетение функций сопровождается тенденцией к усилению экспрессии тормозных NK-рецепторов и ослаблению экспрессии активирующих NK-рецепторов. Угнетающее действие вирусной оболочки также может способствовать подавлению функций NK-клеток.

Кроме того, некоторые доказательства указывают на то, что Tat ВИЧ-1 угнетает цитотоксическую активность NK-клеток, блокируя кальциевые каналы. Тем не менее, по-видимому маловероятно, что продукты вируса, секретируемые ВИЧ-инфицированными клетками, предотвращают уничтожение инфицированных клеток NK-клетками, поскольку эти клетки могут уничтожать ВИЧ-инфицированные CD4+-Т-клеточные линии так же, как и неинфицирован-ные Т-клеточные линии.

Снижение активности NK-клеток, не обязательно сочетающееся с уменьшением их количества, возможно, связано со снижением выработки перфорина, которое, вероятно, является следствием уменьшения концентрации определенных цитокинов, в частности IL-12, IL-2, IL-15 и IL-10, или уменьшения реактивности на IFN-a. У ВИЧ-инфицированных пациентов уменьшение экспрессии перфорина в NK-клетках можно восстановить при лечении IFN-a; IL-15 и IL-2 могут усиливать активность NK-клеток, в том числе секрецию IL-12.

Поскольку ПДК являются основными клетками, вырабатывающими интерфероны 1 типа, эти клетки системы врожденного иммунитета, по-видимому, влияют на работу NK-клеток. Нарушение секреции IL-15 и IL-12 ДК может привести к угнетению активности NK-клеток.

Снижение активности NK-клеток при ВИЧ-инфекции также можно предотвратить in vitro добавлением IL-12 в среду. Выработка этого цитокина снижает при ВИЧ-инфицировании ДК и макрофагов. С другой стороны, уменьшение выработки IL-12 может являться результатом прямого действия повышенных концентраций IFN-a и IFN-P при ВИЧ-инфекции. Эти цитокины, несмотря на усиление реакции NK-клеток, могут угнетать экспрессию IL-12.

IFN-y необходим для функционирования NK-клеток, и совместное выращивание в культуре NK-клеток и ДК усиливает цитотокси-ческие свойства NK-клеток вследствие продукции IFN-y. Для осуществления такого влияния со стороны ДК, по-видимому, необходимы межклеточные контакты и выработка IL-18 и IL-12. Результаты опытов показывают, что за счет межклеточных контактов и выработки цитокинов ДК усиливают цитотоксические функции NK-клеток, активируя как перфорин/гранзимовый В-, так и FasL/Fas-зависимый механизмы.

В некоторых исследованиях было показано, что уменьшение активности NK-клеток коррелирует с изменениями субпопуляций этих клеток. Различают две основные субпопуляции NK-клеток, в зависимости от экспрессируемых ими поверхностных молекул. Около 10% NK-клеток относятся к CD56bright СБ16-клеткам, которые выполняют первичные иммунорегуляторные функции и являются основными продуцентами цитокинов; они обладают низкой цитотоксической активностью. Другая субпопуляция, CD56dim CD16, обладает цитотоксической активностью.

При хронической ВИЧ-инфекции количество зрелых CD3 CD16 СD56bright,-клеток уменьшается, тогда как количество CD16+ CD56dim или CD56-клеток увеличивается. NK-клетки лимфоидной ткани относятся преимущественно к типу CD56bright, который вырабатывает IFN-y.

При острой ВИЧ-1-инфекции наблюдается быстрая гибель иммунорегуляторных CD56bright -клеток, секретирующих цитокины. Это связано с уменьшением количества цитотокси-ческих CD56dim-клеток, происходящим параллельно с накоплением функционально слабых CD56-клеток. Присутствие NK-клеток со слабыми цитотоксическими свойствами, плохо вырабатывающих перфорин, при хронической ВИЧ-инфекции имитируется сходными CD8+-Т-клетками, обладающими слабой функциональной активностью, что, возможно, связано с активацией иммунной системы. После проведения HAART популяция цитотоксических NK-клеток возвращается к норме.

Регуляция активации и функций NK-клеток при вирусных инфекциях.
Вскоре после острой стадии развития многих вирусных инфекций IFN-a/b, вырабатывающийся под влиянием инфицированных клеток, активирует опосредованную NK-клетками цитотоксичность и бластогенез
(белые стрелки, указывающие направо, в верхней части схемы). Некоторые, но не все, вирусные инфекции также вызывают спонтанную выработку значительного количества IL-12
(прерывистые стрелки, указывающие направо, в нижней части схемы). В присутствии IL-12 активируется выработка IFN-y NK-клетками.
Было показано, что выработка IFN-y способствует реализации противовирусной защиты преимущественно за счет активации клеточно-опосредованных иммунных реакций.
IFN-a/b вызывают прекращение или угнетение экспрессии IL-12 и могут приводить к снижению количества IL-12 при некоторых вирусных инфекциях.
Этот процесс за счет уменьшения IFN-y может вызвать нарушение клеточно-опосредованных реакций, вызванных IFN-y.
После активации Т-клеточных реакций возможно выключение реакций со стороны NK-клеток.
Активирующие и ингибирующие рецепторы естественных кле-ток-киллеров (NК-клеток).
(А) Нормальные клетки экспрессируют молекулы класса I собственного главного комплекса гистосовместимости (МНС), распознаваемые ингибирующими рецепторами, благодаря чему NK-клетки не атакуют собственные клетки.
Обратите внимание, что здоровые клетки могут экспрессировать лиганды для активирующих рецепторов или не экспрессировать их (как показано), однако они не активируют NK-клетки,
т.к. взаимодействуют с ингибирующими рецепторами.
(Б) У инфицированных и подвергнутых стрессу клеток экспрессия молекул МНС класса I снижена, поэтому ингибирующие рецепторы не активируются и экспрессируются лиганды для активирующих рецепторов.
В результате NK-клетки активируются и убивают инфицированные клетки.


Обзор

Автор
Редактор

Обратите внимание!

Спонсоры конкурса: Лаборатория биотехнологических исследований 3D Bioprinting Solutions и Студия научной графики, анимации и моделирования Visual Science.

Всегда ли можно дать сорокалетнему мужчине его сорок? А пятидесятилетнему? А скольким тридцатилетним женщинам вы бы не дали двадцати? Определять возраст человека по внешней составляющей не самая лёгкая задача. Однако, людям, перешагнувшим определённый порог, различный для мужчин и женщин, когда репродуктивная функция начинает стремительно угасать, становится сложнее скрывать свой возраст.

Тимус у новорождённого и взрослого

Рисунок 1. Сравнение размеров тимуса у новорождённого (а) и взрослого (б). К 50 годам тимус уменьшается в 5-7 раз по сравнению с первоначальным размером. Рисунок с сайта my.bpcc.edu.

Тимус — военная база иммунной системы

Соматическая рекомбинация

Рисунок 2. Соматическая рекомбинация на примере β цепи TCR. Исходная последовательность в гене, кодирующем β цепь TCR содержит V (variable), D (diversity), J (Joining) и C (constant) сегменты. Сначала один из двух D-сегментов соединятеся с одним из 13 J-сегментов. Получившийся DJ-сегмент присоединяется к одному из 50 V-сегментов. Сегменты выбираются случайным образом, и механизм их сшивки также предполагает случайное варьирование количества пар оснований, это обеспечивает разнообразие TCR. Аналогичный процесс происходит c последовательностью, кодирующей α-цепь только без D-сегмента. Рисунок с сайта Slideshare.

TCR и антиген-презентирующая клетка

Рисунок 3. Взаимодействие TCR и антиген-презентирующей клетки. а — Т-клетка (фиолетовая) взаимодействует с антиген-презентирующей клеткой (APC, синяя). б — APC презентирует антиген в составе MHC. Гетеродимер TCR состоит из α и β цепей, охватывающих MHC с антигеном. С антигеном главным образом взаимодействуют области CDR3 — это домены, отвечающие за специфичность TCR к данному антигену. Рисунок с сайта Genomemedicine.

После наступления пубертатного периода производство тимусом наивных Т-клеток резко снижается и на протяжении всей взрослой жизни человека активность этого органа остаётся на самом базальном уровне. Чем это грозит? Созданное за такой короткий период огромное разнообразие TCR действительно обеспечивает эффективный иммунный ответ на большинство потенциальных угроз. Но это разнообразие остаётся константным только некоторое время.

Мы теряем наших бойцов!

Общее разнообразие TCR определяется количеством редких клонов в пуле Т-клеток, поэтому отсутствие возрастных изменений в разнообразии наиболее многочисленных Т-клеточных клонов указывает на то, что клоны наивных Т-клеток теряются с возрастом. Это связано с тем, что клоны наивных Т-клеток обычно малочисленны, поэтому вероятность того, что ни одна клетка данного клона не сможет поделиться или погибнет в результате каких-то случайных событий гораздо выше, чем для клонов с большим числом клеток.

Старики с высоким разнообразием TCR

Исследователи [2] сравнивали Т-клеточные профили периферической крови людей из четырех возрастных групп. Удивительным оказалось то, что люди в возрасте 71–90 лет обладали большим разнообразием TCR и большим процентным содержанием наивных Т-клеток в пуле CD4 + , чем люди возрастной категории 61–66 лет. Возможным объяснением такого отклонения от линейной зависимости стало предположение о восстановлении утраченных функций тимуса вследствие прекращения выработки половых гормонов в пожилом возрасте. Считается, что наиболее заметный спад активности тимуса происходит во время пубертатного периода, когда организм резко начинает вырабатывать большие количества половых гормонов. Вероятно, это связано с перераспределением ресурсов: приоритет в этом возрасте отдаётся развитию половой системы, а процесс созревания наивных Т-клеток в тимусе довольно энергозатратен. Смысл столь ранней инволюции органа может заключаться и в том, что в юном возрасте тимус состоит из молодых тканей, в структуре которых ещё нет дефектов, повышающих вероятность проникновения чужеродных агентов внутрь органа и использование их клетками тимуса для презентации созревающим наивным Т-клеткам как собственных антигенов, экспрессируемых организмом [5].

Другое объяснение явления увеличения разнообразия TCR после 70 лет заключается в том, что люди этой возрастной группы уже перешагнули определённый возрастной порог, пройдя в некотором смысле проверку на прочность — уникальный набор физиологических параметров, включая особенности иммунной системы, сделал их наиболее приспособленными среди всех особей популяции в данных условиях. Из этого можно заключить, что повышенное содержание наивных Т-клеток в субпопуляции CD4 + периферической крови человека коррелирует с долгожительством. Увеличение доли наивных Т-клеток в пуле CD4+, а значит и увеличение разнообразия TCR обеспечивает лучшую иммунорегуляторную функцию, что снижает общее воспаление, усиливающееся по мере старения организма из-за активации аутоиммунных процессов, увеличивает эффективность распознавания раковых клеток и обеспечивает более сбалансированный иммунный ответ [2].

Долгая, но бездетная жизнь

Придворные китайские евнухи

Рисунок 4. Придворные евнухи в Китае. Некоторые евнухи жили более ста лет. Рисунок с сайта Lacasamundo.

Мальчик, которому сделают орхеэктомию (удаление яичек), может быть, и получит дополнительные 10–15 лет жизни, вместе с тем лишившись возможности иметь детей и получив набор других не совсем приятных последствий. Существуют менее радикальные решения, основанные на приёме определённых препаратов, способствующих восстановлению функции тимуса. Одно из таких веществ — грелин, этот гормон вырабатывается слизистой оболочкой желудка и вызывает чувство голода, действуя на центры гипоталамуса. Оказалось, что грелин участвует в Т-клеточном сигналлинге, способен снижать связанное с возрастными изменениями воспаление, способствует восстановлению структуры тимуса и стимуляции его функций. Ряд цитокинов и факторов роста (интерлейкины 7 и 22, фактор роста кератиноцитов) являются потенциальными кандидатами для решения проблемы восстановления функции тимуса у взрослых людей. Интерлейкины обеспечивают дифференцировку и выживание тимоцитов. Фактор роста кератиноцитов необходим для пролиферации и дифференцировки функциональных тканей тимуса, его использование вызывает пролиферацию тимоцитов и увеличивает размеры органа. Возможно также использование веществ, блокирующих выработку стероидных гормонов, таких как аналоги гонадотропин-релизинг гормона, например, люпрона. Люпрон действует на гипофиз, блокируя рецепторы к гонадотропин-релизинг гормону, из-за чего уменьшается выработка лютеинизирующего и фолликуло-стимулирующего гормонов, что ведёт к снижению продукции эстрогена и тестостерона. И всё же, все вышеперечисленные вещества имеют неоднозначное воздействие на организм, и пока ещё нет данных о долгосрочных последствиях их приёма, поэтому их назначают только в случае восстановления после химиотерапии или при ВИЧ-инфекции, когда стимуляция работы тимуса необходима для реконституции иммунной системы [1].

Хранение наивных Т-клеток — полезная инвестиция в будущее

Есть ли иной способ продлить мужскую жизнь? Авторов статьи [2] посетила смелая идея решения этой проблемы. Кроме того, что редко встречающиеся клоны наивных Т-клеток в результате случайных событий теряются с возрастом, они, как и все клетки организма, могут поделиться лишь ограниченное количество раз (примерно 50 — лимит Хейфлика), что обусловлено укорочением теломерных участков хромосом после каждой репликации ядерной ДНК, а делятся наивные Т-клетки раз в 1–2 года. Значит примерно к 70 годам основная часть Т-клеток выйдет из строя. Решение есть — можно запасать наивные Т-клетки! У молодых людей в возрасте до 15–20 лет, когда процессы формирования основного пула наивных Т-клеток уже заканчиваются, нужно брать образцы крови в таком объёме, чтобы количества наивных Т-клеток в них хватило для полного восстановления их пула уже в пожилом возрасте, и заморозить. Очень важно, чтобы забор произошёл именно в этот промежуток времени. Если брать кровь у более взрослых людей, количества циркулирующих наивных Т-клеток просто не хватит для полной реставрации их пула в будущем. Конечно же, такой подход будет эффективен и для женского пола. Эти образцы крови будут не только средством продления жизни, но ещё и подстраховкой в случае аутоиммунных заболеваний или рака, они помогут восстановить иммунную систему после химиотерапии. Создание подобных банков с замороженными образцами крови стало бы ключевым событием в становлении абсолютно новых подходов к лечению заболеваний иммунной системы. Например, СПИД можно было бы вылечить введением в здоровые размороженные Т-клетки заразившегося СПИДом мутации по гену мембранного рецептора CCR5 (CD195), люди с такой мутацией обладают природной резистентностью к ВИЧ [8], и их пересадкой больному, предварительно прошедшему курс химиотерапии.

Итоги

Как бы молодо не выглядел человек, параметры его иммунной системы будут объективно отражать возраст. Такие параметры как количество наивных Т-клеток и разнообразие TCR практически линейно снижаются по мере старения. Если вы являетесь счастливым обладателем повышенного разнообразия TCR, можете надеяться на несколько бонусных лет жизни. В будущем человечество ожидают новые дерзкие подходы к увеличению продолжительности жизни с использованием собственных наивных Т-лимфоцитов, собранных и замороженных много лет назад.


Новость

Комплекс-белок Cas9/sgRNA/viral RNA (слева) и модель вируса иммунодефицита человека (справа), построенная коллективом Visual science.

Автор
Редактор


Генеральным спонсором конкурса, согласно нашему краудфандингу, стал предприниматель Константин Синюшин, за что ему огромный человеческий респект!

Спонсор публикации этой статьи — Виктор Татарский.

Врага нужно знать в лицо

Об иммунитете, апоптозе и вообще.

Иммунная система развивалась сотни миллионов лет. По типу реакции ее обычно делят на врожденный (неспецифичный) и приобретенный (специфичный) иммунитет [1], [2]. Считается, что специфичный (то есть вырабатываемый к конкретному патогену) иммунитет впервые появился у челюстноротых (рыб и всех вышестоящих по эволюционному древу таксонов) после отделения от бесчелюстных (миног и миксин), хотя у вторых имеется аналогичная система защиты [3]. К клеткам специфичного иммунитета относят В-лимфоциты, Т-лимфоциты и NK-клетки (естественные киллеры, natural killer cells). Помимо этого существуют моноциты, которые хоть и не являются истинными инструментами приобретенного иммунитета, однако выполняют некоторые функции по нейтрализации патогена: фагоцитоз, презентация антигена, выделение бактерицидных веществ и цитокинов.

Взаимодействия Т-киллеров и Т-хелперов

Рисунок 1. Взаимодействия Т-киллеров (слева) и Т-хелперов (справа) с зараженными клетками. Для передачи сигнала о заражении необходимо выполнение двух условий: контакт комплекса МНС-патоген с TcR (T-cell Receptor, рецептор Т-клеток) и CD. Двигаясь по организму, Т-лимфоциты проверяют каждую клетку на предмет наличия у нее антигена в комплексе с МНС. Их можно сравнить с подслеповатой глуховатой бабушкой, пришедшей забирать дитятко из детского сада. Для опознания ей надо подойти вплотную и по нескольким (в данном случае по двум) признакам определить, ее ли это чадо или нет.

Т-лимфоциты, в свою очередь, необходимы для уничтожения клеток, зараженных внутриклеточными паразитами, и опухолевых клеток. Они делятся на два основных типа в зависимости от класса рецепторов, находящихся на внешней стороне их мембраны.

Т-киллеры несут CD8 рецепторы и отвечают за:

Т-хелперы имеют CD4 рецепторы и ответственны за секрецию цитокинов, которые:

  • активируют макрофаги для борьбы с внутриклеточными паразитами;
  • способствуют продукции антител В-лимфоцитами.

Но не менее важна роль Т-хелперов в подготовке зрелых Т-киллеров из клеток-предшественниц, активации NK-клеток и моноцитов.

Как же происходит опознавание антигена на молекулярном уровне? Здесь надо упомянуть еще об одном очень важном классе рецепторов — МНС (Major Histocompability Complex или главном комплексе гистосовместимости). Они бывают двух классов: I и II. МНС I присутствует на поверхности всех ядерных клеток организма человека. Он необходим для опознавания клетки натуральным киллером и Т-киллером (рис. 1, 2). Если по какой-то причине МНС I изменен, несет на себе антиген или отсутствует, клетка будет подвергнута апоптозу. МНС II находится на поверхности В-лимфоцитов, макрофагов и дендритных клеток. Он необходим для презентации антигена Т-хелперам (рис. 1, 2). Жизнь пула Т-хелперов можно представить как прогулку с ребенком в зоопарке, только вместо животных — антигены, вместо ребенка — Т-хелпер, а вместо взрослых, объясняющих, кто есть кто, — три перечисленных типа клеток.

Процесс передачи сигнала

Рисунок 2. Процесс передачи сигнала Т-киллеру и Т-хелперу. Первый этап — сборка комплекса МНС-антиген, второй этап — презентация комплекса на поверхности клетки.

Первый этап проникновения вируса в клетку — взаимодействие вирусного белка gp120 (рис. 3) с рецептором CD4. Отсюда понятно, почему ВИЧ размножается именно в Т-хелперах. Взаимодействию способствуют корецепторы CCR5 и CXCR4 [8]. В норме они являются рецепторами цитокинов, а при взаимодействии ВИЧ с клеткой их связь является необходимым условием проникновения вируса внутрь. Мутации в генах этих рецепторов обеспечивают частичную устойчивость носителей таких мутаций (таких людей около 2%, причем некоторые штаммы вируса все равно могут их поражать) [9]. Затем в мембрану клетки погружается белок gp41, после чего мембрана вируса сливается с клеточной, и происходит распаковка генетического материала. По принципу обратной транскрипции с РНК-матрицы вируса с помощью фермента ревертазы (обратной транскриптазы) синтезируются молекулы кДНК (комплементарной ДНК). Синтезированная кДНК вставляется вирусной интегразой в геном клетки хозяина. После попадания в геном хозяина вирус может никак себя не проявлять до нескольких лет — протекает так называемый инкубационный период. Только когда клетки активно пролиферируют, а значит, синтезируют белки на матрице ДНК, начинается сборка вирусных частиц , выход их из клеток и гибель последних (так как каждая частица забирает с собой часть клеточной мембраны клетки, вирусы попросту разрывают клетку).

Строение ВИЧ

Рисунок 3. Строение ВИЧ. Белки gp120 и gp41 участвуют в рецепции вируса клеткой и проникновении вирусной частицы внутрь. Липидная оболочка захватывается от клетки хозяина вместе с частью мембранных белков. Белки матрикса синтезируются в клетке после встраивания кДНК в геном в момент наработки клеточных белков для деления. Протеаза, возможно, необходима для разрезания противоапоптотического фактора Bcl-2 [9]. Ферменты обратная транскриптаза и интеграза создают кДНК на матрице РНК и встраивают кДНК в геном Т-хелпера соответственно. Tat — белок, вовлеченный в индукцию апоптоза. Нуклеокапсид — комплекс из РНК и белков вируса, представляющий собой компактную упакованную форму генома. Капсид — белковая оболочка, защищающая содержимое от воздействия внешних условий.

Как иммунитет бактерий правит геномы

Система редактирования геномов CRISPR/Cas известна уже довольно давно (впервые локус описал в 1987 году Есизуми Исино из университета Осаки), но только недавно (в 2005 году) ученые поняли ее истинное предназначение [11], [12].

Как вы уже поняли, система состоит из двух компонентов: CRISPR-локуса (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats или сгруппированные и регулярно разделенные короткие палиндромные повторы) и белков Cas, которые, являются нуклеотид-специфичными эндонуклеазами (а название получили за работу в команде с CRISPR — Crispr associated).

Помимо CRISPR-локуса и блока генов Cas в ДНК бактерии (не обязательно в нуклеоиде [12]) находится ген tracrРНК (transactivated crispr RNA), частично комплементарной палиндромам.

Для формирования специфичной устойчивости к вирусу бактерия, как и человек, должна встретиться с ним дважды.

Первый раз после внедрения вирусной ДНК в клетку происходит разрезание ДНК белками Cas1 и Cas2 на протоспейсеры и встраивание их в начало CRISPR-локуса. Cas1 и Cas2 формируют при этом комплекс, причем Cas2 играет только структурную роль, удерживая ДНК, тогда как Cas1 встраивает ее. Каждый протоспейсер вставляется в CRISPR-локус так, чтобы от другого (уже имеющегося) спейсера его отделял палиндром.

Соответственно, после транскрипции ДНК всего комплекса образуются три продукта (рис. 4):

  • tracrРНК;
  • РНК белка Cas (наиболее изученным является Cas9, поэтому далее повествование пойдет о нем), далее транслирующаяся;
  • pre-crРНК (poly-spacer precursor crRNA или многоспейсерный предшественник crРНК), которая представляет собой транскрипт спейсеров, разделенных образовавшимися из палиндромов шпильками или петлями.

Строение CRISPR-локуса

Рисунок 4. Строение CRISPR-локуса и результат транскрипции. leader — лидерная последовательность, отвечающая за начало транскрипции, со стороны которой вставляется новый спейсер. repeat — палиндромный повтор, который после транскрипции превращается в шпильку или петлю.

Второй этап — образование комплекса pre-crРНК/Cas9/РНКаза III. Очевидно, что вся длинная pre-crРНК не может участвовать в опознавании инвазивной ДНК, так как, во-первых, очень длинна, что конформационно неудобно, а во-вторых, при сравнении спейсеров РНК с протоспейсерами инвазивной ДНК длинный транскрипт начнет путаться и в итоге образует клубок, непригодный для дальнейшей работы. Самое логичное — разделить длинную последовательность на короткие участки, которые могли бы проверятся на соответствие инвазивной ДНК белком Cas9. И тащить за собой не надо, и не запутается.

С помощью фермента РНКазы III и при участии tracrРНК pre-crРНК разделяется по границам повторов так, что в белково-нуклеиновый комплекс входят один спейсер и один повтор, комплементарно связанный с tracrРНК (рис. 5) [13]. Повтор полностью теряет свою вторичную структуру, tracrРНК же оставляет несколько шпилек (обычно три).

Белково-нуклеиновый комплекс

Рисунок 5. Белково-нуклеиновый комплекс после созревания транскрипта. crРНК состоит из спейсера (слева) и повтора, соединенного с частью tracrРНК (справа). Три петли на tracrРНК нужны для удержания ее эндонуклеазой Cas9.

  • комплементарность спейсера комплекса Cas9/crРНК/tracrРНК протоспейсеру инвазивной (например, вирусной) ДНК;
  • наличие в геноме вируса около протоспейсера последовательности из трех нуклеотидов — РАМ (Protospacer Adjacent Motif, прилежащий к протоспейсеру мотив).

Таким образом клетка страхуется от уничтожения своей ДНК. Но даже просто разрезанная в одном месте вирусная ДНК может представлять опасность, поэтому завершает инактивацию негомологическое сращивание концов (non-homologous end joining, NHEJ). При этом происходит инсерция/делеция одного или нескольких нуклеотидов, что приводит к потере инфекционности.

Механизм работы CRISPR/Cas9

Рисунок 6. Полная схема механизма работы CRISPR/Cas9 системы. а — Транскрипция CRISPR локуса с образованием pre-crРНК. б, в — Разрезание РНК РНКазой III и образование комплексов Cas9/tracrРНК/crРНК. г — Вторичное проникновение в клетку чужеродной ДНК. д — Соединение комплекса с инвазивной ДНК. е — Образование двухнитевого разрыва в протоспейсере.

А где же тут редактирование геномов? А вот где:

  • во-первых, таким образом можно просто нокаутировать целевой ген и добиться прекращения экспрессии того или иного белка;
  • во-вторых, после создания двухцепочечного разрыва в образовавшуюся брешь можно вставить нужный нам ген и заставить организм синтезировать нужный нам белок.

Систем CRISPR/Cas9

Рисунок 7. Сравнение искусственной (а) и естественной (б) систем CRISPR/Cas9. Отличие состоит лишь в том, что искусственная РНК едина, а природная — состоит из двух частей, гены которых разделены.

Битва века

Однако вернемся к теме этой статьи.

Так как система редактирования геномов может помочь в избавлении от ВИЧ? Очень просто: вирус можно вырезать! Нацелив Cas9, путем создания sgРНК с последовательностью, комплементарной вирусной кДНК.

Некоторое время назад группа ученых из немецкого Института экспериментальной вирусологии и иммунологии уже пыталась использовать инструмент редактирования геномов для удаления ВИЧ из культуры HeLa [15]. Они модифицировали Cre-рекомбиназу методом направленной эволюции и один из полученных вариантов использовали для удаления вируса путем контролируемой рекомбинации [16]. Однако надо учитывать, что между Т-хелперами и опухолевой HeLa есть немало различий, к тому же, авторы не предлагают вариантов доставки или экспрессии гена Tre-рекомбиназы (усовершенствованный вариант фермента Cre).

С другой стороны, группа американских исследователей опубликовала в марте этого года статью [17], где подробно описывались метод доставки и механизм удаления вируса. Ученые ставили перед собой задачу не только полностью избавить клеточную культуру Т-хелперов от вируса, но и проверить отсутствие цитотоксического действия самой CRISPR/Cas9 системы. Единственный недостаток этого геномного инструмента в том, что из-за сравнительно небольшой длины спейсера, даже при наличии страхующего элемента PAM, в больших геномах могут быть найдены нецелевые сайты, подверженные разрезанию (off-target sites). Именно поэтому исследователи уделяли данной проблеме немало внимания.

Работа проводилась с использованием штамма ВИЧ-1 и клеточной линии Т-хелперов 2D10, зараженной вирусом в покоящейся стадии. Доставка и экспрессия sgРНК/Cas9 осуществлялась с помощью лентивирусного вектора.

Для оценки того, вырезался ли вирус из двух мест встраивания (1-я и 16-я хромосомы), было проведено полногеномное секвенирование. Оно показало, что в клетках, где экспрессировались и гены Cas9, и sgРНК, провирусная ДНК отсутствует.

Был проведен анализ того, могут ли гены, куда встроился провирус (RSBN1 и MSRB1), и близлежащие гены нормально транскрибироваться после его вырезания. Ученые показали, что как RSBN1, так и MSRB1 нормально экспрессируются. Соседние гены также не претерпели изменений.

С помощью биоинформатических методов и анализа баз данных было показано, что sgРНК/Cas9 не проявляет активности по отношению к нецелевым сайтам.

Таким образом, можно с уверенностью сказать, что группа Камински впервые успешно удалила ВИЧ из культуры зараженных Т-хелперов. Данное достижение приблизило человечество к победе на ВИЧ. Да, это только культура клеток. Да, до внедрения данной техники в медицину пройдут годы, а может и десятки лет, но данная работа является уникальной в своем роде, ибо ученые не только бросили вызов одному из страшнейших заболеваний на планете, но и смогли победить его — пусть даже масштаб сражения пока невелик.

Перспективы применения данной технологии очевидны: введя пациенту вектор, содержащий гены Cas9 и sgРНК, мы добьемся их экспрессии и полного удаления вируса из клеток. Современная терапия, направленная против ретровирусов, являющаяся основным средством борьбы с ВИЧ, не удаляет вирус из клеток, так как провирус остается встроенным в ДНК хозяина. В свою очередь, данный подход не оставляет вирусу шансов укрыться.


Обзор

Распространенность СПИДа в мире на 2009 год.

Автор
Редакторы


Спонсор конкурса — дальновидная компания Thermo Fisher Scientific. Спонсор приза зрительских симпатий — фирма Helicon.

Иммунная система


Рисунок 1. Упрощенная схема иммунного ответа. Молниями указано, как один тип клеток активирует другие. Мф — макрофаг, Б — бактерия, ТХ — Т-хелпер, ВКл — B-клетка, ПлКл — плазматическая клетка, Ат — антитела, Б+Ат — бактерия, покрытая антителами, привлекающими макрофагов, В — вирус, ЗМф — зараженный макрофаг, ТК — Т-киллер, ЗК — клетка, зараженная вирусом, УК — умирающая (апоптотирующая) клетка, В+Ат — вирус, покрытый антителами.

рисунок автора статьи

Жизненный цикл ВИЧ

Видео. Жизненный цикл ВИЧ.


Таким образом, после того как копия вируса в геноме клетки начинает действовать, на её поверхности появляются знакомые нам белки gp41 и gp120, в цитоплазме — остальные вирусные белки и вирусная РНК. И через некоторое время от зараженной клетки начинают отпочковываться всё новые и новые копии ВИЧ.

Способы уничтожения иммунной системы

При отпочковывании вирус использует клеточную мембрану клетки, и со временем это должно вызвать ее разрушение. К тому же, вирусный белок Vpu вызывает увеличение проницаемости мембраны клетки [6]. При активации вируса в клетке появляется неинтегрированная в геном двуцепочечная ДНК [19], наличие которой может рассматриваться клеткой как повреждение ее генетического материала и индуцировать ее смерть через апоптоз (С точки зрения организма такая клетка потенциально может стать раковой). Помимо этого, вирусные белки напрямую нарушают баланс про- и противоапоптотических белков в клетке. К примеру, вирусная протеаза p10 может разрезать противоапоптотический фактор Bcl-2. Белки Nef [26], Env [22] и Tat [24] вовлечены в возрастание количества клеточных белков CD95 и FasL, служащих индукторами апоптоза по т.н. Fas-опосредованному пути. Белок Tat положительно регулирует каспазу 8 [2] — ключевой фактор индукции апоптоза.

Если же клетки не погибли сами, они активно уничтожаются Т-киллерами. (Это стандартный ответ иммунитета на заражение любыми вирусами.)

Помимо этого, при производстве gp120 и Tat часть их выбрасывается зараженной клеткой в кровоток, а это оказывает токсическое действие на организм [4], [28]. gp120 оседает на все СD4 + -клетки (в том числе и здоровые), что имеет три последствия:

  1. Белок СD4 важен для взаимодействия Т-хелпера с фагоцитом, при слипании же СD4 с gp120 T-хелпер перестает выполнять эту функцию.
  2. На gp120 как на чужеродный белок образуются антитела; после оседания gp120 на здоровые клетки, последние маркируются антителами, и иммунная система их уничтожает [9].
  3. После обильного связывания Т-хелпером gp120 клетка умирает сама. Дело в том, что CD4 — это корецептор. Он усиливает сигнал от TCR (T-cell receptor) — главного белка, позволяющего выполнять Т-клеткам функцию иммунитета. В норме эти рецепторы активируются вместе. Если же активируется один тип рецепторов, но не активируется другой, это является сигналом, что что-то пошло не так, и клетка умирает посредством апоптоза.

Антитела, призванные препятствовать инфекции, в случае с ВИЧ часто, наоборот, ее усиливают [28]. Почему так происходит — не совсем понятно. Одну причину мы рассмотрели выше. Возможно, дело в том, что антитела сшивают несколько вирусных частиц вместе, и в клетку попадает не один, а сразу много вирусов. Помимо этого, антитела активируют клетки иммунитета, а в активированной клетке вирусные белки синтезируются быстрее.

Вдобавок, gp120 и gp41 имеют участки, похожие на участки некоторых белков, участвующих в иммунитете (например, MHC-II [25], IgG [23], компонент системы комплемента Clq-A [14]). В результате на эти участки образуются антитела, способные помимо вируса маркировать совершенно здоровые клетки (если на них будут эти белки), с соответствующими для них последствиями.

Так как на поверхности зараженной клетки появляется gp120, то она, как и вирусная частица, будет сливаться с другими СD4-содержащими клетками, образуя огромную многоядерную клетку (синцитий), неспособную выполнять какие-либо функции и обреченную на смерть.

На самом деле, помимо Т-хелперов, СD4 содержатся во множестве других клеток — предшественниках Т-киллеров/Т-хелперов, дендритных клетках, макрофагах/моноцитах, эозинофилах, микроглии (последние четыре — разновидности фагоцитов), нейронах (!), мегакариоцитах, астроцитах, олигодендроцитах (последние две — клетки, питающие нейроны), клетках поперечно-полосатых мышц и хорионаллантоиса (присутствует в плаценте) [29]. Все эти клетки способны заражаться ВИЧ, но сильно токсичен он лишь для Т-хелперов. Это и определяет основное клиническое проявление СПИДа — сильное снижение количества Т-хелперов в крови. Однако для других клеток заражение тоже не проходит бесследно — у больных СПИДом часто снижена свертываемость крови, имеются неврологические и психиатрические отклонения [16], наблюдается общая слабость.

Пути заражения ВИЧ

Внимание! Ввиду того, что СПИД является венерическим заболеванием, информация, приведенная в этом разделе, может вас оскорбить либо вызвать неприятные эмоции при прочтении. Будьте осторожны.


Рисунок 3. Пути проникновения ВИЧ в организм при половом контакте. Слева указано примерные временные рамки каждого этапа.

Как же происходит первичное заражение человека ВИЧ? Думаю, что с переливанием крови или с использованием общего шприца при употреблении наркотиков читателю все понятно — вирус доставляется напрямую из зараженной крови в здоровую. При вертикальном способе передачи инфекции (от матери к ребенку) заражение может произойти во время внутриутробного развития, в момент родов или в период кормления ребенка грудью (т.к. вирус и зараженные вирусом клетки содержатся в молоке матери) [17], [20]. Тем не менее, даже у ребенка, рожденного от ВИЧ-инфицированной матери, есть шанс остаться здоровым, особенно если мать использует ВААРТ (высокоактивную антиретровирусную терапию) [5]. А почему же люди заражаются при половом контакте?

Механизмы передачи вируса при половом акте не до конца ясны. Тем не менее, они понятны в общих чертах. Итак, рассмотрим барьеры, которые необходимо преодолеть вирусу, чтобы добраться до макрофагов и Т-хелперов. К сожалению, рассматривать особо нечего: барьер только один — это слой эпителиальных клеток и вырабатываемая ими слизь, находящиеся во влагалище (а также пенисе, прямой кишке, глотке). Барьер этот тонок — он может быть всего одну клетку в толщину, — но для вируса труднопреодолим, доказательством чего может служить сравнительно небольшой процент заражений — примерно 1–2 случая на 100 половых контактов. Итак, и какими же путями преодолевает вирус это препятствие?

Наиболее очевидный механизм — это микротравмы. При обычном половом контакте, а особенно при анальном сексе, почти неизбежно появляются микротрещины; при наличии же венерических заболеваний часто возникают изъязвления слизистой. Через эти микротравмы вирус, содержащийся в сперме и влагалищном секрете, может проникнуть к иммунокомпетентным клеткам [17], [20].

Помимо дендритных клеток, в кишечнике существует другой тип клеток, предназначенный для ознакомления организма с антигенами внешней среды. Это так называемые М-клетки, пропускающие через себя довольно крупные объекты неповрежденными из просвета кишечника. В т.ч. через них может проходить и вирион ВИЧ.

Свой вклад в заражение вносит и провоспалительный процесс, в норме присутствующий в женских половых путях из-за наличия в них спермы. Благодаря ему Т-клетки подвержены активации, что способствует их восприимчивости к инфекции.

Итак, риск заразиться ВИЧ возрастает в ряду (Классический секс → Анальный секс → переливание крови / использование общих шприцов при принятии наркотиков). Что же касается орального секса, то весьма небольшой шанс заразиться есть только у принимающей стороны — слюна и тем более желудочный сок инактивирует ВИЧ. Теоретически, этим способом может заразиться и мужчина, но для этого необходимы ранки на пенисе.

При поцелуях и обычных бытовых контактах вирус не передается — он очень неустойчив в окружающей среде .

Заключение


. Все эти факты позволяют надеяться, что вскоре ВИЧ, как и оспа, останется в прошлом.

ВИЧ разрушает CD4-Т-лимфоциты (Т-хелперы), поэтому врачи измеряют уровень CD4 для мониторинга прогрессирования ВИЧ и СПИДа.

Вспомогательные Т-клетки имеют решающее значение для функционирования иммунной системы и активируются после столкновения с антигенами болезнетворных микроорганизмов. Антигены — это биологические маркеры, которые идентифицируют микроорганизмы, такие как бактерии и вирусы.

Когда количество CD4 падает ниже определенного уровня, человеку ставят диагноз СПИДа. Лечение, предлагаемое врачом, зависит от того, насколько низок уровень CD4.

Что такое Т-клетки?

Т-клетки растут из стволовых клеток костного мозга. Они представляют собой тип белых кровяных телец. Существует два основных типа Т-клеток: Т-хелперы и Т-киллеры. В конечном счете, именно Т-киллеры атакуют и убивают клетки, инфицированные патогенами.

Т-хелперы

Макрофаги — это еще один тип белых кровяных телец. Они поглощают болезнетворные микроорганизмы или патогены, а затем представляют фрагменты своих антигенов Т-хелперам. Когда Т-хелперы связываются с фрагментом антигена, который они распознают, они активируют и предупреждают другие белые кровяные клетки о патогене.

Т-хелперы имеют на своей клеточной поверхности белки CD4, которые помогают им связываться с фрагментами антигена. Поскольку ВИЧ разрушает Т-хелперы, медицинские работники используют подсчет CD4 для измерения уровня CD4 и прогрессирования ВИЧ.

Т-киллеры

После получения предупреждения Т-киллеры ищут и уничтожают патоген (вирус, бактерии или болезнетворные микроорганизмы). Другие лейкоциты, такие как В-лимфоциты, также активируются и вырабатывают антитела для защиты от угрозы.

Как Т-клетки связаны с ВИЧ и СПИДом?

ВИЧ вводит свою генетическую информацию в Т-хелперы, чтобы сделать копии самого себя. Когда это происходит, Т-хелперы погибают. Это серьезно нарушает иммунный ответ. Низкий уровень Т-хелперов означает, что Т-киллеры и другие лейкоциты не получают столько информации о патогенах в организме. В результате болезнетворные бактерии и вирусы размножаются с минимальным обнаружением.

Когда количество Т-хелперов падает ниже 200 клеток/мм3 (клеток на кубический миллиметр), человеку ставят диагноз СПИД. Но врачи также будут принимать во внимание другие показатели, такие как общее количество лейкоцитов и процент лимфоцитов.

СПИД — это тяжелая стадия ВИЧ. Когда человеку ставят диагноз СПИД, значит его иммунная система сильно ослаблена, и он подвержен риску развития оппортунистических заболеваний. Выживаемость без лечения на этом этапе обычно составляет 3 года.

Отличаются ли Т-клетки CD4 от других Т-клеток?

Т-клетки CD4 являются Т-хелперами. Они экспрессируют или вырабатывают белок CD4 на своей клеточной поверхности, который помогает им связываться с фрагментами антигена. Эти фрагменты антигена принадлежат вирусам, бактериям и другим микроорганизмам, которые могут угрожать здоровью человека. Т-киллеры экспрессируют белок CD8 на своей клеточной поверхности.

При активации Т-хелперы мобилизуют другие лейкоциты, чтобы инициировать полный иммунный ответ. Например, Т-киллеры затем ищут патоген и уничтожают его, высвобождая гранзимы, которые вызывают гибель клеток-источников.

Использование показателя — количество Т-клеток — для диагностики СПИДа

Если у человека Т-хелперов ниже 200 клеток/мм3 , ему скорее всего поставят диагноз СПИДа.

При ВИЧ у пациента берут образец крови, чтобы определить количество CD4. Количество CD4 помогает установить, сколько Т-хелперов у человека. Но при анализе количества CD4 медицинские работники должны учитывать, что:

  • уровень CD4 может быть ниже утром
  • стресс и усталость могут повлиять на уровень CD4
  • уровень кортикостероидов может увеличить или уменьшить уровень CD4

Все люди, у которых количество Т-хелперов ниже 200 клеток/мм3, должны проверять уровень CD4 каждые 3-6 месяцев. Если лечение помогает, пациенту может потребоваться только обследование на CD4 каждые 6-12 месяцев. Подсчет CD4 помогает врачам отслеживать прогрессирование ВИЧ.

Каковы побочные эффекты подсчета Т-лимфоцитов?

Побочные эффекты забора крови могут включать :

  • легкая боль
  • головокружение
  • чувство слабости

Медицинскому работнику потребуется взять только небольшое количество крови, поэтому человек не должен испытывать каких-либо значительных побочных эффектов.

Методы лечения после подсчета Т-клеток

Обычно, когда ставят диагноз ВИЧ, начинают антиретровирусную терапию (АРТ) как можно скорее .

Если человек хорошо реагирует на АРТ, его уровень CD4 может увеличиться на 100-150 клеток/мм3 через 1 год.

Проанализировав количество CD4, врач может определить, работает ли текущий план лечения или необходимо ввести дополнительные методы лечения. Как только уровень CD4 падает ниже 200 клеток/мм3, врач может порекомендовать увеличить АРТ и ввести другие препараты, чтобы укрепить иммунную систему против оппортунистических заболеваний.

Все люди с ВИЧ должны проводить подсчет CD4 каждые 3-6 месяцев, если их уровень CD4 ниже 200 клеток/мм3, так как это указывает на прогрессирование заболевания. Если лечение работает и количество CD4 стабильно, человеку может потребоваться обследование только каждые 6-12 месяцев.

Прогноз

Если человеку вовремя ставят диагноз ВИЧ и быстро начинают АРТ, маловероятно, что его состояние будет прогрессировать до СПИДа. Прием АРТ не только поддерживает высокий объем Т-хелперов, но и снижает вирусную нагрузку (количество вируса в организме).

Если у человека снижается вирусная нагрузка, то вирусы могут не обнаруживаться. Это означает, что если человек продолжает лечение своего состояния, вирус не может передаваться. Наличие неопределяемой вирусной нагрузки также снижает передачу ВИЧ во время родов.

Заключение

Врач запрашивает количество CD4 для мониторинга уровня Т-хелперов. Когда уровень CD4 у человека падает ниже 200 клеток/мм3, то ставят диагноз СПИД. Если человек начинает АРТ сразу после постановки диагноза ВИЧ, его состояние может никогда не прогрессировать до СПИДа.

Т-клетки включают два основных типа: Т-хелперы и Т-киллеры. Т-киллеры экспрессируют на своей клеточной поверхности белок CD4, который помогает им связываться с фрагментами антигена. Эти фрагменты антигена принадлежат болезнетворным вирусам и бактериям. После связывания Т-хелперы сигнализируют другим лейкоцитам уничтожить патоген. Т-киллеры — это еще один тип Т-клеток, которые разрушают патогены, высвобождая гранзимы, которые вызывают гибель клеток.



Учредитель сетевого издания (Medical Insider), главный редактор, автор статей.

Врач ультразвуковой диагностики в СЗЦДМ, травматолог-ортопед, г. Санкт-Петербург

Читайте также: